Name: שלפוחית השתן עכבר וול Injection (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 48 s
Description: למד טכניקת מיקרוכירורגיה להזרקת תאים לדופן שלפוחית השתן בעכבר. שיטה זו מאפשרת מיקום מדויק של השתלת תאים לחקר תאי גזע וסרטן שלפוחית השתן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

בהכרת תודה אנו מכירים את התמיכה מענק Pilot מקרן המחקר סטנפורד ילדים ו K08DK087895-01 מ NIDDK.

1. שלפוחית ​​השתן עכבר וול Injection בחירת זן העכבר, גיל, מין מוכתב על ידי הצרכים ניסיוני. אנו משתמשים בעכברים בין 8 ל 12 שבועות של גיל, שכן זהו חלון של בגרות החיסונית לקראת ההזדקנות. כקו מנחה כללי, עכברים צריכים להגיע לפחות שבוע לפני מניפולציה ניסויית על מנת למנוע מתח המושרה גורמים סותרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את משטח השולחן כירורגית עם מים וסבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את משטח השולחן כירורגית במשיכות Cide או מגבונים חיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מכשירי ניתוח נקי לפני השימוש בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, לחטא כלי ניתוח עם מעקר חרוז חם מיד לפני השימוש, וכן בין בעלי חיים במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניקוי מזרקים 100 μL המילטון 29 או 30 מד (1 / 2 אינץ ארוך) מחטים על ידי שאיפה חוזרות ההזרקה עם אלכוהול מוחלט לפני השימוש הראשון בסוף ההליך הכירורגי הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרחוץ ולשטוף מזרקים המילטון עם מעוקרים פוספט שנאגרו מלוחים בין כל חיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים ידי הצבתם בחדר אינדוקציה isoflurane, עם להגדיר את isoflurane בין 2-5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה כללית מושגת, להסיר את העכבר מהאולם ובמקום במצב שכיבה עם כרית חמה מתחת מנת לשמור על חום גוף תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג הרדמה תחזוקה ידי הצבת חוטם של החיה בנחיר המכיל לאדות isoflurane (טיטרציה של 1-3% על פי הצורך לשמור על הרדמה המתאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את עור הבטן עם קוצץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לעטוף חד פעמיות, כירורגי סטרילי כדי לכסות את פי הטבעת על מנת למנוע זיהום צואתי במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לעטוף שנייה חד פעמיות, כירורגי סטרילי כדי לכסות את שדה הניתוח (הבטן התחתונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכיני את הבטן עם שלוש חתיכות של גזה בבטאדין ספוג. חזור על שלב זה שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח עבור ההגדלה, לעשות חתך בבטן התחתונה קו האמצע עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את שלפוחית ​​השתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם השלפוחית ​​מלאה, חלקית לשחרר אותו על ידי לחץ כלפי מטה בעדינות על הכיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את הפתרון המדגם (עד 50 μL), באמצעות מחט 29 או 30 מד מזרק, בקיר של הכיפה שלפוחית ​​השתן (הזרקה עירונית) עם שיפוע של המחט פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את הבוכנה של המזרק להזריק את הפתרון מדגם לתוך הקיר שלפוחית ​​השתן. בועה היטב מקומי אינדיקציה זריקה מוצלחת של התאים בדופן שלפוחית ​​השתן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המזרק, לסגור את החתך עם קליפים הפצע ולאפשר העכבר כדי להתאושש על כרית חימום. </li></ol> 2. נציג תוצאות: בועה היטב מקומי שאינו נוזל דליפה ונשאר יציב בגודל אינדיקציה זריקה מוצלחת של התאים בדופן שלפוחית ​​השתן (איור 1). ניתוח היסטולוגית ניתן לבצע כדי לאשר את קיומו של התאים מוזרקים בדופן שלפוחית ​​השתן. <img src="/files/ftp_upload/2523/2523fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. דוגמה זריקה מוצלחת קיר שלפוחית ​​השתן באמצעות דיו הודו להמחשה. <img src="/files/ftp_upload/2523/2523fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. סכמטי של הפרוצדורות.

