Name: מינהל פסיבי של נוגדנים חד שבטיים נגד ח capsulatum ואחרים פתוגנים פטרייתיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: למדו על ניהול פסיבי של נוגדנים חד שבטיים נגד Histoplasma capsulatum בעכברי C57BL/6. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבחון את יעילות החיסון ההומורלי נגד זיהומים פטרייתיים ולפתח אסטרטגיות טיפול חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. צמיחה של ח Capsulatum <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ארון biosafety לעבודה עם הפטרייה על ידי ניקוי הממשלה עם אקונומיקה 10% ואחריו קרינה UV 20 דקות. ח capsulatum בשלב שמרים biosafety דורש רמה (מנהלת הליגה) נוהלי השנייה, בעוד טופס עובש דורש BSLIII. השתמש בטופס שמרים את השלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא להכין צינור חרוטי 15 מ"ל עם 5 מ"ל של PBS. קציר מושבה של ח capsulatum (זן HC ATCC G217B) מתוך צלחת אגר דם BHI [גלוקוז 10 גר '/ ליטר, 0.1 ציסטאין g / L, פניצילין, סטרפטומיצין 1% וכבשים כדוריות דם אדומות 50 מ"ל / L (קולורדו סרום ושות', קולורדו, ארה"ב) ] מעובד על 37 מעלות צלזיוס או לקחת aliquot ממלאי שמרים קפוא ב -80 ° C ולהוסיף אותו PBS. וורטקס התאים במרץ צנטריפוגות עבור XG 1100 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בזהירות את supernatant מבלי להפריע גלולה ולהוסיף 10ml של PBS טריים. חזור על תהליך זה שלוש פעמים. להשעות את התאים של 5 מ"ל PBS ואת תשלומי העברה צינור חרוטי 50 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשבש את התאים מצטברים, להעביר את ההשעיה תא שמרים דרך G1 26 / 2 מחט u לשיר מזרק 10 מ"ל 5 פעמים ארון biosafety (באמצעות הגנה על הפנים). כדי לבודד שמרים קטנה, בגודל אחיד, צנטריפוגה התאים XG ב 55 דקות 1 בטמפרטורת החדר ולאחר מכן להסיר את מ"ל העליון 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההשעיה התא בקבוק erlenmeyer סטרילית המכילה 100 מ"ל של מדיום F12 HAM (GIBCO) בתוספת גלוקוז 16G / L, 1g / L חומצה גלוטמית, 8.4mg / L ציסטין, 6g / L חומצה גלוטמית ואז לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות באינקובטור עם רעד 150rpm. </li></ol> 2. Hybridoma צמיחה טיהור של נוגדנים חד שבטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את hybridomas שנבחרו בינוני DMEM המכילה 10% נסיוב עגל עוברית, NCTC 10%, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו של 1% פניצילין, סטרפטומיצין. לגדל את התאים בבקבוק תא התרבות (בקטון דיקנסון) במשך 5-7 ימים ב 37 מעלות CO 5 / 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז בצנטריפוגה בינוני XG ב 1100 עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר לאסוף את כל supernatant מבלי לשבש את כדורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא לטהר את supernatant חינם התא בעזרת חלבון שרף / G על ידי FPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריכוז MAB אז יכול להיות מחושב על ידי לכידת ELISA (1) שימוש בפקד אלוטיפ IgG כסטנדרט (איור 1B). </li></ol> 3. הכנה Histoplasma Capsulatum Inoculum <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו 48 שעות capsulatum Histoplasma (זן HC ATCC G217B) שמרים שלב תרבות גדל בינוני F-12 HAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים XG ב 1100 ל 10 דקות. בטל supernatant ולהוסיף PBS טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ההליך 3.2 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את ההשעיה תא שמרים 5 פעמים באמצעות מחט 26G1 / 2 באמצעות מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את ההשעיה על XG 55 דקות עד 1 אשכולות גלולה תא שיורית. מעבירים את supernatant המכיל את ההשעיה תא בודד לצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת ההשעיה תא בודד באמצעות hematocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז התא על מנת להשיג 1.25 x 10 7 שמרים (הישרדות) או 5.0 x 10 6 (CFU, ציטוקינים היסטולוגיה) ב suspention של μL 50 &lt;(איור 2). </li></ol> 4. מינהל intraperitoneal של מבז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים את העכבר בזנבו לבין בעורפו של הצוואר (איור 3A). לשתק את העכבר על ידי בעורפו שלה קרוב theears ככל האפשר (לוודא לקחת את העור מספיק כך העכבר cannotturn ראשו לנשוך את האדם לטיפול בה; איור 3B ו - 3C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את withthe זנב האצבע הקטנה לחצה בעדינות על כף היד (איור 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוגית באזור ההזרקה עם אתנול 70% לפני ששמים את המחט כדי לשאוב לחפש דם לפני הזרקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 26G1 / 2 piercethe העור abdominalmuscles להזריק את הפתרון הכולל 500μg מב (PBS, נוגדן אלוטיפ מלאה או מב להיבדק, בדילול מלא 1 מ"ל PBS) לתוך שמאל thelower או נמוך ברבע הבטן ימינה (חלל intraperitoneal), עם החיה בראש את הפוזיציה, מקפיד להימנע andother הסרעפת לאיברים הפנימיים (איור 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו לזמן קצר לפני הנסיגה needleto להקטין את הסיכוי של דליפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו לפחות שעתיים לפני שתמשיך לשלב הבא. </li></ol> 5. עכבר הרדמה וזיהומים Intranasal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההרדמה באמצעות קטמין ו xylazine על 100 מ"ג / ק"ג ו - 10 מ"ג / ק"ג, בהתאמה. בצע הממשל intraperitoneal של PBS, נוגדן אלוטיפ שליטה, או נוגדן ניסיוני כמתואר בפרוטוקול כתוב הנלווים. חכה שעתיים לאחר ההזרקה MAB לפני הרדמה העכבר שתמשיך הזיהום intranasal. הכן קטמין הרדמה באמצעות ו xylazine על 100 מ"ג / ק"ג ו - 10 מ"ג / ק"ג, בהתאמה (7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתקופה 2h ההמתנה, להכין את inoculum capsulum Histoplasma כמתואר בפרוטוקול כתוב הנלווים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לפי itens 5.1 עד 5.5. טו קמצוץ החיות עם פינצטה כדי לוודא העדר רפלקס ולוודא כי ההרדמה עבד. Anaesthetization לאחר בעדינות להשעות את העכבר על השיניים הקדמיות שלה ניילון או חוט כותנה. שימוש 2 עומד טור לקשור את החוטים על מנת להשעות את החיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט לנהל כ -50 inoculum μl לתוך n האם באמצעות micropipette בעוד מקרוב אחר קצב הנשימה של העכבר. אפשר העכבר כדי לנוח בתפקיד זה במשך 2-5 דקות לאחר ההדבקה intranasal כדי להקל על בתצהיר של השמרים לתוך הריאות של החיה (איור 3F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עכבר נדבק בווירוס, לשמור על העכבר בסביבה, פיקוח חם (בטמפרטורה שבין 25 ל 37 מעלות צלזיוס), בזהירות ניצול מנורת חום במידת הצורך, עד שהוא מתאושש מן ההרדמה. כאשר מתעורר עכבר, להחזיר אותו לכלוב נקי עם גישה כרצונך מודעה מזון ומים. כלובים מוחזרים למתקן החיה שלנו כל הזמן בחדר חיית נקי (BLSI). </li></ol> 6. הישרדות מחקרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת בעלי חיים נגועים מעושה נגוע קלינית tachypnea, עייפות, obtundation, וירידה במשקל. החיות צריך להיבדק פעמיים ביום על ידי אנשי המעבדה יומי על ידי מטפלות בבעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם histoplasmosis Murine, עד קרוב לסוף חייו, יש בדרך כלל כל סימני הזיהום למעט עלייה קלה בקצב הנשימה. עם מחלה מתקדמת, אשר קורה בדרך כלל 10-11 ימים, עכברים הופכים tachypneic משמעותית ויש להם פעילות מצומצמת. בדרך כלל הם להפוך במהירות הגוססת ואת לפוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי חיים במצוקה צריך להיות מורדמים כראוי עם CO 2 בתא ייעודי, חיות המנוח צריכה להיות