Name: הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: למדו שיטה חישובית לקביעת טרופיזם HIV באמצעות ריצוף אוכלוסייה של אזור V3 ואלגוריתם geno2pheno. שיטה זו מאפשרת זיהוי שימוש בקו-רצפטורים R5 או non-R5 לטיפול אנטי-רטרווירלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

פיתוח assay זו נתמכה על ידי Viiv בריאות המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) ובאמצעות יו&quot;ר GlaxoSmithKline / CIHR ב וירולוגיה קלינית של ד&quot;ר הריגן. תמיכה הניתנים על ידי פייזר Viiv בריאות.

<ol><li>Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+cofactor%3A+functional+cDNA+cloning+of+a+seven+transmembrane%2C+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor.</a> Science. 272, 872-877 (1996).</li>
<li>Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+into+CD4%2B+cells+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+CC-CKR-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5.</a> Nature. 381, 667-673 (1996).</li>
<li>Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+%28UK-427%2C857%29%2C+a+potent%2C+orally+bioavailable%2C+and+selective+small-molecule+inhibitor+of+chemokine+receptor+CCR5+with+broad-spectrum+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).</li>
<li>Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+for+previously+treated+patients+with+R5+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).</li>
<li>Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+versus+efavirenz%2C+both+in+combination+with+zidovudine%2Flamivudine%2C+for+the+treatment+of+antiretroviral-na%C3%ADve+subjects+with+CCR5-tropic+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1.</a> J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).</li>
<li>Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trofile+HIV+co-receptor+usage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Med.+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Trofile HIV co-receptor usage assay.</a> Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).</li>
<li>Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+HIV+co-receptor+usage+based+on+genetic+and+clinical+covariates%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Ther%22%5BJournal%5D)">Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates.</a> Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).</li>
<li>Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).</li>
<li>Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).</li>
<li>Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Detection+of+CXCR4-Using+HIV+by+V3+Genotyping%3A+Application+of+Population-based+and+%27Deep%27+Sequencing+to+Plasma+RNA+and+Proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+determination+of+HIV-1+tropism+in+the+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting.</a> HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).</li>
</ol>

ריצ&#39;רד פ &#39;הריגן יש ניגודי אינטרסים עם Viiv בריאות, Virco, מרק, אבוט, Quest ו. זה וידאו מאמר בחסות Viiv בריאות.

