Name: פיתוח התאמה אישית הסינית השחלות-מארח אוגר Cell חלבון מבחני באמצעות טכנולוגיה אקוסטית microparticle ממברנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: למדו לפתח ניסויים אימונולוגיים מותאמים אישית בפלטפורמת ViBE לזיהוי חלבוני תאי CHO בסיני האמסטר. השיטה מספקת תוצאות רגישות וברות-השגה עם זמן יד מועט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Microparticle הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל נוגדנים באמצעות ביוטין NHS לכימיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת מידת Biotinylation </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצומד streptavidin חרוזים עם נוגדן Biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים הבקבוקון המקורי על ידי vortexing במשך 1-2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot נפח הרצויה של חרוזים לתוך צינור microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים 3 פעמים עם PBST: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל את החרוזים על המגנט במשך 2 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant על ידי שאיפה עם הצינור על המגנט. היזהר שלא לשבש את החרוזים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא את הצינור מתוך המגנט ולהוסיף 1 מ"ל PBST </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס למשך 20 שניות כדי resuspend את החרוזים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה למשך 5 שניות כדי להסיר את החרוזים מן הכובע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור 2.3.1-2.3.5 עוד פעמיים </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המקום השלישי לשטוף בצינור על המגנט לשאוב PBST </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדן biotinylated על חרוזים resuspend </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך להביא את עוצמת הקול של הנוגדן biotinylated עד 300 μL עם PBS. אם נפח נוגדן כבר יותר מ 300 μL אין להוסיף כל PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על השעיית חרוז / נוגדנים במשך 30 דקות ב RT על שייקר מערבולת או rotator צינור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם PBST כמו בשלב 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק עם חרוזים BSA biotinylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף third להוסיף 10 מיקרוגרם / מ"ג biotinylated BSA, להתאים את עוצמת הקול כדי μL 300 עם PBS במידת הצורך, דגירה עם תסיסה במשך 30 דקות </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם PBST כמו בשלב 3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים μL 100 של BSA PBS/0.05%. אזיד הנתרן ניתן להוסיף לאחסון ארוך טווח </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים NHS והעמסת, fluoresceinate את הנוגדן גלאי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מידת Fluorescination </li></ol> 2. HCP - פיתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות עבודה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוגדנים והעמסת שכותרתו (FL-AB): רוב CHO-HCP מבחני להשתמש Fl-Ab בריכוז הסופי של 400 ng / mL. Fl-Ab יתווסף ¼ נפח assay הסופי, ולכן הריכוז של הפתרון עובד הוא 1.6 מיקרוגרם / מ"ל. הכן את הפתרון הזה על ידי דילול המניות flab עם BioScale ביד / flab diluent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים: רוב CHO-HCP מבחני להשתמש חרוזים בריכוז הסופי של 2x10 5 חרוזים / mL. מגיב חרוז מהווה ¼ נפח assay הסופי, ולכן הריכוז של הפתרון הוא לעבוד 8x10 5 חרוזים / mL. הכן את הפתרון הזה על ידי דילול המניות חרוז עם BioScale ביד / flab diluent. וורטקס המניות חרוז היטב כדי לוודא את כל החרוזים נמצאים ההשעיה לפני הסרת aliquot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת מאגר: הרכב למאגר פועל עשויה להיות מותאם במיוחד את הנוגדנים המשמשים לפתח את assay, אולם מספר CHO-HCP מבחני פותחו באמצעות 10 mM HEPES חיץ, 1% Tween, pH 7.5. BioScale פיתחה תוסף עבור למאגר פועל (מסופק עם ערכת פיתוח) אשר מתווסף למאגר ריכוז של 1% לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל הכיול דגימות עם diluent לדוגמה BioScale. </li></ol> 3. VIBE מערכת הגדרת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובבו את Workstation על