זיהום תת עורי של סטפילוקוקוס אוראוס עמיד Methicillin (MRSA)

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את השרידות וההפצה של staphylococcus aureus העמיד למתיצילין או MRSA, וכן את רמות הכמוקינים והציטוקינים באתרי הזיהום. דבר זה מושג על ידי הסרת הפרווה מגבם של עכברים כדי לאפשר אזור תצפית ברור. כשלב שני.

MRSA בתגסה יוזרק לעכברים תת-עוריים שלושה ימים לאחר ההדבקה; ניתן להעריך את הפתולוגיות של ההדבקה ואת מספר החיידקים על ידי קביעת מספר היחידות יוצרות המושבות (CFU) ממיהומי רקמה על צלחות אגר. שלום, מה שלומך? שמי דה לורדון.

אני חוקרת פוסט-דוקטורט. שלום, שמי מאריאל סאנצ'ז. אני דוקטורנטית ואני אנדריאה הודה.

אני עמית מחקר, ואנו חלק מהמעבדה של George Lee במחלקה הפדיאטרית במרכז הרפואי Cedar-Sinai. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הרפואי, כגון מידול של זיהומים חמורים, כולל מיוזיטיס (myositis), פולימיוזיטיס (polymyositis) ופסציטיס נמקית (necrotizing fascitis). למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי זיהומי חירום חמורים, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות כגון group A streptococcus ומיקרואורגניזמים אחרים.

בנוסף, אנו יכולים לחקור את התפקוד והפתוגנזה של אורגניזמים אחרים הגורמים למיאוזיטיס (myositis) ולפולימיאוזיטיס (polymyositis). באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בפרוצדורה זו עלולים להיתקל בקשיים מאחר שאחד הרגולטורים הגלובליים של אזורי ה-caucus בקרב הצוות הוא בעל נטייה גבוהה למוטציות. אם לא יינקטו אמצעי זהירות, הנתונים שנאספו עשויים להראות שונות משמעותית, דבר שיוביל לקושי בפרשנות של הנתונים.

נתחיל בעבודה. במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL 2), הכינו צלחת אגר דם כבשים על בסיס TSA ולולאה סטרילית באמצעות בלוק הקפאה. העבירו את תרבית המקור של ה-Mercer מאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, בעזרת הלולאה הסטרילית, גרדו שבב קרח קטן מתרבית המקור אל הצלחת. לאחר השגת שבב קטן מתרבית המקור של Mercer, העבירו מיד את תרבית המקור בחזרה למקפיא כדי למנוע הפשרה, שכן הקפאה והפשרה חוזרות יפגעו בתרבית המקור. השתמשו בלולאה כדי לבצע ריסוס (streaking) על האגר, כדי לאפשר צמיחה של מושבות Mercer בודדות.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה, ללא תוספת CO2. למחרת, הכינו וסמנו both דף דם ביצה (blood egg) חדש, צלחת TSA, ומבחנה עם מכסה (snap cap) בנפח 15 מיליליטר המכילה 3 מיליליטר של THB.

הוציאו את צלחת ה-M SSA שגודלה למשך לילה ובחנו את הפנוטיפ ההמוליטי של המושבות. באמצעות לולאה סטרילית, בחרו מושבה בעלת פנוטיפ התואם למושבות בניסויים קודמים. זרעו את ה-THB באמצעות המושבה הנבחרת תוך שימוש באותה שיטת מריחה בלולאה.

דגרו את הפלטה עם תמיסת ה-THB בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה, תחת ניעור ב-220 rpm. חיידקים אלו ישמשו להחדרה לתרבית לצורך ה闹יכת זיהום תת-עורי בעכברים בשלבים מאוחרים יותר. הכניסו גם את פלטת ה-blood agar לאינקובטור.

הפלטה תשמש למחרת בבוקר כדי לאשר שהפנוטיפ ההמוליטי של החיידקים בתמיסת ה-THB תואם לזה של המושבה שנבחרה במקור. אם הפנוטיפ ההמוליטי אינו עקבי עם השבט המקורי, אין להתחיל בניסוי. העבירו את העכבר למסד וגזרו את הפרווה מגבו.