השיטה המוצגת כאן היא שיטת סידור סטנדרטי ליישם בדיקות כמיהות. היישום הקליני של לולאה המעטפה HIV V3 רצף לחזות כמיהות ויראלי יש עד מאוחר היה מוגבל. שיטה זו הוכח, בניתוח רטרוספקטיבי של (Viiv Healthcare) ניסויים קליניים maraviroc, להיות לפחות באותה מידה מסוגל לחזות כמיהות ויראלי בהשוואה מבחני תוקף אחרים המשמשים קלינית. ישנם יתרונות רבים על ביצוע ניתוח genotypic של הלולאה V3 לחיזוי כמיהות. בראש ובראשונה, הליך זה יכול להתבצע בכל מתקן עם ציוד רצף תפעולי, מאוד להגדיל את הנגישות וצמצום זמן אספקה ​​של בדיקות כמיהות. לשם השוואה, Trofile פנוטיפי משופר רגישות Assay (esta) (Monogram Biosciences), אשר שימש תקן הזהב עבור בדיקות כמיהות, מבוצע במרכז ואחד בדרום קליפורניה. יתרונות נוספים כוללים את הדרישה של חומר המוצא פחות עומס מינימלי הנדרש פלזמה ויראלי של 500copies/mL. כמו כן, את עלויות התפעול של הפעלת assay genotypic נמוכים יחסית לאלה של assay פנוטיפי. השימוש בתוכנה להיזכר בפרט מבטלת את הדרישה לבדיקה רצף ידני, שנוטה להיות חלק אינטנסיבית העבודה של מנתח גנוטיפ. השיטה המוצגת כאן היא פשוטה למדי, עם כל צעד מסוים outweighing אחר חשיבות. אנו כן ממליצים לרוץ PCR וסדר בשלושה עותקים כדי להגדיל את הסיכויים של מינים לכידת מיעוט בתוך האוכלוסייה ויראלי של מדגם. משכפל יותר משלושה יכול להתבצע, אולם מצאנו triplicates להיות גם יעיל ואמין. כמו כן, אנו ממליצים להשתמש צעד אחד לאחור transcriptase PCR Kit (Qiagen) אשר מבצעת הן RT-PCR ו הראשון בסיבוב PCR בתגובה דומה, תוך שמירה על רגישות וספציפיות גבוהה.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;מיצוי RNA באמצעות NucliSens easyMAG גרסה 1.0&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Magnetic Silica</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280133</td><td>(48 x 0.6 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Lysis Buffer</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280134</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280130</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280131</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280132</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG גרסה 1.0</td><td>bioMerieux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מ প্রশংসת בטיחות ביולוגית Class II A2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RT-PCR בצעד אחד ו-PCR של סבב שני&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מים מטופלים ב-DEPC</td><td>Ambion</td><td>cat. # 9922</td><td></td></tr><tr><td>מערכת SuperScrip III One-Step RT-PCR עם Platinum Taq High Fidelty</td><td>Invitrogen</td><td>cat#12574-035</td><td>מרכיבי ערכה שנעשה בהם שימוש:&lt;br/&gt;- תערובת אנזימים SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty&lt;br/&gt;- תערובת תגובה 2X (בופר המכיל 0.4mM מכל dNTP, 2.4mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>מערכת Expand High Fidelity PCR</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 1 759 078</td><td>מרכיבי ערכה שנעשה בהם שימוש:- בופר Expand High Fidelity ריכוז 10X עם 15 mM MgCl2 (מכסים המסומנים ב-2)- תערובת אנזימים Expand HF PCR (3.5U/&amp;#x03BC;l)- תמיסת מלאי MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (25mM) (מכסים המסומנים ב-4)</td></tr><tr><td>dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 11969064001</td><td>(100 mM)</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן של ברומופנול כחול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# B5525</td><td></td></tr><tr><td>קרזול אדום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# 114472-5G</td><td>בדרגת אינדיקטור</td></tr><tr><td>תרמוסייקלר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;אלקטרופורזה של ג'ל&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בופר TAE 50X</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 24710030</td><td>(1000 ml)</td></tr><tr><td>צבע ג'ל DNA מסוג SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # S33102</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז (בדרגת טהרה גבוהה)</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 15510-027</td><td></td></tr><tr><td>סולם DNA כמותי לטווח נמוך E-Gel</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 12373-031</td><td></td></tr><tr><td>מים מסוג Reagent Grade Type II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת ג'ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ריצוף&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת ריצוף ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4337458</td><td>(25000 תגובות)</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4311320</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S-2889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat.# 03690-100ML</td><td>0.5M, pH=8.0</td></tr><tr><td>תמיסת בופר TRIZMA Hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # T-2819</td><td>1 M, pH 9.0</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # M-1028</td><td>1 M</td></tr><tr><td>אתנול 95%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בופר הרצה (10X) עם EDTA</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 4335613</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Polymer Pop-7 (25mL) או Polymer Pop-7 (10mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 44363929 or cat. # 4352759</td><td></td></tr><tr><td>ערכת סטנדרט לריצוף 3700/3730 BigDye Terminator v3.1</td><td>Applied Biosciences</td><td>Cat# 4336943</td><td></td></tr><tr><td>תרמוסייקלר</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה עם מחזיקי פלטות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מנתח DNA מסוג 3730xl</td><td>Applied Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הסקה genotypic של כמיהות hiv-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של v3

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

רקע: לפני קבלת התרופה ממעמד CCR5-אנטגוניסט ב-HIV הטיפול, המטופל חייב לעבור בדיקת איידס כמיהות לאשר שלו או שלה האוכלוסייה ויראלי משתמש coreceptor CCR5 לכניסת הסלולר, ולא coreceptor חלופיים. גישה אחת כמיהות הבדיקה היא לבדוק את הרצף של האזור V3 של מעטפת ה-HIV, אשר אינטראקציה עם coreceptor. שיטות: רנ&quot;א נגיפי מופק פלזמה דם. האזור V3 מוגבר בשלושה עותקים עם מקוננות הפוך transcriptase-PCR. Amplifications הם רצף אז ונותחו באמצעות התוכנה, RE_Call. רצפים מוגשים לאחר מכן אלגוריתם bioinformatic כגון geno2pheno להסיק כמיהות ויראלי מאזור V3. רצפים הם מוסק להיות בלתי R5 אם שיעור חיובי כוזב geno2pheno שלהם יורדת מתחת 5.75%. אם כל אחד משלושת רצפים ממדגם הוא להסיק כי לא R5, החולה לא סביר להגיב אנטגוניסט-CCR5.