<ol><li>Dinney, C. P., Fishbeck, R., Singh, R. K., Eve, B., Pathak, S., Brown, N., Xie, B., Fan, D., Bucana, C., Fidler, I. J., Killion, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Metastatic+Variants+from+Human+Transitional+Cell+Carcinoma+Passaged+by+Orthotopic+Implantation+in+Athymic+Nude+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Metastatic Variants from Human Transitional Cell Carcinoma Passaged by Orthotopic Implantation in Athymic Nude Mice.</a> The Journal of Urology. 154, 1532-1538 (1995).</li>
<li>Singh, A. V., Franke, A. A., Blackburn, G. L., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soy+Phytochemicals+Prevent+Orthotopic+Growth+and+Metastasis+of+Bladder+Cancer+in+Mice+by+Alterations+of+Cancer+Cell+Proliferation+and+Apoptosis+and+Tumor+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Soy Phytochemicals Prevent Orthotopic Growth and Metastasis of Bladder Cancer in Mice by Alterations of Cancer Cell Proliferation and Apoptosis and Tumor Angiogenesis.</a> Cancer Res. 66, 1851-1858 (2006).</li>
<li>Yanagiuchi, A., Miyake, H., Nomi, M., Takenaka, A., Fujisawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+Microenvironment+by+Growth+Factors+Regulates+the+In+Vivo+Growth+of+Skeletal+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">Modulation of the Microenvironment by Growth Factors Regulates the In Vivo Growth of Skeletal Myoblasts.</a> BJU International. 103, 1569-1573 (2009).</li>
<li>Miyake, H., Hara, I., Yamanaka, K., Gohji, K., Arakawa, S., Kamidono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Bcl-2+Enhances+Metastatic+Potential+of+Human+Bladder+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Bcl-2 Enhances Metastatic Potential of Human Bladder Cancer Cells.</a> British Journal of Cancer. 79, 1651-1656 (1999).</li>
<li>Chancellor, M. B., Yokoyama, T., Tirney, S., Mattes, C. E., Ozawa, H., Yoshimura, N., Groat, W. C. de, Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+Results+of+Myoblast+Injection+into+the+Urethra+and+Bladder+Wall%3A+a+Possible+method+for+the+Treatment+of+Stress+Urinary+Incontinence+and+Impaired+Detrusor+Contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Neurourol+Urodyn%22%5BJournal%5D)">Preliminary Results of Myoblast Injection into the Urethra and Bladder Wall: a Possible method for the Treatment of Stress Urinary Incontinence and Impaired Detrusor Contractility.</a> Neurourol Urodyn. 19, 279-287 (2000).</li>
<li>Dinney, C. P., Tanguay, S., Bucana, C. D., Eve, B. Y., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravesical+Liposomal+Muramyl+Tripeptide+Phosphatidylethanolamine+Treatment+of+Human+Bladder+Carcinoma+Growing+in+Nude+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Intravesical Liposomal Muramyl Tripeptide Phosphatidylethanolamine Treatment of Human Bladder Carcinoma Growing in Nude Mice.</a> J Interferon Cytokine Res. 15, 585-592 (1995).</li>
<li>Mohamedali, K. A., Kedary, D., Sweeney, P., Kamaty, A., Davisy, D. W., Evey, B. Y., Huangy, S., Thorpez, P. E., Dinney, C. P., Rosenblum, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vascular-targeting+Fusion+toxin+VEGF121%2FrGel+Inhibits+the+Growth+of+Orthotopic+Human+Bladder+Carcinoma+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The Vascular-targeting Fusion toxin VEGF121/rGel Inhibits the Growth of Orthotopic Human Bladder Carcinoma Tumors.</a> Neoplasia. 7, 912-920 (2005).</li>