VIBE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את אספקת מערכת ופסולת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש מערכת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחסנית VIBE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסלול הצינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תבנית assay על ידי מילוי דף שכותרתו "הגדרת דוגמה". BioScale מספק יכולת יש תבנית אחת assay assay עבור כל תחנת עבודה VIBE. זה מאפשר למשתמש לערוך ולשמור מציין ספציפית את גליון "הערות" של תבנית עבור מבחני שונות שמירה תיעוד מלא של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תבנית assay ראשוניים להגדיר: התחל על ידי מילוי טבלה (בפינה השמאלית העליונה) של טווח ריכוז של סטנדרטים assay של הגיליון "הגדרת דוגמה". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להזין מידע נוסף בטבלה בצד ימין של הסטנדרטים (Setup טור פשוט קרא, אחת הוסף מגיב ואת שני setups מגיב הוספה) להורות Workstation VIBE כמה דגימות ארוך צריך לדגור, כמה נפח הוא מגיב שיועברו , כמה זמן את הצטברות מדגם צריך להיות, והאם מיזוג חיישן טיהור של בדיקות דיו נחוצים, וכו ' </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצלחת הפריסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען מדגם / ריאגנטים לתוך הצלחות. VIBE יספק את הכרכים הדרושים צלחת מגיב. נפח לדוגמה יכול להשתנות, אבל במחצית של נפח assay סך של 120 μL היא מקום התחלה טובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מכסה צלחת. טען צלחות לסיפון תחנת עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את assay להתחיל את האשף, לעבור את האשף ולהתחיל assay. </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: immunoassay AMMP סנדוויץ בתחנת עבודה VIBE, assay AMMP אמצעים ריכוז אנטיגן. אותות נמדד כאשר נוגדן אנטיגן חרוז-hapten נקשר החיישן דרך hapten / אנטי hapten אינטראקציה. התחדשות מביא את החיישן בחזרה למצב ההתחלה ידי הסרת מתחמי החיסונית. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: CHO-HCP AMMP עקומת כיול Assay איור 2 לעיל הוא דוגמה של עקומת HCP CHO AMMP כיול Assay. ניתוח ניתן לבצע דגימות מכל רחבי הנחל לטיהור כולל הכור בדייקנות reproducibility גבוהה. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3: חלבון עקומת כיול AMMP Assay איור 3 הוא עקומת כיול של חלבון שיורית Assay AMMP, הופיע עם חלבון VIBE שיורית ערכת Assay. הערכה דומה ניתן להשתמש assay מהיר עם תקופת דגירה 30 דקות, או לתוצאות יותר רגיש טווח דינמי רחב יותר עם תקופת דגירה זמן רב יותר ללא איבוד של דיוק או דיוק, אשר שניהם הם בדרך כלל טוב יותר מאשר המקבילה ELISA של משתמשים רשומים " ידיים <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4: מוצר titer AMMP Assay Workstation VIBE יכול לשמש גם עבור assay מוצר titer, התוצאות שמוצג בתרשים 4. בביצוע שונה מאשר מבחני AMMP אחרים, assay זה אינו מחייב טיפול מדגם אחר מאשר דילול פשוט, או חרוזים quantitation אומת ב "שום ספין" דגימות המכיל מעל 10 מיליון תאים על פני מגוון רחב של viabilities. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5: סטנדרטי AMMP Assay עקומת עבור assay GST-Gadd34 סמן ביולוגי שמוצג באיור 5 היא עקומת תקן של האות המתקבל על ידי BioAnalyzer VIBE (לוח א ') או באמצעות טכנולוגיה AlphaScreen רקומביננטי GST-Gadd34. תוצאות בפלטפורמת VIBE היו כ יומן רגיש יותר באמצעות נוגדנים אותו. AMMP ממנף את המדידה של חלקיקים גדולים יותר פחות, אך עדיין נהנית ללכוד פתרון שלב ומורכב היווצרות זיהוי. <img src="/files/ftp_upload/2493/2493fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6: עקומת AMMP Assay תקן GST-Gadd34 במדגם הגידול באיור 6, אינדוקציה של Gadd34 מ CWR22 xenografts נבדק נוכחות או היעדר של מעכבי פרוטאזום boronate כמו מנותח על ידי אחד BioAnalyzer VIBE (לוח א ') או AlphaScreen (לוח ב'). הפלטפורמה VIBE היה מסוגל לייצר רגיש, תוצאות לשעתקו ב xenografts הגידול vivo ואילו האות AlphaScreen היה הרווה עם מיקרוגרם מוגברת של חלבון. דוגמה זו מראה את הכוח של הטכנולוגיה AMMP בדגימות מורכבות ביותר. בשל שבב זיהוי רגיש יעילות גבוהה של המגנט ליד הצ'יפס, המספרים הנמוכים של microparticles מגנטי יכול ביעילות reproducibly לחפש עבור מטרה שפע נמוך בתוך המורכבות של lysed הסלולר (כולל ריאגנטים תמוגה) ופסולת דם.

המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי Bioscale, Inc המייצרת כמה מכשירים ריאגנטים שימוש במאמר זה.

הדוגמאות לעיל להפגין רגישות גבוהה של AMMP תוצאות כמותיות בדגימות מורכבות. זה ביצועים, כאשר נמסר בקלות ובקרה של עיצוב ריאגנטים לתוך המערכת מאפשרת עבור מגוון של יישומים. יישומים אלה עשויים להיות מטרה ספציפית, כמו Gadd34 בגידול, או גנרי למגוון מטרות, כמו זיהוי התא המארח quantitation חלבון בדגימות כי לחצות את הנחל טיהור. תקורה נמוכה VIBE פלטפורמה בשילוב עם AMMP גמישה מספק כלי רב עוצמה להעברת מבחני קריטי.

<table><tbody><tr><td>ערכת סימון NHS-Chromogenic-biotin או ערכת סימון NHS-Chromogenic Biotin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אם NHS-Chromogenic-biotin נרכש כריאגנט, יהיהו דרושים החומרים הנוספים הבאים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ממס אורגני המסיס במים, כגון דימתילסולפוקסיד (DMSO) או דימתילפורממיד (DMF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סלקסן פוספט גבורי (PBS) או בופר אחר נטול אמינים (pH 7 &amp;#8211; 9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמודי הסרת מלחים או יחידות דיאליזה להחלפת בופר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר המסוגל למדוד באורכי גל של 354 ו-280 ננומטר (nm) &amp;#8211; למדידת ריכוזי חלבון וביוטין</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן מביוטין (2-5 ביוטינים/נוגדן)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חרוזי מגנט עם סטרפטאווידין</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>(10 מ"ג/מ"ל) ~10&lt;sup&gt;8&lt;/sup&gt; חרוצים/מ"ג</td></tr><tr><td>מגנט לפעולות במיקרוצנטריפוגה (Microcentrifuge tubes)</td><td>New England Biolabs</td><td>מס' קטלוג S1510S</td><td></td></tr><tr><td>BSA ביוטינילי עבור חסימה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סריגל פוספט מאוזן (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS עם 0.1% Tween 20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערבוב במערבל Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתאם למבובות מיקרוצנטריפוגה עבור וורטקס או מסובב מבחנות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן או חלבון לסימון</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת סימון NHS-Fluorescein או NHS-Fluorescein</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אם NHS-Fluorescein נרכש כריאגנט, יספקו החומרים הנוספים הבאים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ממס אורגני ממיס במים, כגון דימתילסולפוקסיד (DMSO) או דימתילפורממיד (DMF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בוראט 50 mM, pH 8.5 או בופר אחר ללא אמינים (pH 7 &amp;#8211; 9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>עמודי הסלחה או יחידות דיאליזה להחלפת בופר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדידה של ריכוזי חלבון ופלואורסצאין דורשת ספקטרופוטומטר המסוגל למדוד באורכי גל של 493 ו-280 ננומטר (nm).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדל</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>לדילול חרוזי הפלואורסצנציה ו-FlAb</td></tr><tr><td>מדל דגימה</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td>לדילול דגימות וכילי-כיול</td></tr><tr><td>תוסף לתמיסת ריצה</td><td><a href="http://www.bioscale.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BioScale</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פיתוח התאמה אישית הסינית השחלות-מארח אוגר cell חלבון מבחני באמצעות טכנולוגיה אקוסטית microparticle ממברנה

Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

מבחני התאמה אישית של חלבונים ייחודיים מוגבלים לעיתים קרובות בזיהוי זמן רב ידני וטכניקות quantitation כגון ELISA או כתמים המערבי בשל המורכבות של פיתוח על גבי פלטפורמות חלופיות. ממברנה אקוסטית הקניינית של BioScale microparticle (AMMP) הטכנולוגיה מאפשרת immunoassays כריך להתפתח בקלות לשימוש בפלטפורמת VIBE, מתן רגישות יותר, שחזור, והפעלה אוטומטית. בתנאי כדוגמה, פרוטוקול זה מתאר את הליך לפיתוח אוגר מנהג סינית השחלות-Cell Host חלבון (CHO-HCP) assay. העקרונות הכלליים שהותוו כאן ניתן בעקבות לפיתוח מגוון רחב של immunoassays. Assay מודד AMMP אנטיגן ריכוז ידי מדידת השינויים בתדירות תנודה הנגרמת על ידי קשירה של microparticles אל פני השטח את חיישן לחשב. היא מורכבת מארבעה מרכיבים עיקריים: (1) מחסנית המכילה שבב פונקציונליות eight חיישן (2) שכותרתו נוגדן microparticles מגנטי, (3) נוגדנים hapten מתויג שקושר אל פני השטח של שבב פונקציונליות (4) דגימות המכיל את האנטיגן של עניין. Biosensor של BioScale הוא מכשיר התהודה זה מכיל שמונה ממברנות הפרט עם fluidic נתיבים נפרדים. ממברנות שינוי תדר תנודה בתגובה צבירת מסה על פני השטח, וזה שינוי תדר משמש לכמת את כמות המסה הוסיף. כדי להקל על השימוש במגוון רחב של immunoassays החיישן פונקציונליות עם נוגדן אנטי hapten. נוגדנים ספציפיים Assay משתנים דרך נטיה קוולנטיים של תג hapten על נוגדן אחד ביוטין השני. התווית ביוטין משמש כדי לאגד את הנוגדן streptavidin בשילוב חרוזים מגנטיים, אשר בשילוב עם נוגדנים hapten-מתויג, משמשים כדי ללכוד את אנליטי בתוך כריך. הקומפלקס נקשר השבב דרך האינטראקציה anti-hapten/hapten. בסוף כל assay להפעיל את החיישנים מנקים עם חומצה לדלל המאפשר ניתוח רציף של עמודים מתוך צלחת 96-היטב. כאן, אנו מציגים את השיטה לפיתוח assay אישית CHO-HCP AMMP לפיתוח Bioprocess. פיתוח מבחני AMMP או שינוי מבחני הקיימים מבחני AMMP יכול לספק ביצועים טובים יותר (, רגישות reproducibility) בדגימות מורכבות הזמן מפעיל מופחת. פרוטוקול מראה את הצעדים לפיתוח בסעיף דיון ביקורות תוצאות נציג. לקבלת הסבר מעמיק יותר של אופטימיזציה assay ופרמטרים התאמה אישית מגע BioScale. ערכה זו מציעה הגנרית מבחני Bioprocess פיתוח כגון חלבון שיורית titer, מוצר, ואת CHO-HCP.

הפיתוח של מבחני אישית על פלטפורמה VIBE עבור רגישים יותר, תוצאות לשעתקו אוטומטיות מטריצות מורכבות מתואר. מחסנית האוניברסלי מאפשר מבחני להיות מותאם בקלות לשימוש עם מבחני אישית. גמישות זו מאפשרת אימות פיתוח מהיר של מבחני רומן או בגרסאות אוטומטיות של מבחני ידנית הקיימת, מדגים בסרטון הזה.

פיתוח התאמה אישית הסינית השחלות-מארח אוגר Cell חלבון מבחני באמצעות טכנולוגיה אקוסטית microparticle ממברנה

בדיקות מותאמות אישית לחלבונים ייחודיים מוגבלות לרוב לטכניקות גילוי וכימות ידניות הגוזלות זמן, כגון ELISA או Western blots, בשל...