HIV כמיהות ניתן להסיק באזור V3 המעטפה ויראלי. V3 הוא PCR מוגבר בשלושה עותקים באמצעות מקוננות RT-PCR, רצף, ופירשו באמצעות תוכנת bioinformatic. דוגמאות עם רצף עם 1 או יותר (ים) עם ציונים נמוכים g2P מסווגים וירוס לא R5.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

רקע: לפני קבלת תרופה מקבוצת מעכבי CCR5 בטיפול ב-HIV, המטופל חייב לעבור בדיקת טרופיזם של HIV כדי לאשר ש...

המטרה הכללית של הליך זה היא להסיק את הטרופיזם הנגיפי בחולה נגוע ב-HIV על ידי ריצוף של אזור ה-V3 בגן המעטפת הנגיפי. ראשית, יש לחלץ H-I-V-R-N-A מפלזמה של דם המטופל. לאחר מכן, יש להגביר את אזור ה-V3 של HIV GP one 20 באמצעות nested R-T-P-C-R. לאחר מכן, יש לזהות את נוכחות התוצר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל, ולאחריה ריצוף מבוסס אוכלוסייה של תוצרי ה-V3 שהוגברו.לבסוף, נתחו את הרצפים באמצעות תוכנה לקריאת בסיסים (base calling) והסיקו את השימוש בקו-רצפטור באמצעות אלגוריתם genome to pheno. בסופו של דבר, תוצאות אלו יכולות להראות האם אוכלוסיית הווירוסים של המטופל היא R5 או non-R5, באמצעות ריצוף מבוסס אוכלוסייה של לולאת V3 של HIV. לפיכך, היתרון המרכזי של בדיקת לולאה (troop assay) זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות פנוטיפיות מבוססות תאים, הוא שניתן לבצעה בכל מעבדה המצוידת במכשיר ריצוף, בעלות מופחתת, בזמן קצר יותר ובכמות קטנה יותר של חומר התחלתי.טכניקה זו רלוונטית לטיפול באמצעות תרפיה אנטי-רטרו-ויראלית מכיוון שהיא יכולה לזהות אם אוכלוסיית הנגיפים של המטופל צפויה להגיב למעכב CCR5 מתוך 500 µL של פלזמה. השתמש במערכת מיצוי אוטומטית EasyMag כדי למצות HIV RNA. כעת, עבור לחדר נקי עבור PCR כדי להכין את ה-RT-PCR, וזאת על מנת להבטיח דגימה נאותה של אוכלוסיית הנגיפים.תכננו לבצע כל תגובת שכתוב הפוך בשלוש חזרות בתגובה חד-שלבית זו. השתמשו ב-RNA ויראלי להסינתזה של CDNA, תוך הגברה ספציפית של אזור HIVV three באמצעות הפריימרים SQV three F1 ו-CO 6 0 2 prime. התבססו על רכיבי התגובה עבור תגובה בודדת.הכינו תמיסתו תערובת מלאי (stock mix) בכמות המספיקה למספר הדגימות המיועדות להגברה באמצעות פפית חוזרת (repeater pipette). הוסיפו 36 µL מתערובת הדגימה לכל באר בלוח ה-PCR. כעת עברו להשתמש בפפית רב-ערוצית כדי להעביר מיקרוליטרים של תמצית דגימת RNA לכל אחת מהבאערים הייעודיות. הקפידו להחליף טיפים בין כל הוספה.עם השלמת ההעברה, כסו את הבארות באמצעות מכסי פסים עבור PCR. לאחר מכן, הניחו את פלטת ה-PCR במכשיר תרמוסייקלר שתוכנת לביצוע R-T-P-C-R שלב אחד עבור אזור HIVV three. עבור ה-nested PCR, השתמשו בפריימרים SQV three F two ו-CD four R.חשב את כמות הריאגנט הדרושה עבור מספר הדגימות המיועדות להגברה בחדר נקי ל-PCR. הכן את תערובת ה-nested PCR ולאחר מכן השתמש בפפית רב-ערוצית (repeater pipette) כדי לחלק 19 µL לכל באר בלוח PCR נקי. עם סיום ה-R-T-P-C-R, עבור לחדר לאחר הגברה.