<li>Slaton, J. W., Perrotte, P., Inoue, K., Dinney, C. P., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-%CE%B1-mediated+Down-Regulation+of+Angiogenesis-related+Genes+and+Therapy+of+Bladder+Cancer+Are+Dependent+on+Optimization+of+Biological+Dose+and+Schedule%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Interferon-α-mediated Down-Regulation of Angiogenesis-related Genes and Therapy of Bladder Cancer Are Dependent on Optimization of Biological Dose and Schedule.</a> Clinical Cancer Research. 5, 2726-2734 (1999).</li>
<li>Yokoyama, T., Huard, J., Pruchnic, R., Yoshimura, N., Qu, Z., Cao, B., De Groat, W. C., Kumon, H., Chancellor, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-Derived+Cell+Transplantation+and+Differentiation+into+Lower+Urinary+Tract+Smooth+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Muscle-Derived Cell Transplantation and Differentiation into Lower Urinary Tract Smooth Muscle.</a> Urology. 57, 826-831 (2001).</li>
<li>Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Orthotopic+Models+for+Bladder+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">Mouse Orthotopic Models for Bladder Cancer Research.</a> BJU International. 104, 1286-1291 (1988).</li>
<li>Russell, P. J., Jelbart, M., Wills, E., Singh, S., Wass, J., Witherspoon, J., Raghavan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+new+human+bladder+cancer+cell+line+showing+features+of+squamous+and+glandular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a new human bladder cancer cell line showing features of squamous and glandular differentiation.</a> Int. J. Cancer. 41, 74-74 (1988).</li>
<li>Ahlering, T. E., Dubeau, L., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+model+to+study+invasion+and+metastasis+of+human+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A new in vivo model to study invasion and metastasis of human bladder carcinoma.</a> Cancer Res. 41, 6660-6660 (1987).</li>
<li>Heaney, J. A., Omellas, E. P., Daly, J. J., Lin, J. C., Rout, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+of+human+bladder+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Urol%22%5BJournal%5D)">In vivo growth of human bladder cancer cell lines.</a> Invest. Urol. 15, 380-380 (1978).</li>
<li>Hadaschik, B., Black, P., Sea, J., Metwalli, A., Fazli, L., Dinney, C., Gleave, M., So, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+mouse+model+for+orthotopic+bladder+cancer+using+transurethral+tumor+inoculation+and+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+International%22%5BJournal%5D)">A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumor inoculation and bioluminescence imaging.</a> BJU International. 100, 1377-1384 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שלפוחית ​​השתן עכבר הזרקת הקיר מאפשר להשתלה של תאים ספציפיים לאזורים מוגדרים של קיר שלפוחית ​​השתן. טכניקה זו יש יישומים רחב עבור מודלים העכבר של סרטן שלפוחית ​​השתן, שריר חלק, ביולוגיה של התא גזע. על פי ההגדרה, שלפוחית ​​השתן העכבר מאפשר הזרקה קיר המבוא של סרטן שלפוחית ​​השתן או בתאי גזע לתוך במיקום orthotopic כך הצמיחה שלהם בידול ניתן ללמוד בהקשר אנטומיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. למעשה, Dinney et al. הראשון שתיאר את הטכניקה הזו כדי ללמוד orthotopic האדם סרטן שלפוחית ​​השתן א...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Isoflurane (Aerrane) </td><td> בקסטר </td><td> NDC 10019-773-60 </td></tr><tr><td> 29 או 30 מד מחטים </td><td> המילטון </td><td> 7803-06 או 7803-07 </td></tr><tr><td> 100 microliter מזרק </td><td> המילטון </td><td> 7656-01 </td></tr></tbody></table>

