Name: Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: למד הדמיה בזמן אמת של טרנסלוקציית PKC בנוירונים חישניים של Aplysia באמצעות מיקרוסקופיית לייזר סריקה. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקת PKC בתגובה למגוירים שונים ומסייעת להבנת מנגנוני האיתות התאתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקנדי הלאומי לבריאות מחקר (CIHR) מענק ויין ס Sossin. קרול א פרח הוא מקבל המלגה הבתר מן Fonds de la משוכלל ונדיר en סנטה קוויבק (FRSQ) וכן הרינגטון קונרד המילגה. המחברים מבקשים להודות ג&#39;ואנה פתילון, מרגרט הייסטינגס מרגרט Labban לעזרה עם לירות וידאו בריכת מדליין ריצ&#39;מונד לעזרה עם סקירה הגרפיקה.

1. הכנה ותחזוקה של Sf9 תרבויות monolayer Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sf9 תרבית תאים והתחזוקה מתבצעת במנדף בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sf9 תאים מתאי Spodoptera frugiperda השחלות (Sf21 תאים) וכן ניתן לרכוש תאים קפואים התקשורת של גרייס מן Invitrogen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 8 מ&quot;ל של מדיום החרק של גרייס, בתוספת (1X), אשר 30% עוברי שור בסרום (FBS) נוספה ב 75 ס&quot;מ 2 בקבוק תרבית תאים עם צוואר הנטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה הצינור הקפוא של Sf9 תאים במהירות אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים על ידי העברת צינור הלוך ושוב (כ 1-2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת Sf9 תאים 75 ס&quot;מ 2 בקבוק התרבות תאים צלחת רוק בעדינות ביד כדי לפזר את התאים באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1-2 שעות ב 27 ° C עד התאים המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני הישן ולהחליף עם 10 מ&quot;ל של מדיום של חרקים freshGrace עם 30% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 27 מעלות צלזיוס עד התאים ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על תרבויות monolayer, להסיר בינוני הישן מהבקבוק ומחוברות של Sf9 תאים להוסיף 5 מ&quot;ל של מדיום החרק של גרייס עם 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברז קלות בצד של הבקבוק כמה פעמים כדי לנתק Sf9 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל ו pipettor, פיפטה התקשורת מעלה ומטה פעם בעדינות, ריסוס קיר בקבוק תוך pipetting למטה. העברת התאים צינור סטרילי מ&quot;ל 15 Polysterene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של השעיה Sf9 התא 8 מ&quot;ל של מדיום החרק של גרייס עם FBS 10% (בדילול 01:05 כדי לשמור על שלב הצמיחה יומן) של 75 ס&quot;מ חדש בקבוקון 2 תאים תרבות צלחת רוק בעדינות ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 27 מעלות צלזיוס עד התאים ומחוברות. </li></ol> 2. הביטוי של PKCS Tagged fluorescently ב Sf9 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשביל לחיות הדמיה הניסוי, תרבות Sf9 תאים על 35 מ&quot;מ MatTek זכוכית התחתונה תרבות disheswith משטח זכוכית של 14 מ&quot;מ עובי ו coverslip של 0.16-0.19 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PKCS מתוייגים עם חלבוני ניאון באים לידי ביטוי Sf9 תאים באמצעות Cellfectin מגיב II transfection ההמלצה הבאה של היצרן בשינויים המפורטים להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: לפני ציפוי התאים, להתייחס לכל צלחת MatTek בינוני עם החרק של גרייס עם FBS של 10% לפחות במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן Sf9 תאים משלב 11 (לעיל) באמצעות hemacytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 0.05 x 10 6 תאים coverslip כל MatTek זכוכית בנפח כולל של 150 μL. אפשר לצרף