הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

המטרה הכוללת של הליך זה היא להסיק טרופיזם ויראלי בחולה נגוע ב- HIV על ידי ריצוף אזור V שלוש של גן המעטפת הנגיפית כדי להתחיל לחלץ H-I-V-R-N-A מפלזמת הדם של המטופל. לאחר מכן, הגבירו את אזור ה-V שלוש של HIV GP אחד 20 באמצעות R-T-P-C-R מקונן. לאחר מכן זהה את נוכחות המוצר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל, ואחריו ריצוף מבוסס אוכלוסייה של מוצרי ה-V המוגברים.

לבסוף, נתח את הרצפים באמצעות תוכנת קריאת בסיס והסיק שימוש בקולטן משותף באמצעות אלגוריתם הגנום לפנו. בסופו של דבר, תוצאות אלה יכולות להראות אם הכוח הנגיפי של המטופל הוא R חמש או לא R חמש באמצעות ריצוף מבוסס אוכלוסייה של לולאת HIVV 3. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בדיקת כוחות על פני שיטות קיימות כגון בדיקות מבוססות תאים פנוטיפיות הוא שניתן לבצע אותה בכל מעבדה המצוידת במנגנון ריצוף בעלות מופחתת בפחות זמן עם פחות חומר התחלתי.

טכניקה זו רלוונטית לטיפול בטיפול אנטי-רטרו-ויראלי מכיוון שהיא יכולה לזהות אם האוכלוסייה הנגיפית של המטופל צפויה להגיב לאנטגוניסט CCR חמישה מ-500 מיקרוליטר פלזמה. השתמש במחלץ אוטומטי קל למאג כדי לחלץ H-I-V-R-N-A. כעת עברו לחדר נקי של PCR כדי להקים את ה-R-T-P-C-R על מנת להבטיח דגימה נאותה של אוכלוסיית הנגיף.

תכנן לבצע כל תגובת שעתוק הפוך בשלוש פעמים בתגובה חד-שלבית זו. השתמש ב-RNA ויראלי כדי לסנתז CDNA, במיוחד להגביר את אזור ה-HIVV 3 עם תיקון ראשוני SQV 3 F1 ו-CO 6 0 2. מבוסס על רכיבי תגובה.

הכינו תמיסת תערובת מלאי המספיקה להגברת מספר הדגימות באמצעות פיפטה משחזרת הוסף 36 מיקרוליטר של תערובת דגימה לכל באר של צלחת ה-PCR. כעת עבור לפיפטה רב-ערוצית כדי להפוך מיקרוליטר של תמצית דגימת RNA לכל אחת מהבארות המיועדות לכך. הקפידו להחליף טיפים בין כל הוספה.

לאחר השלמת ההעברה, כסו את הבארות במכסי פס PCR. לאחר מכן הנח את לוחית ה-PCR בתרמו-סייקלר המתוכנת לשלב אחד R-T-P-C-R של אזור ה-HIVV שלוש. עבור ה-PCR המקונן, השתמש בתיקון פריימר SQV שלוש F two ו-CD four R.

חשב את כמות המגיב הנדרשת למספר הדגימות שיש להגביר בחדר נקי PCR. צור את תערובת ה-PCR המקוננת ולאחר מכן השתמש בפיפטה משחזרת כדי להפיק 19 מיקרוליטר לבאר של צלחת PCR נקייה. עם השלמת ה-R-T-P-C-R, עברו לחדר הגברה של עמודים.

השתמש בפיפטה רב-ערוצית בעלת שמונה ערוצים כדי להעביר מיקרוליטר אחד של תבנית R-T-P-C-R לתערובת ה-PCR המקוננת. החלף טיפים בין כל הוספה. מכסים את הבארות במכסי רצועות PCR ומעבירים את הצלחת לתרמו-סייקלר להגברה.

הסר את הצלחת מהתרמו-סייקלר לאחר שהטמפרטורה חזרה ל-25 מעלות צלזיוס. על מנת לאשר שאזור ה-V 3 הוגבר בהצלחה, נתח תחילה מוצרים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל. הכן ג'ל 1.6% AROS עם כתם ג'ל בטוח סייבר.

באמצעות פיפטה רב-ערוצית בנפח 10 מיקרוליטר. העבר שמונה דגימות PCR של מיקרוליטר לבארות המתאימות. טען גם סולם DNA לבאר אחת לפחות בכל שורה.

הפעל את הג'ל בסביבות 100 וולט למשך 10 דקות. דמיין רצועות על ידי פלואורסצנטיות אולטרה סגולה ותעד את התמונה באמצעות צילום. רשום את הדוגמאות שבהן כל ההגברות המשולשות היו מוצלחות.

במידת הצורך, חזור על R-T-P-C-R עבור אותן דגימות עם פחות משלוש הגברות מוצר. דגימות ה-CDNA הוויראליות המוגברות מאומתות עוד יותר על ידי תגובות ריצוף DNA יבוצעו באמצעות פריימרים V 3 0 2 F ו-S QV שלושה R one. מוציאים את המגיב הגדול מהמקפיא ומפשירים בטמפרטורת החדר.

חשב והכן את הריאגנטים הנדרשים למספר הדגימות שיש לפעול. יש לערבב חמישה מיקרוליטרים של תגובת רצף לבארות הצלחות המתאימות באמצעות פיפטה רב-ערוצית. מכסים את הצלחת במגבון קים ומניחים בצד.

בינתיים, הכינו דילול של 1 עד 15 של מוצר ה-PCR המוגבר על ידי הוספת 180 מיקרוליטר מים סטריליים למוצר ה-PCR הנותר. פיפטה מיקרוליטר אחד מהדגימה המדוללת לתחתית הצלחת המתאימה. בארות תמיד מחליפות טיפים בין דגימות כאשר העברת הדגימה הושלמה.