אם בעל החיים תוקפני מדי, ייתכן שיהיה צורך בטשטוש באמצעות isof fluorine. יש למרוח כ-5 mm³ של קרם להסרת שיער, כגון NA, על האזור הגזור. ניתן לרכוש NA בבית המרקחת המקומי.

יש לוודא שרוכשים את קרם הסרת השיער המכיל שמן תינוקות, מכיוון שהמוצר ללא שמן התינוקות יגרום לגירוי רב מדי עבור העכברים. יש להניח לקרם להשפיע על פני העור למשך כדקה אחת; בזמן שהקרם להסרת השיער פועל, הרטיבו מספר מגבונים נייר במים מזוקקים פעמיים. לאחר דקה, השתמשו במגבונים הנייר הרטובים כדי לנקות את האזור הגזור.

וודאו שהעור נקי משאריות קרם להסרת שיער. חממו מראש 10 milliliters של THB בתוך מבחנה עם פקק הברגה של 50 milliliters בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור לבקטריות למשך ארבע עד 10 שעות. העבירו 20 microliters של תרבית בקטריות מהלילה ל-THB שחומם מראש. פעולה זו תדלל את ה-merc מהלילה.

סספנסיה בדילול של 1:500. הנח את המבחנה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור נער ב-220 rpm למשך כשעתיים וחצי עד שלוש שעות. לאחר תקופת האינקובציה, השתמש בכמות נוספת של THB כדי לדלל עוד יותר את סספנסיית החיידקים לדילול של 1:10 ומדוד את הסספנסיה באמצעות ספקטרופוטומטר.

בבליעת אור באורך גל של 514 ננומטר. המשך לדגרה של התרחף ב-37 °C תוך ניעור ב-220 סל"ד עד שהתרחף בדילול 1:10 מגיע ל-0.25. כדי לאסוף את ה-M er, סבב במערך צנטריפוגה את המבחנה בנפח 50 מיליליטר ב-3,225 ×g למשך 10 דקות ב-4 °C, השלך את הסופנאט ובצע Resus.

שו suspended את משקע החיידקים ב-10 milliliters של DPBS ושטוף את החיידקים שוב על ידי חזרה על שלב הצנטריפוגציה עבור מודל זיהום חמור זה. שו suspended שוב את משקע החיידקים בכ-one milliliter של DPBS, כך שיתקבל ריכוז של כ-1 × 10¹⁰ colony forming units per milliliter. הכן מראש צלחות A-R-T-S-A עם דם כבשים ובצע דילול סדרתי של החיידקים מ-10⁻¹ עד 10⁻⁸ ב-DPBS.

טפטפו 10 µL מתמיסת החיידקים המדוללת בסדרה על גבי צלחת blood agar בשלוש חזרות. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. לאחר דגירה של 16 עד 18 שעות, צפו ורשמו את פנוטיפ ההמוליזה של התרבית שנוגחה.

ספרו את יחידות יוצרי המושבות (CFU) על הצלחות. מינון האינוקולום של הזיהום יחושב בהתבסס על מספר יחידות יוצרי המושבות על הצלחות.

הכינו מזרק עם 100 µL של תרחיף החיידקים ב-DPBS שהוכן קודם לכן. לפני ההזרקה, יש להרגיע את העכברים כך שקצב הנשימה שלהם יהיה בערך פעימה אחת לשנייה. לצורכי הדגמה, בסרטון זה מוצג עכבר שהורדמה.

הזריק את ה-M ser לצד אחד לאחר ההזרקה. העבר את העכבר חזרה לכלובו. עקוב אחר בעלי החיים במשך שלוש עד חמש שעות לאחר ההזרקה כדי לוודא שהעכבר חי לפני ההחזרה לחדר בעלי החיים.

יש לעקוב מדי יום אחר הגעליים על גבם של בעלי החיים לאחר השחטה. יש למדוד ולתעד את הגודל ואת מצב הגעליים על העור. שטחי הגעליים בעור ובשריר מחושבים על ידי הכפלת אורך הגלה ברוחבה במילימטרים.