את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של גרייס בתוספת 10% FBS כדי מ&quot;ל כל מנה 1 בכל פעם לאט, כדי למנוע ניתוק התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 27 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודה זו ואילך, להשתמש המלצה של היצרן עבור transfection Sf9 של תאים עם פלסמיד דנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: Transfect Sf9 תאים עם PKCS מתויג fluorescently באמצעות Cellfectin מגיב II transfection. יש לנו לעתים קרובות שיתוף לידי ביטוי במערכת זו PKCS מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (eGFP) ו monomeric חלבון פלואורסצנטי אדום (mRFP) (פרטים לבנייה פלסמיד תוארו בעבר 2,5). הביטוי של חלבון אחד ניאון בזמן התשואות על 70-80% להביע תאים 72 שעות לאחר transfection. עמית הביטוי של שני חלבונים פלורסנט פוחתת יעילות transfection כדי כ -30% משותף המבטא תאים. כאשר שיתוף להביע eGFP-tagged PKC ו-mRFP מתויג PKC, להשתמש 2x-DNA פלסמיד יותר חלבון mRFP-tagged עבור ביטוי חלבון אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע לחיות הדמיה 48-72 שעות שלאחר transfection (ביטוי חלבון אופטימלי, להמתין 72 שעות). </li></ol> 3. הביטוי של PKCS Tagged fluorescently בנוירונים Aplysia חושי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תרביות תאים עצביים Aplysia תוארה במאמר וידאו על ידי ג&#39;או 4 עמיתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PKCS מתוייגים עם חלבוני ניאון באים לידי ביטוי נוירונים Aplysia חושית באמצעות הליך microinjection כמפורט להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של גרין מהיר 1% (FCF) של מים מזוקקים, מסנן באמצעות מזרק מזרק 28 מ&quot;מ פילטר (0.20 מיקרומטר). Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microinjection של עצב סנסורי יכול להתבצע ביום 1 או 2 אחרי יום לבודד את הנוירונים אך אנו מוצאים כי מחכה 2 ימים מאפשר היצמדות התא עדיף coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2 לאחר בידוד של נוירונים חושיים, להפשיר aliquot של גרין מהיר לסנן אותו שוב באמצעות מזרק מזרק מסנן 28 מ&quot;מ (0.20 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ה-DNA פלסמיד המכיל מים מזוקקים בתוך הירוק מהיר 0.5%. ריכוזים של DNA פלסמיד גבוה ככל 0.4 מיקרוגרם / μL ניתן להשתמש אך לא מומלץ ללכת מעל ערכים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ה-DNA פלסמיד / פתרון ירוק מהיר באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל ו 4 מ&quot;מ מזרק מסנן (0.20 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הדנ&quot;א פלסמיד / גרין פתרון מהיר ב XG 16,110 במשך 15 דקות באמצעות מיקרופוןrocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודות חדה microinjection של הנוירונים באמצעות חולץ microelectrode (סאטר Flaming / בראון micropipette פולר, דגם P-97). שימוש נימה תיבת, למשוך microelectrodes זכוכית בקוטר 1 מ&quot;מ החיצוני, 0.75 מ&quot;מ בתוך בקוטר 100 מ&quot;מ אורך באמצעות קיר זכוכית דק נימים עם נימה בפנים (World Precision מכשירים TW100F-4). לקבלת מידע נוסף על משיכת אלקטרודות microinjection עיין ספר בישול אלקטרודה סאטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כל אלקטרודה עם μL 2 של ה-DNA פלסמיד / גרין פתרון מהיר באמצעות פיפטה microloader קצה (Eppendorf CA32950-050). