Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

המטרה הכוללת של הפרוצדורה היא לחקור למידה וזיכרון בזבובים בוגרים מסוג Esso Melan Gaster, ראשית כדי לקבוע אם הזבובים סובלים מליקויים במוטוריקה. הם נבדקים בבדיקת גיאוטקסיס שלילית. לאחר מכן מאמתים התנהגות פוטוטקטית חיובית על ידי הנחת הזבובים במבוך T ותיעוד זמן התגובה עד לתנועה לעבר התא המואר המועדף.

זבובים בעלי פוטוטקסיס חיובי מותנים לאחר מכן לקשר בין התא המואר לבין טעמו המר של הקינין. לבסוף, נבדקת מידת היכולת של הזבובים לקשר בין הגירוי הדוחה לבין התא המואר, מה שמספק מדד ללמידה ולזיכרון. אולה, ברוכה הבאה למעבדה X.

היום נדגים בפניכם שתי בדיקות התנהגותיות נפוצות לחקר ניוון עצבי ב-drosophila. ראשית, נציג את בדיקת דיכוי הפוטוטקסיס הרגילתי (aversive phototaxis suppression assay) שיוצג על ידי ויל פרדו סאלה, סטודנט לתואר ראשון במעבדה שלנו, ועל ידי עצמי, ולאחריה תבוא בדיקת הגאוטקסיס השלילי (negative geotaxis assay) שתוצג על ידי קייוואן, סטודנט לתואר שני במעבדה שלנו. יש להחזיק את הזבובים במצע סטנדרטי של קורנמיל, אגר, מולאסה ושמרים בטמפרטורה של 25 °C במחזור של 12 שעות אור וחושך.

ביום החסימה, יש למיין זבובים בתולים לקבוצות של 20. זבובים בתולים מזוהים על ידי צבעם הבהיר וכתם ירקרק כהה הממוקם בחלק התחתון של הבטן שלהם. יש להעביר את הזבובים לבקבוקון טרי מדי שלושה ימים, ויש להשתמש בזבובים מאותם הורים כדי למזער הבדלים הנובעים מרקע גנטי.

במחקר גאו-טקסיס (geo taxes) יש לבחון בין 10 ל-20 קבוצות לכל גנוטיפ או טיפול. לתחילת העבודה, יש למיין זבובים נקבות וזכרים לקבוצות של 10. יש לבחון זבובים אלו בנפרד.

מכיוון שההתנהגות מושפעת באופן משמעותי מהמין, המתן לפחות שעה אחת לאחר ההרדמה לפני ההמשך, כדי להבטיח שהפעילות הלוקומוטורית אינה פגועה. לאחר שהזבובים הוכנו כראוי, יישר את הפתחים של שני מבחנות פוליסטירן ריקות על ידי חיבורן באופן אנכי על המבחנה התחתונה.

מדדו שמונה סנטימטרים מהבסיס ושרטטו עיגול מסביב להיקף. כעת, לאחר שהמכשיר הורכב, העבירו קבוצה של 10 זבובים למבחנה התחתונה. חברו מיד את המבחנות שנית והמתינו דקה אחת להסתגלות הזבובים לפני הבדיקה.

לאחר שהזבובים נחנו, הקישו עליהם בעדינות כדי להורידם לתחתית המבחנה ומדדו את מספר הזבובים המטפסים מעל סימון שמונה הסנטימטרים תוך 10 שניות. מספר הזבובים בכל קבוצה שעברו סימון זה נרשם כאחוז ממספר הזבובים הכולל. חזרו על הליך זה 10 פעמים לכל קבוצה, תוך מתן דקה של מנוחה לזבובים בין הניסויים.

שש שעות לפני ביצוע בדיקת PS, מינו זבובים נקבות למבחנות פוליסטירן המכילות נייר סינון טבול במים. שלב זה מבטיח שהזבובים יהיו רעבים ורגישים יותר לטעם הדוחה. בבדיקה זו, תמיסת קינין משמשת כגירוי הדוחה.

הכינו תמיסת עבודה בריכוז של 1 µM מתוך תמיסת סטוק בריכוז של 0.1 M. מבוך ה-T מורכב מעמוד מרכזי עם דלת מלכודת ושתי תאי צד, תא חשוך ותא מואר. בסימון של 2 mm, השתמשו במסור ידני כדי לחתוך את הקצה הסגור של שני מבחנות צנטריפוגה מפלסטיק בנפח של 15 mL, התקינו מתאמי חיבור בכל קצה ואטמו את החיבור באמצעות פאראפילם.