יש לחלק נגעים בעלי צורה לא סדירה לחלקים סימטריים קטנים יותר ולמדוד כל חלק באותה שיטה. הכין מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter עם 100 microliters של DPBS לאיסוף רקמות. חתוך חריץ בעור באמצעות להב תער סטרילי והוצא את הנגע בעזרת מספריים סטריליים.

בעת כריתת הנגע, ודאו שנקריתו גם כ-שני עד חמישה מילימטרים של עור בריא סביב האזור. הכניסו את הנגע למבחנות לאסוף רקמות לצורך ניתוח של נגעי השריר. קלפו את העור בזהירות כדי למדוד את הגודל ולהס기 את מצב הנגע על רקמת השריר.

אספו את הטחול והכליות. הניחו רקמות אלו בפסנטות איסוף נפרדות. הומוגניזו את הרקמות על ידי ערבוב באמצעות מזרק של 1 mL למשך כ-30 שניות.

הוסף 900 µL של DPBS לכל מבחנה. הכן פלטות THA ומערבל במערבל Vortex את דגימות הרקמה ההומוגניות למשך חמש דקות. בצע דילול סדרתי לדגימה.

יש לדלל את התרחיפים עד פי 10⁶. בלוחיות 96 בארות, יש להעביר 10 µL מכל תרחיף שדולל בסדרה אל תוך הלוחיות. יש להדגיר את הלוחיות באינקובטור לבקטריות בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה.

בבוקר למחרת, ספרו את היחידות יוצרות המושבות (colony forming units) מהצלחות וחשבו את מספר היחידות יוצרות המושבות על בסיס גורמי הדילול. אם ההדבקה בוצעה כהלכה, תיראה שלפוחית על פני העור מיד לאחר ההזרקה התת-עורית. אם לא נצפתה שלפוחית, ייתכן שההזרקה הייתה עמוקה מדי, דבר שעלול להשפיע על תוצאות ההדבקה.

ניתן להעריך את גודל הנגע ואת הישרדות החיידקים בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה ב-MSA. נגעים עוריים הבאים נבחנו ביום השלישי לאחר ההדבקה, והם מהווים דוגמאות לנגע בעכבר CD1 שהודבק בצד אחד ב-1 × 10⁷ יחידות יוצרות מושבה (colony forming units). נגעים בשריר נמצאים בדרך כלל ברקמה שמתחת לנגעים העוריים.

להלן דוגמאות לנגעים תואמים על פני השטח של השריר עבור תצלומי נגעי העור שהוצגו קודם לכן. אלו הם נגעי שריר שנצפו ביום השלישי לאחר ההדבקה בעכבר שהודבק ב-1×10⁷ colony forming units. שטח הנגע נקבע לפי האורך כפול הרוחב של הנגע כפי שנמדד במילימטרים, וניתן למדוד אותו כדי להעריך את נזקי הרקמה בעור.

ניתן לכמת את מספר יחידות יוצרי המושבות (CFU) של החיידקים הממוקמים באתר הזיהום בנגעים שנכרתו. ספירת יחידות יוצרי המושבות יכולה להעיד האם גורם virulent מעניק ל-MSA יתרון הישרדותי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש באמצעי הבטיחות הסטנדרטיים בשל השימוש במחטים ובמיקרובים פתוגניים ביותר בעקבות הליך זה.

אחרון כמודל מורסה, אנחנו משתמשים במינון חיסון נמוך פי 1,000 בהשוואה למודל שלנו, אשר יכול לשמש למענה על שאלות נוספות כגון מהם הגורמי S המעודדים זיהום RSA מתמשך? אל תשכחו שעבודה עם מזרקים מלאים ב-Mars A עלולה להיות מסוכנת ביותר, ובמידה וננקטים אמצעי זהירות כגון השלכה ישירה של המזרק למכל פסולת חדה, חשוב להימנע מדקירה מקרית על ידי המחט. כמו כן, עבור ניסוי זה, חשוב לפעול לפי פרוטוקולי BSO2 סטנדרטיים כדי להבטיח חיטוי נאות של אזור העבודה.

זהו זה. תודה שצפיתם. היי. היי, ביי.