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את תחתית הכוס MatTek תרבות צלחת המכילה תרבויות Aplysia העצבית לתחנת microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחנת microinjection מורכב מהפעולות הבאות: תוצרת בית בשלב זכוכית גדול להחזיק את הכלים תרבות על השולחן רטט בידוד (קינטי בידוד מערכות עבודה רטט), מערכת סטריאו, היקף עם תאורה הלוגן חיצוני, micromanipulator (סאטר האקסלי Micromanipulator וול סוג אשר מאפשר מיצוב הן גס ו-Ultra קנס של שלושה צירים), מחזיק microelectrode מחוברת משאבה פנאומטי (מכשירים העולם Precision PV820 פניאומטיים Pico-Pump). קלט הלחץ של המשאבה פנאומטי מחובר טנק חנקן דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס microelectrode לתוך מחזיק microelectrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפייה במיקרוסקופ, סטריאו, הכנס את קצה micropipette לתוך גרעין התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פולסים קצרים הלחץ של חנקן (10-100 ms משך: 20 £ / ב 2) עד בגרעין הופך ירוק uniformely. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. עבור טרנסלוקציה PKC אופטימלי, לבצע הדמיה לחיות הניסוי 20-24 שעות לאחר ההזרקה. </li></ol> 4. ויזואליזציה של טרנסלוקציה של PKC חיים Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה, אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss LSM510 confocal הפוכה עם 200 Axiovert. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה פרוטוקול זהה עבור Sf9 תאים עבור נוירונים Aplysia חושית למעט הבאים: Sf9 התאים הם צילמו עם מטרה x63 טבילה שמן ואילו נוירונים Aplysia חושית הם צילמו עם מטרה טבילה שמן X40. Sf9 התאים הם צילמו בחדר בקרת טמפרטורה שמרה על 26-27 מעלות צלסיוס ואילו נוירונים Aplysia חושית הם צילמו בטמפרטורת החדר נשמר סביב 18-20 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים 30 mW ארגון לייזר (עירור ב 488nm) עם פלט לייזר 50% PKC תמונה מתוייגים עם חלבון ו eGFP לייזר HeNe (עירור ב 543nm) כדי PKC תמונה מתוייגים עם חלבון mRFP. ארגון ו HeNe קווי לייזר נחלש ל -4% ואת התפוקה העברת 50% בהתאמה לפני הדמיה חריר מותאם אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לקבל את המנה תרבות התייצב על הבמה הדמיה כדי למנוע תנועה או רטט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 1 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות מצלחת בעדינות בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל עוזב נפח 1 מ&quot;ל סך המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות בחלק האמצעי של התאים בהם את הגרעין ניתן לראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סדרת זמן של 10-20 תמונות confocal לצלם כל 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחילו את סדרת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 תמונות נלקחים (אחרי נקודת זמן 30 שניות), מוסיפים 1 מ&quot;ל של התרופה (2X ריכוז) בעדינות טיפה אחר טיפה על גבי התאים בעזרת פיפטה P1000. התרופה היא הוסיפה ברציפות במשך כ -30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק מהתרופות לגרום טרנסלוקציה מהיר אשר ניתן לראות מיד לאחר טיפול תרופתי (בנקודת זמן 60 שניות), בעוד שאחרים לגרום טרנסלוקציה איטי וזה רק 50-10 דקות אופטימלי שלאחר הטיפול (סרט 1 סרט ו 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התרופה צריכה להיות נשטף, להשתמש 2 x 10 מ&quot;ל pipets לעשות כביסה, pipetting החיץ לשטוף בעדינות עם פיפטה אחת על צד אחד של תבשיל ו pipeting את המדיה בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לשטוף את כבר יעיל אם את האפקט של התרופה הוא הפיך, PKC יחזרו cytosol בתוך 30-60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הסרט כקובץ LSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש NIH תוכנה J תמונה כדי לפתוח את הקבצים LSM ולכמת תמונות הקדם ואת הטיפול התרופתי הודעה. כימות תוארה במקום אחר 1. </li></ol>