שלפוחית ​​השתן עכבר וול injection

Mouse Bladder Wall Injection

שלפוחית ​​השתן עכבר הזרקת בקיר היא טכניקה יעילה כדי ללמוד orthotopically תופעות שלפוחית ​​השתן, כולל בתאי גזע, שריר חלק, ביולוגיה סרטן. לפני שמתחילים זריקות, באזור הניתוח יש לנקות עם מים וסבון אנטיספטי פתרון. ציוד כירורגי יש לעקר לפני השימוש לבין כל חיה. עכבר כל מושם תחת הרדמה נשאפים isoflurane (2-5% לזירוז,% 1-3 לצורך תחזוקה) ושלפוחית ​​השתן שלה נחשף על ידי ביצוע חתך בבטן קו האמצע עם מספריים. אם השלפוחית ​​מלאה, היא decompressed חלקית על ידי סחיטה עדינה בין שתי אצבעות. ההשעיה התא עניין מוזרק intramurally בקיר הכיפה שלפוחית ​​השתן באמצעות מחט 29 או 30 מד 1 סמ&quot;ק או מזרק קטן. הפצע סגור ולאחר מכן באמצעות קליפים הפצע העכבר מותר להתאושש על כרית חימום. קיר הזרקת שלפוחית ​​השתן היא טכניקה microsurgical עדין שניתן לשליטה באמצעות תרגול.

שלפוחית ​​השתן עכבר הזרקת הקיר היא גישה יעילה orthotopically מחקר גזע שלפוחית ​​השתן התא וביולוגיה סרטן. שיטה זו microsurgical עדין ניתן לשלוט בטכניקה תרגול זהיר.

שלפוחית ​​השתן עכבר וול Injection

הזרקה לדופן שלפוחית השתן של עכבר היא טכניקה שימושית למחקר אורטוטופי של תופעות בשלפוחית השתן, כולל ביולוגיה של תאי גזע, שריר חלק וסרטן.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להחדיר תאים לאזורים מוגדרים בדופן השלפוחית. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע חתך בבטן כדי לחשוף את השלפוחית. השלב הבא של ההליך הוא החדרת שיפוע המחט (bevel) לתוך דופן השלפוחית (intramurally).השלב האחרון של הפרוצדורה הוא לחיצה על בוכנת המזרק כדי להזריק את התאים הרלוונטיים לתוך דופן השלפוחית. השתלה מוצלחת של תאים מתאפיינת ביצירת שלפוחית (bleb) ממוקמת היטב שאינה דולפת נוזלים ונשארת יציבה בגודלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון חיסון תאי של עכברים דרך השופכה, הוא שהיא מאפשרת להכווין את המקום שבו התאים ישתבצו בתוך השלפוחית.הדגמה חזותית של השריר היא קריטית, שכן קשה ללמוד את מיקומי ההזרקה. ידיעה של הזווית הנכונה ומיקום הכניסה של המחט לשלפוחית השתן חיונית להצלחת הטכניקה. בחרו את הגיל, המין וזן העכברים בהתאם לצרכי הניסוי במקרה זה.עושים שימוש בעכברים בני 8 עד 12 שבועות; ראשית, נקה את פני השולחן הכירורגי עם סבון ומים. לאחר מכן, נגב את פני השולחן הכירורגי בעזרת מגבונים רב-פעמיים או מגבונים אנטיספטיים. יש לעקר את המכשירים הכירורגיים באוטוקלבה לפני הניתוח.נגב את המכשירים ב-70% ethanol ממש לפני השימוש, ועקר אותם מחדש באמצעות מכשיר עיקור בחרוזי חום (hot bead sterilizer) בין ניתוחים בודדים. נקה מזרקת Hamilton בנפח 100 microliter המחוברת למחט בכילוי 30 ע

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה ידגים שיטות להשראת זיהומים בדרכי השתן של עכברים בדרך התסתתית (transurethrally) ולכימות היקף הזיהומים שנוצרו.

אינדוקציה Transurethral של דלקת בדרכי השתן עכבר

Cystometry היא טכניקה יעילה למדידת תפקוד שלפוחית ​​שתן של בעלי חיים...