מנה יומית. </li></ol> 7. מחקרים CFU, היסטולוגיה ו ציטוקינים ללימודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 15 מבחנות חרוטי מ"ל עם 10 מ"ל PBS עבור כל איבר להיות שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים 7 ו - 14 ימים לאחר ההדבקה עם inuculum sublethal (5.0 x 10 6) כפי שהוצג קודם ולהסיר את הריאות, הטחול והכבד מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חתיכת איבר להיבדק ולבצע את הקיבעון של לילה פורמלין. סעיפים תיבחן תחת מיקרוסקופ להערכה פתולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מבחנות חרוטי מ"ל עם 5 מ"ל PBS ועליו 70 strainers תא מיקרומטר עבור כל איבר להיות הומוגני. מרוכך כל החלק הנותר של איברים בנפרד לתוך צינורות 50 מ"ל באמצעות מזרק סטרילי בוכנות 5 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, סדרתי לדלל homogenates איבר (1:100, 1:1000 ו - 1:5000) ו 100μL צלחת של דילול על כל BHI דם צלחות אגר (2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מעכב פרוטאז טבליות אל homogenates בהתאם להוראות של ייצור (רוש, גרמניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך עד 14 ימים CFUs למנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenates איבר ב 4000xg במשך 10 דקות ולהסיר supernatants איברים, whish ישמש המשמשים את מבחני ציטוקין שבוצעה על ידי שיטות סטנדרטיות על פי היצרן. </li></ol> 8. נוגדנים חד שבטיים כנגד ה 'הגנה Capsulatum תלוי ספציפיות נוגדן ו אלוטיפ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MAB אלוטיפ הוא קריטי להגנה מפני ח capsulatum, כמו העכברים שטופלו IgG1 או IgG2a מבז כדי Hsp60 יש להישרדות ממושכת באופן משמעותי לעומת שליטה עכברים שקיבלו מאב IgG2b כדי Hsp60 או או פקד אלוטיפ MAB או PBS (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן, בעכברים שקיבלו מבז מגן, היתה ירידה משמעותית במספר CFU ריאתי הטחול ביום 7 וירידה של 2 ו -2.5 יחידות יומן של מספרים השמרים לריאות בכל יום 14 (איור 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: גידול של ח capsulatum ו hybridomas. (א) HAM נוזלי הכנה F-12 תרבות מהמושבה יחיד המתקבל ח capsulatum גדל על BHI דם צלחות אגר. (ב) Hybridoma צמיחה בתרבות צלוחיות תא וטיהור MAB על ידי חלבון A / G באמצעות שרף cromatography זיקה. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: ח' capsulatum הכנה inoculum לזיהום intranasal. תא ההשעיה המתקבל לאחר ח שיבוש אגרגטים capsulatum על ידי מזרק צנטריפוגה היא על ידי ספירת המנויים ב hemocytometer. ריכוז נייד מותאם 1.25 x 10 7 (ניסויים הישרדות) או 5 x 10 6 (CFUs, ציטוקינים היסטולוגיה) ב μL 50 &lt;. upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" איור 3 "/&gt; איור 3: טיפול עכבר במהלך מב הממשל. (א) העכבר הוא הרים בזנבו (B ו-C) משותקת על ידי החזקת בעורפו של הצוואר שלו קרוב theears. (ד) הזנב מוחזק בין האצבע בכף מעט. (ה) הפתרון MAB מוזרק באמצעות מחט 26G1 / 2. (ו) ח capsulatum inoculum מנוהל על ידי intranasally בעדינות pipetting ההשעיה לתוך התא n האם. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4: מבז כדי Hsp60 יכול לשנות את בפתוגנזה של histoplasmosis. זריקות ip עם 500 מיקרוגרם של IgG1, או IgG2a מבז 2 שעות לפני קיום זיהום ממושך באופן משמעותי (p &lt;בהשוואה לקבוצת הביקורת, 0.05), אך IgG2b מב. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5: קביעות CFU בריאות ב 7 ו - 14 ימים לאחר אתגר intranasal sublethal עם 5x10 6 שמרים HC-IP של עכברים שטופלו מבז שנבחרו Hsp60 או מאב לא רלוונטי הראו ירידה בנטל פטרייתי עבור IgG1 ו IgG2a מבז טיפול בבעלי חיים. פסים שחורים מייצגים CFUs ביום 7 וברים לבן 14 ימים לאחר הפגיעה (* p &lt;0.001 ב 7 ימים ** p &lt;0.001 ב 14 הימים שלאחר ההדבקה).