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור בדיקת אימונו-סבאר (immunoassay) מותאמת אישית וחזקה לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור עם זמן עבודה ידני מוגבל. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת רכיבי הבדיקה המתאימים. השלב השני של ההליך הוא אופטימיזציה של הבדיקה בהתבסס על פרמטרי הבדיקה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הגדרת הבדיקה על פלטפורמת ה-Vibe, פשוט על ידי טעינת לוחיות הדגימות והריאגנטים והגדרת פרוצדורת הבדיקה. באמצעות תוכנת ה-Vibe, השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הפעלת ה-Vibe בעזרת אשף ההפעלה (startup wizard). בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות תוצאות אימונו-סיי (immunoassay) רגישות וניתנות לשחזור עם נוגדנים מותאמים אישית וזמן עבודה ידני מועט, הודות לשימוש בפלטפורמת ה-Vibe.היתרון המרכזי של טכנולוגיה זו על פני שיטות קיימות, כגון השיטה של Eli, הוא שתחנת העבודה Vibe מאפשרת תפעול ללא השגחה (walkaway) ונתונים הניתנים לשחזור ברמה גבוהה יותר בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים. בשימוש ב-NHS Chromogenic ובביוטין (biotin), כאשר הנוגדן הלוכד מחבר נוגדן ביוטינילי לסט렙טאבידין (strep avid) ולחרוזי מגנט, התחל באמצעות ערבוב במערבל (vortexing) של מבחנת חרוזי הסט렙טאבידין והמגנט למשך אחת עד שתיים דקות לצורך השהיה. העבר באמצעות פיפט את נפח החרוזים הרצוי לשפופרת צנטריפוגה והסר את העלייה בעזרת מפריד מגנטי. שטוף את החרוזים שלוש פעמים ב-PBST, תוך שימוש בהפרדה מגנטית לשחזור החרוזים בהתאם לפרוטוקול הכתוב.לאחר הסרת ה-PBST משטיפה האחרונה, הוסף את תמיסת הנוגדן הביוטינילי לخرזיים וערבב אותם מחדש באמצעות פיפטה. ודא שנפח הנוגדן הוא לפחות 300 microliters. אם הנפח נמוך מכך, התאם אותו באמצעות PBS.דגרו את התרחיף למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב. לאחר מכן, שטפו את החרוזים עם PBST כפי שבוצע קודם לכן. הוסיפו BSA biotinylated בהתאם לאותו נוהל שבוצע בעבר.בעת שטיפת נוגדן עם ביוטין (biotinylated antibody) לפני השהיה וסספנסיה מחדש של החרוזים ב-100 microliters של 0.05%BSA ב-PBS לאחסון לטווח ארוך, ניתן להוסיף סודיום אזייד (sodium azide) בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. השתמש ב-NHS fluorescein כדי לפלואורינאט את הנוגדן הגלאי. כדי להתחיל בפיתוח בדיקת חלבוני מארח של תאי שחמורים סיניים (Chinese hamster ovary).ראשית, הכין את תמיסות העבודה. נוגדן המסומן ב-HAPTEN או HAB מוכן כתמיסת עבודה בריכוז פי ארבעה של 1.6 micrograms per milliliter המדוללת עם bio scale bead HAB diluent; סובב את התמיסה למשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, הכין את תמיסת החרוזיים.ערבבו היטב את מלאי המרה עם החרוזיים ב-Vortex. כדי להבטיח שכל החרוזיים נמצאים בסספנסיה, הסירו מנה להכנת תערובת עבודה בריכוז פי 4 של 8×10⁵ חרוזיים למילליטר, המדוללת ב-bio scale bead HAB diluent. סובבו את התמיסה למשך חמש דקות לפחות.כעת הכין את באפר ההרצה. מספר בדיקות HCP של CHO פותחו באמצעות באפר HEPES בריכוז 10 millimolar עם 1% tween ב-pH 7.5.עם זאת, ייתכן שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה של התמיסה עבור הנוגדנים המשמשים לפיתוח הבדיקה. מומלץ להכין תבנית בדיקה עבור כל בדיקה הכוללת חמש תחנות עבודה. תבנית הבדיקה כוללת שבעה גיליונות, המסומנים כהוראות, הערות להגדרת הדגימות, חישובים של נתונים גולמיים, תרשים כיול ותוצאות.כדי להתחיל בהגדרת התבנית, בחרו את גיליון הגדרת הדגימות ומלאו בטבלה את טווח הריכוזים של התקנים. בפינה השמאלית העליונה של הגיליון, הזינו מידע נוסף בטבלה מימין לתקנים כדי להנחות את תחנת העבודה של ה-vibe לגבי משך זמן הדגירה של הדגימות, נפח הרכיב שיש להעביר, משך צבירת הדגימות, והאם נדרשים התניית חיישן וחיטוי של הגששים והמחסנית. לאחר מכן מלאו את פריסת הפלטה, דללו את הכליבטורים והדגימות באמצעות מדלל דגימות של bio scale והעמיסו את הדגימות לתוך הפלטות.טען את הריאגנטים לתוך לוחית ה-96 עם דפנות השלישית. אטום את הלוחיות. הנח את הלוחיות על השייקרים של משטח עמדת העבודה, והגדר את המערכת עם בופר שטיפה ותמיסת רגנרציה.הפעילו את תחנת העבודה vibe וחברו את מערכות האספקה והפסולת. התחילו בבדיקת זרימה (priming) של המערכת. הכניסו את מחريطת ה-vibe.לבסוף, הפעילו את אשף ההגדרות (Startup wizard) של הבדיקה. עקבו אחר ההוראות שעל המסך והתחילו. אות הבדיקה נמדד באמצעות טכנולוגיית A MMP. כאשר הנוגדן למסנן האנטיגן HAPTEN של החרוז נקשר לחשוף באמצעות האינטראקציית hapten anti hapten, תהליך הרגנרציה מחזיר את החשוף למצב ההתחלתי על ידי הסרת הקומפלקסים החיסוניים. מוצג.להלן דוגמה לבדיקת CHO H-C-P-A-M-M-P. ניתן לבצע ניתוח עקומת כיול בדגימות מביוראקטור עם תוצאות הניתנות לשחזור. עקומת כיול זו היא עבור חלבון שיורי.בדיקת A-A-M-M-P שבוצעו באמצעות ערכה לבדיקת חלבון שאריות vibe. ניתן להשתמש באותה ערכה לבדיקה מהירה יותר עם תקופת דגירה של 30 דקות, או לקבלת תוצאות רגישות יותר וטווח דינמי רחב יותר באמצעות תקופת דגירה ארוכה יותר. ניתן להשתמש בתחנת העבודה Vibe גם לבדיקת תיתור מוצר (titer) המבוצעת באופן שונה מבדיקות A MMP אחרות.בדיקה זו אינה דורשת טיפול בדגימה או שימוש בחרוזים, והכימות הוכח בדגימות ללא סבב צנטריפוגה המכילות מעל 10 מיליון תאים. מוצג כאן עקומת סטנדרט של אות שהתקבל באמצעות ה-Vibe Bioanalyzer או טכנולוגיית Alpha Screen, תוך שימוש בתוצאות של GST GAD 34 רקומביננטי בפלטפורמת Vibe. רגישות גבוהה יותר בסדר גודל של log.השראת GAD 34 משת transplanted CWR 22 נבדקה בנוכחות או בהיעדר מעכב פרוטאוזום bate, כפי שנותח באמצעות Vibe, bioanalyzer או Alpha screen. פלטפורמת ה-Vibe הצליחה להניב תוצאות רגישות וניתנות לשחזור בגידולי xenografts in vivo, בעוד שאות ה-alpha screen נחלש עם עלייה במיקרוגרמים של חלבון לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום גילוי תרופות אונקולוגיות לבחון עיכוב תרופתי בדגימות גידולים, ואפשרה פעולות יעילות יותר ביישומי עיבוד ביולוגי.