<ol><li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &amp, Klein, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2%2B-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li>
<li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תיארנו טכניקה הדימוי של טרנסלוקציה PKCS מתויג fluorescently בזמן אמת Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושית. Sf9 תאים לספק מערכת פשוטה טרנסלוקציה תמונה PKC מאז culturing ו transfecting אותם הוא די ישר קדימה. לעומת זאת, microinjection של נוירונים Aplysia חושית לוקח קצת זמן כדי לשלוט; עד כמה חודשים. קשיים הקשורים טכניקה זו כוללת סתימת אלקטרודה. סינון הפתרון הזרקת centrifuging זה בדרך כלל עוזר אבל בועות אוויר לפעמים יכול להיווצר האלקטרודה בעת מילוי אותו. אנו מוצאים כי באמ...

<table><tbody><tr><td>תאי Sf9 קפואים</td><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)&gt;*Spodoptera frugiperda*&lt;/em&gt; תאי שחלה</td><td>Invitrogen</td><td>B825-01</td><td></td></tr><tr><td>גרייס&amp;rsquo;מצע גידול לחרקים, מועשר (1X), נוזלי</td><td>ריאגנט</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>11605-094</td><td>לשימוש לתרבית תאי Sf9</td></tr><tr><td>Corning 75 ס"מ&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; בקבוק תרבית תאים עם פיה זוויתית</td><td>כלי</td><td>Corning</td><td>430720</td><td>משמש לתרבית תאי Sf9</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>ריאגנט</td><td>CanSera</td><td>CS-C08-500</td><td>תוסף גרייס&amp;rsquo;מדיום עם FBS לפני השימוש</td></tr><tr><td>מזרק</td><td>כלי</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>השתמשו לסנן תמיסת Fast Green</td></tr><tr><td>מזרק</td><td>כלי</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>לסינון של תמיסת plasmid DNA / Fast Green</td></tr><tr><td>מסנן</td><td>כלי</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>השתמש למסננת של תמיסת Fast Green</td></tr><tr><td>מסנן</td><td>כלי</td><td>Corning</td><td>431212</td><td>משמש לסינון תמיסת DNA פלסמידי / Fast Green</td></tr><tr><td>צלחת בעלת תחתית זכוכית</td><td>כלי</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>משמש לתרבית של תאי Sf9 לפני טרנספקציה ודימיג (imaging)</td></tr><tr><td>ריאגנט Cellfectin II</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>משמש לביטוי של PKCs המסומנים פלואורסצנטית בתאי Sf9</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>השתמשו כדי להמחיש הזרקה מיקרוסקופית (microinjection) של תמיסת DNA פלסמידית אל תוך &lt;מיקרוסקופיית אלקטרונים (em)&gt;Aplysia&lt;/em&gt; נוירונים תחושתיים</td></tr><tr><td>נימי זכוכית דקרי-דופן</td><td>כלי</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td>השתמש כדי להכין מיקרו&amp;#8211;אלקטרודות להזרקה מיקרוסקופית (microinjection)</td></tr><tr><td>טיפ למערכת מיקרו-טעינה (Microloader pipette tip)</td><td>כלי</td><td>Eppendorf</td><td>CA32950-050</td><td>יש לעקר באוטוקלאב לפני המילוי של המיקרו...&amp;#8211;אלקטרודות להזרקה מיקרוסקופית</td></tr><tr><td>PV820 Pneumatic PicoPump </td><td>כלי</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td>חלק מתחנת מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>מיקרו&amp;#8211;מחזיק אלקטרודה</td><td>כלי</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH6S</td><td>משמש להחזקת מיקרו&amp;#8211;אלקטרודה </td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>כלי</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td>השתמש כדי למקם את המיקרו...&amp;#8211;אלקטרודה בציר השלושה</td></tr></tbody></table>