עטוף מבחנה אחת בנייר אלומיניום כדי לשמש כתא חשוך. הרכב את ה-TMAs על ידי הברגת התאים המוארים והחשוכים על כל צד של עמוד המרכז. כאשר דלת המלכודת במרכז סגורה, השלם את ההכנה על ידי חיבור מקור אור למתאם של התא המואר. לפני ביצוע הבדיקה, העבר כל זבוב מקבוצה של 10 למבחנה ריקה של 15 milliliter לצנטריפוגה וסגור את הפקק קלות כדי למנוע בריחה.

בשלב הבא, הבריגו החוצה את התא החשוך מה-TMAs. העבירו זבוב בודד אל תוך המבחנה והחזירו אותה מיד אל תוך המבוך. כבו את האורות בחדר והדליקו מנורה אדומה.

אפשרו לזבוב להסתגל בתא החשוך למשך 30 שניות ולאחר מכן הדליקו לאט את מקור האור המאיר את התא המואר. לאחר ההדלקה, פתחו את דלת המלכודת המפרידה בין שני התאים. אם הזבוב הולך לתא המואר בתוך 10 שניות, הוא נחשב לפוטוטקטי חיובי ומוכן לאימון.

אי-תגובה באופן זה מעידה על בעיה במערכת החזות ומחייבת את השללתו של הזבוב מהניסוי. לאחר שאישרו פוטוטקסיס חיובי, הקישו על הזבוב כדי להחזירו לתא החשוך, סגרו את דלת המלכודת וכבו את האור למשך תקופת מנוחה של 32 שניות. הכינו את הגירוי הדוחה על ידי הנחת נייר סינון בתוך התא המואר וטפטוף של 1 mL של תמיסת קינין על נייר הסינון.

יש לוודא שכל נייר הסינון לח לחלוטין בגירויים דוחים. כדי להתחיל בהתניה, פתחו לאט את דלת המלכודת והדליקו את האור. אפשרו לזבוב ללכת לתוך התא המואר בעל ריח הקינין.

לאחר דקה אחת, הקישו על הזבוב כדי להחזירו לתא החשוך. חזרו על הליך זה תשע פעמים, לסך הכל 10 ניסיונות התניה. בדרך כלל, זבובים מסוג זה נמנעים מהתא המואר לאחר שלושה עד חמישה ניסיונות אימון, מיד לאחר סיום האימון.

בצע חמישה ניסיונות בדיקה. אם הזבוב המאומן אינו הולך אל תוך האור של התא בתוך 10 שניות, הדבר נרשם כהצלחה. שיעור ההצלחה לאורך חמישה ניסיונות רצופים נרשם ומוגדר.

PC אפס. לאחר האימון וההקלטות הראשוניות של PC אפס, כל זבוב מוחזר למבחנה הממוספרת המקורית שלו עם המזון ונשמר בצד למשך שש שעות. שש שעות לאחר האימון, בצע חמישה ניסיונות בדיקה נוספים כפי שהודגם קודם לכן; שיעור המעבר זה מייצג את PC שש ומהווה מדד לזיכרון לטווח קצר.

בבדיקת ה-negative geotaxis, מספר הזבובים שחוצים את סימן שמוני גרם מומר לאחוז ומוצג כשיעור מעבר הטיפוס. לאורך 10 ניסויים, כפי שניתן לראות כאן מימין, לזבובים זכרים או נקבות בני 10 ימים המבטאים באופן יתר Human tau ישנם ליקויים מוטוריים משמעותיים בהשוואה לזבובים בני גיל המבטאים באופן יתר GFP, המוצגים משמאל.

הביצועים במבחן דיכוי הפוטוטקסיס הדוחה מיוצגים על ידי שיעור המעבר הממוצע או אחוז ניסיונות ההימנעות המוצלחים. מתוך סך הניסיונות, זבובים המבטאים באופן יתר את tau, המוצגים כאן מימין, נכשלו בקישור האור לטעם מר בהשוואה לקבוצת הביקורת משמאל, הן מיד לאחר האימון והן כאשר נבדקו שש שעות מאוחר יותר. בעקבות הליך זה, ניתן לדגום דגימות לצורך אנליזה אימונוהיסטוכימית כדי לענות על שאלות נוספות לגבי הבדלים מורפולוגיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו לומדים על למידה וזיכרון ב-Drosophila.

וזכרו, הכל סובב סביבכם.