developing-custom-chinese-hamster-ovary-host-cell-protein-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגים בדיקה לטיהור נוגדנים חד-שבטיים מנוזל תרבית תאים שנאסף מתאי שחלות אוגר סיניות. הוא משתמש בשרף זכוכית נקבובי עם חלבון A משותק, שנקשר לאזור Fc של הנוגדנים בדגימה, ומפריד אותם ביעילות ממזהמים. השימוש במאגר אלוציה בעל pH נמוך מחליש את האינטראקציה, ומקל על שליפת נוגדנים מטוהרים.

טכניקה לטיהור נוגדנים חד שבטיים המיוצרים על ידי תאי שחלה של אוגר סיני

כאן, אנו מתארים assay כרומטוגרפי בשילוב עם ההפרדה ניידות יון של פפטיד מבשרי ואחריו ברזולוציה גבוהה (~ 30,000) MS-הזיהוי של פפטיד קטעים על כימות של פפטיד מחודדים הסטנדרטים של נוגדן חד שבטי תקציר.

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

פרוטוקול מפורט לטיהור וניתוח מאוחר יותר של נוגדן חד שבטיים מתוך נוזל שנקטפו לתרבות התא (HCF) של microbioreactors חקנים אוטומטיים תוארה. השימוש בניתוח כדי לקבוע תכונות איכות קריטיות (CQAs) ולמקסם את נפח מדגם מוגבל כדי לחלץ מידע חיוני מוצג גם.