live-הדמיה של טרנסלוקציה של pkc sf9 תאים בנוירונים aplysia חושי

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

חלבון קינאז Cs (PKCS) הם סרין קינאזות תראונין כי תפקיד מרכזי בוויסות מגוון רחב של תהליכים תאיים כגון צמיחת תאים למידה וזיכרון. ישנן ארבע משפחות הידועים של isoforms PKC בבעלי חוליות: PKCS קלאסית (α, βI, βII ו γ), סוג הרומן אני PKCS (ε ו η), רומן מסוג II PKCS (δ ו θ), ו PKCS טיפוסיות (ζ ו ι ). PKCS קלאסית מופעלים על ידי Ca 2 + ו diacylclycerol (דאג), בעוד PKCS רומן מופעלים על ידי DAG, אבל הם Ca 2 + עצמאית. PKCS טיפוסיות מופעלים על ידי לא Ca 2 + וגם לא דאג. ב Aplysia californica, מערכת המודל שלנו ללמוד היווצרות הזיכרון, ישנם שלושה ספציפיים מערכת העצבים isoforms PKC אחד מתוך כל שיעור גדול, כלומר קונבנציונלי PKC Apl אני, סוג הרומן אני PKC Apl השנייה טיפוסיות PKC Apl III. PKCS הם שומנים בדם מופעל קינאזות ובכך ההפעלה של PKCS קלאסית רומן בתגובה לאותות תאיים כבר בקורלציה לעתים קרובות עם טרנסלוקציה PKC מן הציטופלסמה אל קרום התא. לכן, טרנסלוקציה PKC חזותי בזמן אמת בתאים חיים הפך להיות כלי רב ערך עבור הבהרת הולכת אותות מסלולים שיובילו הפעלת PKC. לדוגמה, טכניקה זו אפשרה לנו לקבוע כי isoforms שונים של PKC translocate בתנאים שונים לתווך סוגים שונים של הפלסטיות הסינפטית וכי (5HT) סרוטונין הפעלת PKC Apl השנייה דורשת ייצור של שני DAG ו phosphatidic חומצה (רש&quot;פ) עבור טרנסלוקציה 1-2. חשוב לציין, את היכולת לדמיין את אותו הדבר שוב ושוב נוירון אפשרה לנו, למשל, כדי למדוד את הפחתת רגישות התגובה PKC בפירוט מעולה 3. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כל שלב הכנת Sf9 תרביות תאים, תרביות של נוירונים Aplysia חושית תוארו במאמר אחר וידאו 4, להביע PKCS מתויג fluorescently ב Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי לחיות הדמיה טרנסלוקציה של PKC בתגובה activators שונים באמצעות לייזר מיקרוסקופיית.

בסרטון הזה אנחנו מדגימים להדמיה טרנסלוקציה של PKC בתאים חיים באמצעות PKCS מתויג fluorescently.

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

פרוטאין קינזות C (PKCs) הן קינזות סרין-תריונין הממלאות תפקיד מרכזי בבקרת מגוון רחב של תהליכים תאיים, כגון צמיחת תאים ו...

