מדידות אלקטרו ממערכת עש חוש הריח

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדגים את קלות ההקלטה של תגובות חושית ריח ממערכת העצבים של חרק. דבר זה מושג על ידי קיבוע עש מוחי חי וחיבור אלקטרודות למשש או לנוירון בודד כדי להקליט תגובות המושרות על ידי חומרי ריח. כשלב ראשון, אלקטרודת זכוכית מלאה בתמיסת מלח מוחדרת לעין כדי לשמש כהארקה; כשלב שני, מוחדרת אלקטרודת זכוכית מלאה בתמיסת מלח לאחד העשים המקובעים, מה שמאפשר הקלטות של תגובות חשמליות בצורה של אנטנוגרמה (antenna gram) להקלטת תגובות של יחידה בודדת מנוירון קולטן ריח.

את אלקטרודת ההקלטה מחדירים לבסיס של קרן. לאחר מכן, אות האנטנה מוגבר ומוזן לממיר אנלוגי-דיגיטלי על מנת להקליט ולשמור את האותות. התוצאות המתקבלות מראות תגובות תלויות-מינון המושרות על ידי חומרי ריח, המבוססות על האות החשמלי המוקלט בצורת אות EAG או spike.

פיתחנו שיטה חדשה להקלטת Enterogram מעש רכישת-ההדר (Naval orange one) מקובע. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שההכנה נשמרת לאורך זמן, וניתן להשתמש באותו עש מספר פעמים כדי להקליט תגובות מרובות; כמו כן, ניתן להשתמש באותו עש כדי להקליט תגובות של יחידה בודדת (single unit) מחיישן בודד בממשש. אנו מתמקדים ב-Naval orange one מכיוון שהוא מהווה מטרת חקלאית חשובה בקליפורניה.

עם זאת, ניתן להשתמש בשיטה זו עבור חרקים אחרים מסוג epi dotter, לא רק כדי להתייחס לשאלות יסוד בתפקוד ישן, אלא גם לפיתוח חומרי משיכה חדשים. מחקר זה של מערכת הריח של העש משתמש ב-naval orange worm. Ullo Ella.

מושבת החרקים נשמרת על תזונה של סובין חיטה בתאי סביבה בטמפרטורה של כ-28 °C, בלחות יחСית של כ-75%, ותחת משטר תאורה של 16 שעות אור ו-8 שעות חושך. הכינו מכלים עבור עשים שזה עתה בקעו על ידי הנחת עד 10 שכבות של מגבות נייר ספוגות מים בתוך קופסת פלסטיק. אספו והבדילו בין הזכרים לנקבות של העשים הבוקעים מדי יום, והעבירו אותם לקופסת הפלסטיק. כסו את הקופסה במכסה מחורר כדי לאפשר זרימת אוויר, כהכנה להקלטות אלקטרופיזיולוגיות.

ראשית, הכינו מחזיק לעש על ידי חיתוך קצה של פיפטה של 200 microliter כך שקוטר הקצה יהיה כשני מילימטרים. עבור EAG או SSR, בחרו עש שנמצא שני עד ארבעה ימים לאחר הבקיעה. הכניסו את העש לפיפטה מהקצה הנגדי לקצה החתוך באמצעות קטע נייר סופג לח, ודחפו בעדינות את העש לכיוון קצה הפיפטה.

המשיכו לדחוף את העש עד שהמחושים וחלק מהראש בולטים מהקצה; קבעו את הראש החשוף על ידי כיסויוו בחימר שאינו מתייבש, תוך השארת חלק קטן של עין אחת ושני מחושים חשופים. הניחו את דגימת העש על הפלטפורמה של המיקרו-מניפולטור של האלקטרוגרמה בין שני מחזיקי האלקטרודות, תוך שימוש באלקטרודות זכוכית שקוטר קצותיהן קטן מ-1 micron. מלאו מחדש את האלקטרודות ב-centum limb ringer.

בעודכם מביטים דרך המיקרוסקופ, דקרו את האזור החשוף של העין באמצעות אלקטרודה אחת. זו תשמש כאלקטרודת הייחוס. השלב הבא הוא הצבת אלקטרודות הקלטה על המחושים.

המחוש של זכר העש naval orangeworm הוא רב-פלח, וכל פלח מעוטר במספר רב של מבנים דמויי שיער. ה-illa, התמונה המוקטנת היא מיקרוגרף מאלקטרון סורק המציג פרטים של ה-illa כדי להקל על ההקלטה מהמחושים. חתוך את אחד עד שניים מהפלחים הדיסטליים של המחוש.

בשלב הבא, הכנס את שתי האנטנות לתוך אלקטרודת ההקלטה. לחלופין, עבור הקלטות של sens בודד, הכנס את אלקטרודת ההקלטה לבסיס של sens. פוטנציאלי הפעולה מה-sens מוגברים על ידי קדם-מגבר בעל עכבה גבוהה ומוזנים לממיר דיגיטלי-אנלוגי חכם בחיבור USB לצורך ניתוח לא מקוון (offline) באמצעות תוכנת autos spike.

השלב הבא הוא להכין את הגירוי הכימי באמצעות ZZ 1113 HEXA deca Now, המהווה מרכיב עיקרי בתערובת הפרומונים של הנקבה של תולעת התפוז הנייבי (naval orange worm). יש לדלל את החומר הכימי בהקסאן כדי להכין דילולות DIC. טפטפו 10 µL של תמיסת הגירוי על נייר סינון watman. האוודה את הממס על ידי ניעור עדין למשך 10 שניות.

תחת מנדף, מקם את הפס בתוך מזרק פוליפרופילן של 5 ml; מזרק המכיל hexane בלבד ומזרק ריק משמשים כביקורות להכנה. EAG או SSR מוחזקים בזרם אוויר מלחח המסופק על ידי בקר הגירויים במהירות של 20 ml לשנייה. חבר את המזרק המכיל את הגירוי הכימי לבקר זרם האוויר.

הקליטו אותות חשמליים של קו בסיס למשך שתי שניות. לאחר מכן, הוסיפו פולס גירוי של ארבעה milliliters per second ל-Airstream למשך 500 milliseconds. המשיכו בהקלטת האותות החשמליים למשך שמונה שניות נוספות.

יש להמתין לפחות דקה אחת בין גירוי לגירוי. איור זה מציג תגובה חסונה התלויה במינון מהמחושים של עש זכר המוחזק במקומו. הגירוי בוצע באמצעות רכיב הפרומון של הנקבה, CZ 1113 hexaco.

התגובה להקסאן. בקרת הנשאי (vehicle control) מוצגת על ידי הקו הכחול באופן עקבי. מינונים גבוהים יותר של הפרומון יוצרים רישומי אלקטרוגרם גדולים יותר בהתאמה.

איור זה מציג הקלטות חוץ-תאיות של יחידה בודדת מ-trichandium בתגובה לגירוי מרכיב הפרומון הנקבי. הקלטות אלו מראות תגובה מעוררת התלויה במינון. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה תוך מספר שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת שימוש בשיטה זו, יש להקפיד למנוע זיהומים ולהשתמש בכימיקלים בדרגת טוהר גבוהה ככל האפשר.