השתמשו בפיפט רב-ערוצי בעל שמונה ערוצים כדי להעביר 1 µL של תבנית ה-R-T-P-C-R אל תערובת ה-nested PCR. החליפו קצוות (tips) בין כל הוספה. כסו את הבארות עם מכסי פסים של PCR והעבירו את הפלטה למכשיר תרמוסייקלר (thermocycler) לצורך הגברה.הוצא את הפלטה מהתרמוסייקלר לאחר שהטמפרטורה חזרה ל-25 °C. כדי לאשר שאזור V3 הועתק בהצלחה, נתח תחילה את התוצרים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. הכן ג'ל agarose בריכוז 1.6% עם צבע ג'ל cyber safe.השתמשו בפיפט רב-ערוצי של 10 µL. העבירו דגימות PCR של 8 µL לבארים המתאימות. כמו כן, טענו סולם DNA לפחות לאחת הבארים בכל שורה.הריצו את הג'ל במתח של כ-100 volts למשך 10 דקות. הדמינו את הפסים באמצעות פלואורסצנציית ultraviolet ותעדו את התמונה באמצעות צילום. רשמו את הדגימות שבהן כל שלוש השכפולים של ההגברה הצליחו.במידת הצורך, חזרו על ה-R-T-P-C-R עבור אותן דגימות שבהן הושגו פחות משלוש הגברות של המוצר. דגימות ה-CDNA הוויראלי שהוגברו יאומתו בהמשך על ידי תגובות ריצוף DNA שיבוצעו באמצעות הפריימרים V 3 0 2 F ו-S QV three R one. הוציאו את ריאגנט ה-big di מהמקפיא והפשירותו בטמפרטורת החדר.חשב והכן את הריאגנטים הדרושים עבור מספר הדגימות המיועדות להרצה. חלק חמישה µL של תערובת תגובת הריצוף לבארי הפלטה המתאימים באמצעות פיפט רב-ערוצי. כסה את הפלטה בנייר ניגוב מסוג Kim wipe והסט אותה הצידה.בינתיים, הכין דילול של 1:15 לתוצר ה-PCR המוגבר על ידי הוספת 180 microliters של מים סטריליים לתוצר ה-PCR שנותר. העבר באמצעות פיפטה מיקרוליטר אחד של הדגימה המדוללת לתחתית הפלטה המתאימה. החלף תמיד טיפים בין דגימות לאחר השלמת העברת הדגימה לבארות.אטמו את הפלטה באמצעות מכסי פס (strip caps) וערבבו במערבל Vortex למשך שנייה אחת. כדי לסובב את הפלטה בצנטריפוגה, הגדירו את המהירות ל-140 5G. כאשר מהירות הסיבוב תגיע ל-140 5G, עצרו את הסיבוב.הניחו את הפלטה בטרמוסייקליר (thermocycler) להמשך התגובה. בכל באר, השקיפו את ה-DNA באמצעות 4 µL של sodium acetate בריכוז 3 M ו-40 µL של 95% Ethanol קר, וסגרו חזרה את הפקקים. ערבבו את הפלטה ב-Cortex למשך 10 שניות והקישו על הפלטה כדי להוציא בועות אוויר.הנח את הפלטות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעתיים. השג את ה-DNA באמצעות סנטריפוגציה ב-2000 G למשך 20 דקות. הסר והשליך את מכסי הפס (strip caps).הפוך את הפלטה מעל מיכל הפסולת ושפוך את הנוזל העליון. הסר שאריות של נוזל עילי על ידי ספיגת הפלטות ההפוכות בנייר סופג.קפלו שני דפי נייר סופג כדי להקיף את הצלחת. הניחו את הצלחת כשהפנים כלפי מטה בצנטריפוגה וסובבו ב-140 5G. עצרו את הסיבוב כאשר היא מגיעה ל-140 5G.לאחר מכן, שטפו עם 155 µL של 95% ethanol ושפכו את הנוזל. חזרו על הצנטריפוגה. הניחו לפלטה למשך שתי עד חמש דקות כדי לאפשר לשאריות האתנול להתאדות.