מטרת פרוצדורה זו היא להדגים ויזואלית את התניידותו של PKC המסומן פלואורסצנטית בתאים חיים. הדבר מושג תחילה על ידי הכנת תרביות של תאי SF nine או תרביות של נוירונים תחושתיים מ-Plegia California. השלב השני הוא ביטוי של pkcs המסומנים פלואורסצנטית בתאים.השלב הסופי הוא הדמיית התעתקות של PKC בתגובה למפעילים שונים באמצעות מיקרוסקופיה סורקת בלייזר. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות רגולציה דיפרנציאלית של איזופורמות PKC השונות על ידי שליחים שניים כגון diol glycerol, באמצעות הדמיה של התעתקות PKC בזמן אמת בתאים חיים. שלום, שמי קרול פרה.אני עמית מחקר במעבדה של ד"ר Wayne Sawn במכון הנוירולוגי של מונטריאול. היום אני הדגם דימות חי של התעתקות PKC בנוירונים תחושתיים של Aplysia. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפלסטיות הסינפטית, כגון כיצד מופעלות איזופורמות השונות של PKC במהלך היווצרות זיכרון.להכנת תרביות של שכבה אחת של תאי SF nine במנדף לתרבית רקמות, העבירו 8 mL של מצע Grace's insect medium עם 30% fetal bovine serum לבקבוק תרבית תאים של 75 cm². לאחר מכן, הפשיתו במהירות את המבחנה הקפואה של תאי SF nine באמבט מים של 37 °C על ידי הנעת המבחנה קדימה ואחורה במשך כ-1 עד 2 דקות. כעת, העבירו את תאי SF nine לבקבוק תרבית התאים ונערו את הבקבוק בעדינות ביד כדי לפזר את התאים באופן שווה. דגרו את התאים למשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של 27 °C עד להצמדתם.לאחר מכן, הסר את המצע הישן מהבקבוק והחלף אותו ב-10 milliliters נוספים של מצע חרקים מסוג grace's עם 30%FBS; הדגר את התאים בטמפרטורה של 27 degrees Celsius עד להגעתם לקונפלואנסיות. כדי לתחזק תרביות בשכבה אחת (monolayer), הסר את המצע הישן מבקבוק תאי ה-SF nine שהגיעו לקונפלואנסיות והוסף five milliliters של מצע חרקים מסוג grace's עם 10%FBS; הקיש קלות על דופן הבקבוק מספר פעמים כדי לנתק את תאי ה-SF nine. לאחר מכן, באמצעות פפטה של 10 milliliter, בצע פיפוט עדין של המצע מעלה ומטה.לאחר התזת התאים על דופן הבקבוק תוך כדי פיפוט כלפי מטה, העבירו את התאים לשפופרת פוליסטירן סטרילית של 15 milliliter. הוסיפו שני milliliters של תרחיף תאי SF nine לשמונה milliliters של מצע מזין לחרקים מסוג grace's עם 10%FBS בבקבוק תרבית תאים חדש של 75 centimeter squared, ביחס דילול של 1 ל-5. כדי לשמור על צמיחה בשלב הלוגריתמי (log phase), נערו את הבקבוק בעדינות ביד.בשלב הבא, דגרו את התאים שוב בטמפרטורה של 27 °C עד להגעתם לשלב הקונפלואנס (confluence). לאחר הדגירה, תאי ה-SF9 מוכנים לשימוש לצורך ביטוי של pkcs מתויג פלואורסצנטית, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב לפני ביטוי ה-pkcs המתויג פלואורסצנטית. תרביות של תאי עצב מ-Drosophila מוכננות בצלחות גידול עם תחתית זכוכית של matech כפי שתואר בעבר. יומיים לאחר בידוד הנוירונים התחושתיים, סננו תמיסת fast green שהוכנה מראש באמצעות מזרק ומסנן מזרק של 20 mm עם גודל נקבוביות של 0.2 micron.הכינו תמיסה של plasmid DNA המקודד עבור E-G-F-P-P KC API two במים מזוקקים המכילים 0.5% fast green בריכוז שאינו עולה על 0.4 µg/µL. סננו את תמיסת ה-plasmid DNA fast green באמצעות מזרק של 1 mL ומסנן מזרק של 4 mm בעל גודל נקבוביות של 0.2 µm. לאחר מכן, סבבו את תמיסת ה-plasmid DNA fast green ב-16,110 ×g למשך 15 דקות באמצעות מיקרו-צנטריפוגה.