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול המוצג כאן מוכיח כי MAB של אל ח capsulatum יכול לשנות את מהלך histoplasmosis Murine ניסיוני. מבז אל פני השטח אנטיגנים התא של פתוגנים יכול לשנות את הדינמיקה מורכבים המתרחשים במהלך משחק הגומלין בין המארחת לבין הפתוגן. מחקר זה קובע כי מבז לתווך הגנה במודל Murine של histoplasmosis קטלני כאשר הוא מוזרק intraperitoneally, והוא מציע חלבונים מועמד לפיתוח חיסון, כגון H2B, אנטיגן M (משטח Catalase) (3) ו Hsp60. בשנת vivo, מנהלה של מבז מגן HC Hsp60 H2B ו מופחת נטל איבר דלקת פ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם חומר </th><th> חברה </th></tr><tr><td> ארון בטיחות ביולוגית (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל </td><td> פלקון, BD </td></tr><tr><td> HAM-F-12 בינוני </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C שייקר </td><td></td></tr><tr><td> מערבולת </td><td></td></tr><tr><td> 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל </td><td> פלקון, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 מחט </td><td> BD </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל מזרק </td><td> BD </td></tr><tr><td> 250 מ&quot;ל צלוחיות </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר) מערכת </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> ELISA הקורא </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> הרדמה (קטמין ו Xylazine) </td><td></td></tr><tr><td> טור עומד </td><td></td></tr><tr><td> חוט ניילון </td><td></td></tr><tr><td> מחממים מנורה </td><td></td></tr><tr><td> תא strainers 70μm </td><td> פלקון, BD </td></tr><tr><td> BHI צלחות אגר </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

מינהל פסיבי של נוגדנים חד שבטיים נגד ח capsulatum ואחרים פתוגנים פטרייתיים

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

מטרת השימוש של מתודולוגיה זו היא 1) כדי לקדם את היכולת שלנו להגן על אנשים עם נוגדנים או חיסון למניעת או לטיפול histoplasmosis נגרמת על ידי פטרייה capsulatum Histoplasma ו 2) לבחון את התפקיד של גורמים ארסיות כיעד לטיפול. כדי ליצור מבז, עכברים הם שחוסנו, תגובות החיסון מוערכים באמצעות בשלב מוצק ELISA המערכת שפותחה במעבדה שלנו, את העכברים הטובים ביותר המגיב נבחרים הבידוד של splenocytes היתוך עם תאים hybridoma. C57BL עכברים / 6 נעשה שימוש נרחב ללמוד H. בפתוגנזה capsulatum ולספק את המודל הטוב ביותר להשגת הנתונים הדרושים. על מנת להעריך את התפקיד של מבז זיהום, עכברים הם intraperitoneally מנוהל גם עם מב ח ל capsulatum או אלוטיפ בהתאמה מלאה מב ו נגוע אז או תוך ורידי (iv), intraperitoneal (IP), או intranasal (ב) מסלולים. בספרות המדעית, היעילות של מבז עבור זיהומים פטרייתיים בעכברים מסתמך על תמותה כנקודת סיום, בשיתוף עם formin יחידות המושבה (CFU) הערכות בנקודות זמן קודמות. (זמן מותו) מחקרים הישרדות נחוצים כמו שהם מייצגים בצורה הטובה ביותר מחלות אנושיות. לכן, יעילותה של התערבות שלנו לא מספקת תוקם ללא עקומות ההישרדות. הדבר נכון גם להקמת היעילות של חיסון או בדיקה של מוטנטים עבור ארסיות. עם histoplasmosis, העכברים לעתים קרובות ללכת מלהיות אנרגטית מת על כמה שעות. הקיבולת של התערבות כגון ניהול של MAB עשוי בתחילה להגן מפני מחלות בעלי חיים, אך המחלה יכולה להישנות אשר לא ימומש בקיצור ניסויים CFU. בנוסף הישרדות מבחני עומס פטרייתי, אנו בוחנים את תגובות דלקתיות לזיהום (היסטולוגיה, גיוס הסלולר, תגובות ציטוקינים). עבור ההישרדות / שעה כדי ניסויים מוות, עכברים נגועים ומנוטרים לפחות פעמיים ביום סימנים של תחלואה. על מנת להעריך את הנטל פטרייתי, histopathology, ותגובות ציטוקינים, בעכברים מורדמים בזמנים שונים לאחר ההדבקה. ניסויים בבעלי חיים מבוצעות על פי ההנחיות של המכון ללימודי החיות של אלברט איינשטיין לרפואה.

C57BL עכברים / 6 שימשו ללמוד בפתוגנזה HC ולספק את המודל הטוב ביותר. אנחנו בוחנים את היתרונות הפוטנציאליים של חסינות הלחות נגד פטריות זה שנוצר מבז מספר [כדי H2B היסטון ואת הלם חום 60kDa חלבון] כי בדקנו את יעילות ההגנה שלהם לאחר מתן intraperitoneal.