כדי לדנטור את דגימות ה-DNA, השתמשו בפיפטא רב-ערוצית כדי לחלק 10 µL של high dye for maide לכל הבארים בלוחית, כולל אלה שנותרו ריקות. אטמו את הלוחית באמצעות septima והכניסו אותה לתרמוסייקלר בטמפרטורה של 90 °C למשך שתי דקות. לבסוף, הכניסו את לוחית הדגימות לתוך לוחית ריצוף ולאחר מכן למכשיר הריצוף.דרך מקובלת אחת לניתוח נתונים היא שימוש בתוכנת recall לביצוע קריאה אוטומטית של הבסיסים (base calling) ללא התערבות אנושית. Recall היא תוכנה חופשית לקריאת בסיסים המבוססת על התאמה אישית; התחבר למערכת ובחר את קבצי הדגימות להעלאה באמצעות אפשרית ה-browse. איתור קובץ נתוני הרצף הגולמי והעלאה של עד 20 megabytes.בשלב הבא, הגדירו את רצף הייחוס ל-V three. לחצו על process data. בחרו בתיקייה שהתקבלה בצד ימין של הדף כדי להציג את רשימת הדגימות.אלו המופיעים באדום נכשלו. אלו המופיעים בירוק עברו. על ידי לחיצה על דגימה ספציפית ועל כפתור התצוגה, תוכלו לסקור את הרצף, לעקוב אחר ההוראות בצד הימני של הדף כדי לנווט ברצף, ולהוריד קבצים לתיקיית zip.ניתן להסיק טרופיזם ויראלי מרצפים שהופקו באמצעות ריצוף מבוסס אוכלוסייה תוך שימוש באלגוריתם geno to pheno co-receptor. מהתפריט הנפתח של ההגדרה המשמעותית (significant setting), בחר באפשרות המותאמת (optimized) על בסיס ניתוח נתונים קליניים מ-motivate 2% ו-5.75% FPR. כעת בחר להעלות או להדביק רצף לצורך ניתוח.קבצי FASTA מקובלים. אין להוסיף קבצים אחרים; המשיכו כדי להוציא תחזית geno Tono FPRA לתגובה למעכבי CCR5. הדוח G two P שנוצר מספק את רצף הלולאה V3 בחומצות אמינו ומציין מיקומים רלוונטיים של מוטציות הקשורות לנגיף שאינו מקשר ל-R5.בתחתית הדוח מופיע שיעור הפוזיטיביים הכוזבים, המפורש במונחים של תגובה למעכב CCR5. ניתן להוריד דוח זה כקובץ PDF. אם אחת משלוש הרצפים מדגימה מסויימת מזוהה כלא R5, הסבירות היא שהמטופל לא יגיב למעכב CCR5 כצפוי. אלקטרופורזה של ג'ל של הגבריקציות של RTP CR של לולאת V3 של HIV-1 מעידה שלא כל הדגימות הקליניות מפיקות תוצר.ניתן להציג את הרצפים שהופקו מהדגימות המוגברות בכרומטוגרמה שנקראה באמצעות recall. צפויה קבלת רצף נקי עם מעט תערובות. לעיתים הרצפים עשויים להיות לא ברורים ולא כשירים להשמה מדויקת של הבסיסים.ניתן לזהות חלק מהחולים כבעלי נגיף שאינו משתמש ב-CCR5, כפי שמוצג כאן. מטופלים אלו אינם צפויים להגיב לטיפול באמצעות אנטגוניסט ל-CCR5. עם זאת, ברוב המקרים נמצא כי אוכלוסיית הנגיפים מורכבת מנגיפים המשתמשים ב-CCR5, כפי שמעידה תיבה ירוקה בתחתית דוח ניתוח ה-G two P.ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצע אותה בערך במשך ארבעה ימים מהתחלה ועד לסוף. המשך הוא מהשלב של המיצוי ועד לשלב הניתוח. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחזות טרופיזם ויראלי באמצעות שיטות ריצוף מבוססות אוכלוסייה בשילוב עם האלגוריתם הביואינפורמטי genome pheno.זהו כל השלב. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