בשלב הבא, הכינו אלקטרודות חדות להזרקה מיקרוסקופית של נוירונים באמצעות מושך מיקרו-אלקטרודות. משכו מיקרו-אלקטרודות מזכוכית באמצעות קפילרות זכוכית בעלות דופן דקה עם פילמנטים בפנים. מלאו כל אלקטרודה ב-2 µL של תמיסת פלסמיד DNA עם fast green.באמצעות טיפ של פיפטה לטעינה מיקרוסקופית, מתבצעת הזרקה מיקרוסקופית בתחנת ההזרקה המיקרוסקופית. תחנת ההזרקה המיקרוסקופית מורכבת מבמה גדולה מזכוכית שהוכנה במעבדה להחזקת צלחות תרבית על שולחן בידוד רעידות. סטראוסקופ עם תאורת הלוגן חיצונית, מיקרו-מניפולטור ומחזיק מיקרו-אלקטרודות המחובר למשאבה פנאומטית.כניסת הלחץ של המשאבה הפנומטית מחוברת למיכל חנקן דחוס. העבר את צלחת התרבית עם התחתית הזכוכית של matech המכילה את תרביות נוירוני ה-plegia לתחנת המיקרו-הזרקה והכנס מיקרו-אלקטרודה למחזיק המיקרו-אלקטרודות. צפה בנוירונים תחת מיקרוסקופ סטריאואסקופי והחדר את קצה המיקרו-פיפט לתוך גרעין התא.הנח פולסי לחץ קצרים של חנקן במשך 10 עד 100 מילישניות ובלחץ של 20 pounds per square inch עד שהגרעין יהפוך לירוק באופן אחיד. דגרו את התאים למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר ושמרו אותם בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius עד לשימוש. לצורך הדמיה של תאי SF nine ושל נוירונים תחושתיים של Drosophila נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך Zeiss LSM 510 עם עדשת axiovert 20x.בסרטון זה מוצג דימוי של נוירונים תחושתיים של plegia. פרטים על דימוי של תאי SF nine ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב. השתמש בלייזר argonne של 30 milliwatts עם 50% laser output כדי לדמות PKC מתויג בחלבון EGFP.בשלב הבא, החלישו את קו הלייזר של ה-Argonne למוצא של 4% transmission. לאחר מכן, כווננו את ה-pinhole לערך 1, ייצבו את צלחת התרבית על במת הדימיג ומנעו תנועה או רעידות. הסירו בעדינות 1 mL של מדיום תרבית מהצלחת באמצעות פיפט של 10 mL, והשאירו נפח כולל של 1 mL.בתוך הצלחת. אתרו את החלק המרכזי של התאים שבו ניתן לראות את הגרעין. הגדירו סדרת זמן של 10 עד 20 תמונות קונפוקאליות במרווחי זמן של 30 שניות.הפעילו את הסרטון ולאחר צילום התמונה השנייה, גרמו לתעתיק (translocation) על ידי הוספה עדינה של 1 mL מהתרופה בריכוז כפול. הוסיפו את התרופה טיפה אחר טיפה על התאים באופן רציף למשך כ-30 שניות. במקרה זה נעשה שימוש ב-serotonin כדי להשרות תעתיק מהיר, שניתן להבחין בו מיד לאחר הטיפול התרופתי.חלק מהתרופות גורמות לתעתוק איטי, המגיע לשיאו רק חמש עד 10 דקות לאחר הטיפול; יש לשטוף את התרופה באמצעות שתי פיפטות של 10 מיליליטר, על ידי פיפוט עדין של תמיסת השטיפה כלפי מטה עם פיפטה אחת בצד אחד של הצלחת, ופיפוט המדיום כלפי מעלה בצד השני. אם השטיפה הייתה יעילה והשפעת התרופה היא הפיכה, ה-PKC יחזור לציטוזול בתוך 30 עד 60 שניות. שמרו את הסרטון כקובץ LSM כפי שמוצג.להלן תוצאות מייצגות של דימוי חי של התעתקות PKC בנוירונים תחושתיים של plegia. E-G-F-P-P KC APL two בוטא בנוירון תחושתי, וסדרה של 10 תמונות קונפוקאליות הוקלטו במרווחי זמן של 30 שניות. בדוגמה זו, סרוטונין נוסף לצלחת לאחר 30 שניות של הקלטה.בדוגמה זו, מוצג דימות חי של התעתקות של PKC בתאי SF nine. ביטוי משותף של E-G-F-P-P KC APL one ו-M-R-F-P-P KC APL two בוצע בתאי SF nine, וסדרה של 10 תמונות קונפוקאליות הוקלטו במרווחי זמן של 30 שניות. One two DIOCTYL SN glycerol.אנלוג חדיר תאים של DYL glycerol הוסף לצלחת לאחר 30 שניות של הקלטה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבטא pkcs מסומנים פלואורסצנטית בנוירונים תחושתיים של aplasia, וכיצד לדגם את התניידות ה-PKC בתאים חיים.