אטום את הצלחת עם מכסי רצועה ומערבולת למשך שנייה אחת. כדי לצנטריפוגה של הצלחת, הגדר את המהירות ל 140 5 גרם. כאשר מהירות הסיבוב מגיעה ל-140 5G, עצור את הסיבוב.

הניחו את הצלחת בתרמו-סייקלר כדי שהתגובה תמשיך. בכל באר יש לזרז את ה- DNA בארבעה מיקרוליטרים של שלושה נתרן אצטט מולארי ו -40 מיקרוליטר אתנול 95% צונן, לאטום מחדש את הכובעים. קליפת המוח את הצלחת למשך 10 שניות והקש על הצלחת כדי לעקור בועות אוויר.

מניחים את הצלחות במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעתיים. שחזר DNA על ידי צנטריפוגה ב -2000 גרם למשך 20 דקות. הסר והשליך את מכסי הרצועה.

הפוך את הצלחת מעל מיכל הפסולת והוציא את הסופר נטין. היפטר מכל סופר נאטין שנותר. על ידי ספיגת הצלחות ההפוכות על מגבת נייר.

מקפלים שני גיליונות מגבת נייר כדי לסנדוויץ' את הצלחת. הנח את הצלחת עם הפנים כלפי מטה בצנטריפוגה וסובב ב-140 5G. עצירת הסיבוב כשהוא מגיע ל-140 5G.

לאחר מכן יש לשטוף עם 155 מיקרוליטר של 95% אתנול ודקנט. ואז חזור על הצנטריפוגה. הניחו לצלחת לשבת שתיים עד חמש דקות כדי לאפשר לאתנול האחרון להתאדות.

על מנת לנטרל את דגימות ה-DNA, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להפיץ 10 מיקרוליטר של צבע גבוה ל-maide לכל הבארות בצלחת, כולל אלה הריקות אוטמים את הצלחת עם ספטימה ומניחים בתרמוסייקלר בחום של 90 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לבסוף, הנח את לוחית הדגימה לתוך לוחית רצף ולתוך הרצף.

נתיב מקובל אחד לניתוח נתונים הוא שימוש בזיכרון התוכנה לביצוע קריאות בסיס אוטומטיות ללא התערבות אנושית. Recall היא תוכנת שיחות חינמית מבוססת התאמה אישית, היכנס ובחר קבצים לדוגמה להעלאה באמצעות אפשרות העיון. אתר את קובץ נתוני הרצף הגולמי והעלה עד 20 מגה-בתים.

לאחר מכן, הגדר את רצף הייחוס ל-V שלוש. לחץ על עיבוד נתונים. בחר בתיקייה שנוצרה בצד ימין של העמוד כדי להציג את רשימת הדוגמאות.

אלה שהן אדומות נכשלו. אלה הירוקים חלפו. על ידי לחיצה על דגימה ספציפית וכפתור התצוגה, אתה יכול לסקור את הרצף, לעקוב אחר ההוראות בצד ימין של הדף כדי לנווט ברצף, להוריד קבצים לתיקיית zip.

ניתן להסיק טרופיזם ויראלי מרצפים שנוצרו על ידי ריצוף מבוסס אוכלוסייה באמצעות אלגוריתם הקולטן המשותף של גנו. מהתפריט הנפתח של ההגדרה המשמעותית, בחר את האופטימיזציה על סמך ניתוח נתונים קליניים מ-motivate 2% ו-5.75% FPR. כעת בחר להעלות או להדביק רצף לניתוח.

קבצי FASTA מקובלים. אל תוסיף המשך אחר כדי להשיג מנבא גנו-טונו FPRA של היענות לאנטגוניסטים של CCR חמישה. דוח G two P שנוצר מספק את רצף ה-V שלוש לולאות בחומצות אמינו ומציין מיקומים רלוונטיים ממוטציות הקשורות ל-non R five באמצעות הנגיף.

בתחתית הדוח, שיעור החיוביים השגויים ניתן ומפורש במונחים של תגובה לאנטגוניסט CCR 5. ניתן להוריד דוח זה כקובץ PDF. אם אחד משלושת הרצפים מהדגימה מוסק כלא R חמש, סביר להניח שהמטופל לא יגיב לאנטגוניסט CCR 5 כצפוי אלקטרופורזה ג'ל של RTP CR הגברות של HIV 1 V שלוש לולאה מצביעה על כך שלא כל הדגימות הקליניות מייצרות מוצר.

ניתן לדמיין את הרצפים שנוצרו מהדגימות המוגברות בכרומטוגרמה שנקראת על ידי זיכרון. צפוי רצף נקי עם מעט תערובות. לפעמים רצפים עשויים להיות מבולגנים ולא ניתנים להקצאת בסיס מדויקת.

חלק מהמטופלים עשויים להיות מזוהים כבעלי נגיף שאינו CCR 5 כפי שמוצג כאן. חולים אלה אינם צפויים להגיב לטיפול באנטגוניסט CCR 5. עם זאת, נמצא כי לרוב החולים יש אוכלוסייה ויראלית המורכבת מ-CCR 5 המשתמשת בנגיף כפי שמצוין על ידי תיבה ירוקה בתחתית דוח הניתוח G two P.

אז לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כארבעה ימים מתחילתה ועד סופה. זה מחילוץ לניתוח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחזות טרופיזם ויראלי באמצעות שיטות ריצוף מבוססות אוכלוסייה בשילוב עם האלגוריתם הביואינפורמטי של פנום הגנום.

בסדר, זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.