genotypic-inference-hiv-1-tropism-using-population-based-sequencing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

לכמת רמות של HIV-1 RNA בפלסמה רצף יחיד HIV-1 הגנום של אנשים עם המון ויראלי מתחת לגבול הגילוי (50-75 עותקים / מ"ל) קשה. כאן אנו מתארים כיצד לחלץ ולכמת רנ"א נגיפי בפלסמה בזמן אמיתי באמצעות PCR assay כי מהימן אמצעים HIV-1 RNA עד 0.3 עותקים / מ"ל ​​וכיצד להגביר את הגנום הנגיפי על ידי רצף הגנום יחיד, ממדגמים עם המון ויראלי נמוך מאוד.

הגברה וכימות HIV-1 RNA אצל אנשים שנדבקו ב-HIV עם המון ויראלי מתחת לגבול של זיהוי על ידי מבחני קלינית רגילה

החיזוי של שימוש coreceptor של HIV-1 נדרש לניהול קבוצה חדשה של תרופות תרופתיות, יריבי coreceptor כלומר. זה יכול להתבצע על ידי ניתוח...

ניבוי של שימוש בנגיף HIV-1 Coreceptor (זיקה) על ידי ניתוח רצף באמצעות גישת genotypic

בדיקת עמידות לתרופות ל-HIV-1 אנשים נגועים נכשלו טיפול תרופתי (ART) יכולה להדריך את הטיפולים בעתיד ולשפר את תוצאות טיפול. תוצאות בריאותיות אופטימיזציה של פרט ואוכלוסייה בשכיחות איידס גבוהה, אך משאב מוגבל הגדרות סופו של דבר תדרוש גנוטיפ עמידות לתרופה במחיר סביר ונגיש ושיטות פרשנות.

שיטת ניטור משתלמת HIV-1 תרופות התנגדות להגדרות משאב מוגבלת

פתוגנזה של HIV-1 מוגדרת הן על ידי מאפיינים נגיפיים והן על ידי גורמים גנטיים של המארח. כאן אנו מתארים שיטה חזקה המאפשרת מדידות הניתנות לשחזור כדי להעריך את ההשפעה של וריאציה של רצף גן ה-gag על יכולת השכפול במבחנה של הנגיף.

הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה<em&gt; במבחנה</em&gt; יכולת שכפול של HIV-1 Gag-MJ4 וירוסי כימרי C סוג משנה

תחרות צמיחה בין נגיפים כמעט איזוגניים מספקת מדידה רגישה לקביעת כושר השכפול היחסי. הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים בניית שיבוטים רקומביננטיים של HIV-1, תחרות התפשטות וגידול וירוסים ושיטות ניתוח המותאמות להניב תוצאות רגישות ועקביות.

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

כתב יד זה מתאר את הליך הניסוי וניתוח תוכנה עבור assay דו כיווני האתר אינטגרציה שיכולה בו זמנית לנתח במעלה הזרם ו-במורד הזרם ווקטור צומת ה- DNA. ניתן להשתמש במוצרי PCR דו-כיווניים עבור כל פלטפורמה של רצף דונסטרים. הנתונים שהתקבלו שימושיים עבור השוואה גבוהה, השוואה כמותית של מטרות DNA משולב.

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

תיאר מתודולוגיה quantitate את הביטוי של גנים 96, 18 פני שטח חלבונים על ידי תאים בודדים לשעבר vivo, המאפשרות הזיהוי באופן שונה באה לידי ביטוי גנים, חלבונים בתאים הנגועים בנגיף ביחס תאים נגוע. אנו מיישמים את הגישה ללימוד CD4 הנגועים סיב+ T תאים מבודד קופי מקוק רזוס.

תא בודד כימות של mRNA וביטוי חלבונים השטח ב- CD4 הנגועים בנגיף+ T תאים מבודדים מן קופי מקוק רזוס

רצף proviral בודדים באורך מלא (היפוך) מספקת שיטה יעילה, תפוקה גבוהה עבור הגברה רצף של יחיד, ליד באורך מלא (שלמים ולא פגומה) HIV-1 הפרו-וירוס והיא מאפשרת קביעה של הפוטנציאל שלהם שכפול-כשירות. סלטות מתגבר על המגבלות של מבחני הקודם שנועדה רצף המאגר HIV-1 סמויה.

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

כאן אנו מציגים בגישה רצף עמוק המספקת של קביעה לא משוחדת של nascent-3' טרמיני, כמו גם פרופילים mutational של מולקולות דנ א חד גדילי. היישום העיקרי הוא אפיון nascent retroviral משלימים DNAs (cDNAs), intermediates שנוצר במהלך התהליך של retroviral שעתוק במהופך.

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

למדו שיטה חישובית לקביעת טרופיזם HIV באמצעות ריצוף אוכלוסייה של אזור V3 ואלגוריתם geno2pheno. שיטה זו מאפשרת זיהוי שימוש בקו-רצפטורים R5 או non-R5 לטיפול אנטי-רטרווירלי.

הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

גלה סרטונים נוספים