live-imaging-pkc-translocation-sf9-cells-aplysia-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון הזה, אנו מתארים שיטת הדמיה של תא חי להתחלק סימטרית חושי אבי איברים ותאי אפידרמיס ב...

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

אנו מראים כיצד שינויים בריכוז התאי החופשיים הסיד ויעילות הסינפטית ניתן לפקח במקביל בהכנה של...

מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן התאיים ויעילות הסינפטית ברכיכות<em&gt; Aplysia</em

מקור: Jongbloets, B. C.,  et al. הדמיית חלבון קינאז פעילות בעכברים המתנהגים קבועים בראש באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי דו-פוטוני in vivo. J. Vis. Exp. (2019)} סרטון זה מדגים הליך מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטי דו-פוטוני להדמיית פעילות חלבון קינאז A בעכברים קבועי ראש ומתנהגים במהלך תנועה כפויה.

הדמיית חלבון קינאז פעילות בעכבר באמצעות מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטי דו-פוטוני 

כאן אנו מציגים רומן Ca 2 + גישת -imaging באמצעות כתב bioluminescent. גישה זו משתמשת בGFP-aequorin מבנה התמזגה אשר נקשר Ca 2 + ופולט אור, ומבטל את הצורך בעירור אור. באופן משמעותי בשיטה זו מאפשרת הדמיה ארוכה רציפה, גישה למבני מוח עמוקים ורזולוציה גבוהה זמנית.

בגישת ההדמיה התפקודי של מוח Vivo בהתבסס על סידן Bioluminescent המחוון GFP-aequorin

Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוא מודל טוב ללמוד תחבורה עצב, תאיים. . הנה, אני מתארת פרוטוקול ויוו הקלטה וניתוח התחבורה עצב, intraflagellar C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

הליך זה מוצג להמחיש החלבון קינאז פעילות בעכברים קבועים ומתנהגים. כתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז, tAKARα, מתבטאת בנוירונים בקליפת הגולגולת והפכה לנגישה להדמיה דרך חלון גולגולתי. מיקרוסקופ הדמיה של שני פוטון באורך החיים משמש כדי להמחיש פעילויות PKA ב vivo במהלך תנועה נאכף.

ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

פרוטוקול זה מציג שיטה להדמיית פעילות אוכלוסיה עצבית עם רזולוציה של תא יחיד במינים לא מהונדסים של חוליות באמצעות צבעים רגישים למתח ספיגה ומערך פוטודיודות. גישה זו מאפשרת זרימת עבודה מהירה, שבה ניתן לבצע הדמיה וניתוח במהלך יום אחד.

הדמיה אופטית מבוססת פוטודיודה להקלטת דינמיקה ברשת עם רזולוציית נוירון יחיד בבלתי חוליות לא מהונדסים

פרוטוקול זה מתאר יישומים של קיבוע מדגם באמצעות קרישי פיברין, הגבלת הסחף, ומאפשר הוספה ושטיפה של ריאגנטים במהלך הדמיה חיה. דגימות מועברות טיפה של פיברינוגן המכיל מדיום תרבות על פני השטח של כריכה, ולאחר מכן פילמור הוא המושרה על ידי הוספת תרומבין.

יישומים של קיבוע של רקמות Drosophila עם קרישי פיברין להדמיה חיה

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של צעדים כיצד להשתמש במערכת רב-תכליתית משולבת הניתנת לתכנות על-ידי המשתמש המאפשרת הדמיה רב-ערוצית אוטומטית וניתוח מכנוביולוגי כדי להבהיר את הרגישות המכנית של חלבון הקשור ל-Yes (YAP).

חקירה מכנוביולוגית כל אופטית של חלבון הקשורים כן בסרטן אנושי ותאים רגילים באמצעות מערכת רב תפקודית

כאן, אנו מדגימים כיצד לשלב טרנספקציה של נוירונים מכרסמים ראשוניים בהיפוקמפוס עם הדמיה קונפוקלית של תאים חיים כדי לנתח השפעות פתולוגיות המושרות על ידי חלבונים על הובלה אקסונלית ולזהות מסלולים מכניסטיים המתווכים השפעות אלה.

שימוש בדימות תאים חיים כדי למדוד את ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על תחבורה אקסונלית בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס

למד הדמיה בזמן אמת של טרנסלוקציית PKC בנוירונים חישניים של Aplysia באמצעות מיקרוסקופיית לייזר סריקה. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקת PKC בתגובה למגוירים שונים ומסייעת להבנת מנגנוני האיתות התאתיים.

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

גלה סרטונים נוספים