השימוש בCystometry במכרסמים קטנים: חקר Chemosensation שלפוחית ​​השתן

הקמת מודל orthotopic גידול בשלפוחית ​​השתן להעריך את ההשפעות נוגדות הגידולים של סרנה נמסר intravesically וצמיחה ניטור הגידול והדמיה על ידי אולטרסאונד bioluminescent.

שלפוחית ​​השתן Orthotopic גידול דגם ואת הערכת טיפול סרנה השלפוחית

מקור: O'Brien, V. P., ואחרים, זיהום שובב בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם מחשיפת שלפוחית השתן בגרדנרלה בנרתיק בעכברים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ אלקטרוני סורק כדי להמחיש קולוניזציה חיידקית ואינטראקציות בין מאכסן-פתוגן באפיתל השלפוחית של מודל עכבר שנדבק מראש.

הכנת רקמת שלפוחית השתן של העכבר להמחשת זיהום חיידקי

בסרטון זה אנו מתארים השתלה אורתוטופית של אורגנואידים מגידול בשלפוחית השתן בתרבית לתוך שלפוחית השתן כדי לחקור את תפקידה של סביבת האיברים בהתפתחות גידולים.

מודל אורגנואיד של גידול בשלפוחית השתן: שיטה להשתלה אורתוטופית של אורגנואידים משלפוחית השתן למושתלת שלפוחית השתן

בסרטון זה, אנו מתארים את ההליך התוך-שלפוחית של העברת תאים סרטניים לשלפוחית השתן של מודל עכבר. הליך זה מסייע ליצור מודל גידול אורתוטופי בשלפוחית השתן שניתן להשתמש בו לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

מידול גידול אורתוטופי בשלפוחית השתן במודל עכבר: הליך למתן תוך שלפוחית של תאים סרטניים לשלפוחית השתן

הטכניקה המבוססת לחסן xenografts orthotopic פולשנית העיקרית לסרטן שלפוחית ​​השתן דורשת laparotomy והתגייסות של שלפוחית ​​השתן. הליך זה גורם תחלואה משמעותית בעכברים, הוא מאתגר מבחינה טכנית ודורש זמן רב. לפיכך, אנו פיתחנו דיוק גבוה, בגישה מלעורית ניצול הנחיית אולטרסאונד.

פולשנית הקמת Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן xenografts

כ 3-8,000,000 אנשים בארצות הברית סובלים מתסמונת כאב ביניים דלקת שלפוחית ​​השתן / שלפוחית ​​השתן (IC / BPS), מצב של חולשה מתאפיינת בחלקו על ידי כאבים באגן. על מנת ללמוד תרומות מערכת עצבים למצב, מודל פיסיולוגי של כאב שלפוחית ​​שתן נמצא בשימוש בעכברים וחולדות.

תגובות שתן בשלפוחית ​​השתן ההתנפחות העוררת Visceromotor כמודל לשלפוחית ​​שתן כאב בעכברים

פרוטוקול זה מתאר את הדור של גידולים בשלפוחית ​​השתן בעכברים orthotopic אצל נקבות עכברים C57BL / 6J ועל ניטור של הגידול.

מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן סרטן מערכת איתור

החדרה-transurethral תהליך מאתגר, לא טוב תואר בספרות. מטרתו של כתב יד זה הוא לתיאור טכניקה עבור החדרת צנתר למסירה intravesical של נוזלים עם חומרים פעילים אל תוך שלפוחית השתן ו/או הערמונית בעכברים זכרים בוגרים של-transurethral.

הליך ההתקנה-transurethral עכבר זכר בוגר

למד טכניקת מיקרוכירורגיה להזרקת תאים לדופן שלפוחית השתן בעכבר. שיטה זו מאפשרת מיקום מדויק של השתלת תאים לחקר תאי גזע וסרטן שלפוחית השתן.

שלפוחית ​​השתן עכבר וול Injection

גלה סרטונים נוספים

שלפוחית השתן עכבר וול Injection