טיהור וניתוח של נוגדן חד שבטיים מן הסינית שחלות אוגר תאים באמצעות מערכת Microbioreactor חקן אוטומטי

Reproducibly לספור את המספרים של mRNAs ב oocytes בודדים, מולקולה בודדת RNA פלורסצנטיות באתרו הכלאה (RNA-דג) היה אופטימיזציה עבור תאים שאינם מחסידי. Oocytes נאספו, hybridized עם הגששים ספציפית התעתיק, לכמת באמצעות תוכנה כימות של התמונה.

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

כאן, אנו מציגים הליך מפורט כדי להריץ עיצוב של ניסוי במיקרו-bioreactor חקן אוטומטי ואחריו הקציר התאים וכימות החלבון באמצעות חלבון A עמודה.

מיטוב תהליכים באמצעות תפוקה גבוהה מיקרו-Bioreactors שחקנים בסינית טיפוח תא שחלה אוגר

חלבון הנוגדן הרקומביננטי המתבטא בתאי pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO ובנוגדנים חד-שבטיים המיוצרים בטכנולוגיית היברידימה מסורתית יכול לזהות ולהיקשר לחלבון אמינופפטידאז N (APN) חזירי.

ייצור נוגדנים חד-שבטיים המכוונים לאמינופפטידאז N באפיתל רירית המעי החזירי

הפרוטוקול מציג שיטה לבידוד ליזאטים של חלבונים של תאים שלמים מתהליכי פנים של עוברי עכברים שנותחו או מתאי מזנכים עובריים של עכברים שעברו תרבית, וביצוע כתמים מערביים לאחר מכן כדי להעריך את רמות החלבון שעבר זרחן.

בידוד של חלבון של תאים שלמים ליסאטים מתהליכי פנים של עכברים ותאי מזנכיים פאלטליים בתרבית לניתוח פוספופרוטאין לניתוח פוספופרוטאין

דפוס הגליקוזילציה של הנוגדן קובע את ביצועיו הקליניים, ולכן נמשכים המאמצים התעשייתיים והאקדמיים לשלוט בגליקוזילציה. מאחר שקמפיינים טיפוסיים של גליקו-הנדסה הם עתירי זמן ועבודה, יצירת פרוטוקול מהיר לאפיון ההשפעה של גנים של גליקוסילציה באמצעות השתקה חולפת תתברר כיעילה.

גליקו-הנדסה מהירה של נוגדנים בתאי שחלת אוגר סיניים

מוצג פרוטוקול להעשרת חלבוני התא המאכסן (HCPs) ממוצרי תרופות (DP) ואיתור פפטידים באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום. השיטה מודגמת באמצעות חומר תרופתי נוגדן חד-שבטי (mAb) (DS), שהוא חומר ייחוס מאופיין היטב להערכה והשוואה של שיטות שונות מבחינת ביצועים.

ניתוח חלבון התא המארח באמצעות חרוזי העשרה בשילוב עם עיכול מוגבל

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור ואימות פונקציונלי של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T רגישים להיפוקסיה. פרוטוקול זה מציג את הדור מבוסס הלנטיוירוס של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה ואת אפיונם, כולל אימות של ביטוי CAR תלוי היפוקסיה וציטוטוקסיות סלקטיבית.

ייצור ואימות תפקודי של תאי קולטן אנטיגן כימרי רגישים להיפוקסיה

אקסוזומים הם בעלי פוטנציאל קליני משמעותי, אך היישום המעשי שלהם מוגבל בשל פינוי קל in vivo ויציבות ירודה. מיקרו-מחטים מציגות פתרון בכך שהן מאפשרות אספקה מקומית על ידי ניקוב מחסומים פיזיולוגיים ושימור מצב יבש, ובכך נותנות מענה למגבלות מתן האקזוזום ומרחיבות את התועלת הקלינית שלהן.

ייצור ואפיון מדבקות מיקרו-מחטים להעמסה ואספקה של אקסוזומים

למדו לפתח ניסויים אימונולוגיים מותאמים אישית בפלטפורמת ViBE לזיהוי חלבוני תאי CHO בסיני האמסטר. השיטה מספקת תוצאות רגישות וברות-השגה עם זמן יד מועט.

פיתוח התאמה אישית הסינית השחלות-מארח אוגר Cell חלבון מבחני באמצעות טכנולוגיה אקוסטית microparticle ממברנה

גלה סרטונים נוספים