מטרת השימוש במתודולוגיה זו היא 1) לקדם את יכולתנו להגן על אנשים באמצעות נוגדנים או חיסון למניעה או לטיפול ב...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקדם את יכולתנו להגן על אנשים באמצעות נוגדנים או חיסונים למניעה או לטיפול בהיסטופלסמוזיס, ולבחון את תפקידם של גורמי virulentness בפתוגנזה של המחלה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד ואפיון של נוגדנים מונוקלונליים לאנטיגנים מטרה. השלב השני של הפרוצדורה הוא מתן הנוגדנים המונוקלונליים שנבחרו, באופן תוך-פריטוני, שעתיים לפני ההדבקה תוך-אפית.על מנת לאפשר למולקולות אלו זמן להתפזר ברחבי הגוף, השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הרדמת העכברים והדבקתם תוך-אפית עם האינוקולום הרצוי. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ניטור מצבם הבריאותי של בעלי החיים. בעלי החיים עוברים המתה הומנית במרווחי זמן שונים כדי לקבוע את העומס הפטרייתי ולהעריך תגובות דלקתיות, או שהם נמצאים במעקב לבדיקת הישרדות.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות הארכה של השרידות ושינוי בתגובות הפתולוגיות באיברים הפגועים של עכברים שהודבקו באופן קטלני. זאת באמצעות מתן פריטוני של הנוגדנים המונוקלונליים המגנים לפני ההדבקה. את הפרוצדורה תדגים ally emer, סטודנטית לדוקטורט לאחר תואר עם ניסיון רב בפתוגנזה פטרייתית ובמודלים של הדבקת בעלי חיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרופות נוגדות פטריות, הוא שהנוגדנים המונוקלונליים הם מולקולות בעלות תכונות ספציפיות הפועלות באמצעות מעורבות של גורם פוטנציאלי במארח. הדגמה חזותית של שיטה זו למתן מענה למחלה היא קריטית.מכיוון ששלבי מתן הנוגדן המונוקלונלי וההדבקה תוך-אפית הם קשים ללמידה בשל הצורך במומחיות בטיפול בבעלי החיים, הכינו קבינה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) לעבודה עם הפטרייה בצורת שמרים על ידי ניקוי הקבינה באקונומיקה, ולאחריה הקרנה ב-UV. הכינו מבחנה קונית של 15 milliliter עם 5 milliliter של PBS.אסוף מושבה של H caps AUM ממנת עבודה של מאון, שהוקפא במינוס 80 מעלות צלזיוס, והוסף אותה ל-PBS במערבל vortex. ערבב את התאים בעוצמה וסבב בצנטריפוגה במהירות של 1100 ×g למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, הסר בזהירות את העילאי מבלי להפריע למשקע והוסף לפחות 10 milliliters של PBS טרי.חזור על הליך זה שלוש פעמים לאחר השטיפה האחרונה. השהה מחדש את התאים ב-5 milliliters של PBS. יש לבצע את כל השטיפות בטמפרטורת החדר. כדי לפרק תאים מצומדים, העבר את תאי השמרים דרך מחט במידה 26 gauge באורך one half באמצעות מזרק של 10 milliliters חמש פעמים, תוך איסוף תאי השמרים למבחנה קונית של 50 milliliters.כדי לבודד שמרים קטנים ובגודל אחיד, סבב את התאים בצנטריפוגה ב-55 $\times$g למשך דקה אחת, ולאחר מכן הסר את המיליליטר הראשון מהחלק העליון. הוסף את תרחיף התאים לבקבוק ארלנמייר מזכוכית סטרילי בנפח 250 מיליליטר המכיל 100 מיליליטר של מצע ham, F 12, ולאחר מכן גדל את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות באינקובטור עם ניעור ובריכוז פחמן דו-חמצני של החדר. תרבית זו תשמש להכנת האינוקולום, ויעילות הנוגדנים המונוקלונליים שיוחלצו בשלב הבא תיבחן.גודלו את ההיברידומות שנבחרו ב-DMEM לאחר חמישה עד שבעה ימי אינקובציה. קצרו את הנוגדנים על ידי איסוף כל המצע מבקבוק תרבית התאים ולאחר מכן סובבו את המצע בצנטריפוגה במהירות של 1100 ×g למשך 10 דקות. בדומה לתאי השמרים, ניתן לשטוף את הנוגדנים בטמפרטורת החדר.אסוף את supernatant מבלי להפריע למשקעים. לאחר מכן, טהר את ה-supernatant נטול התאים באמצעות שרף protein AG בשיטת לכידה של F-P-L-C-A. השתמש ב-Eli SA כדי לחשב את ריכוז הנוגדן המונוקלונלי כדי לקבוע את כמות הנוגדן המטוהר שיש להזריק.בצע הזרקה תוך-peritoneum של נוגדן בקרה מסוג PBS Isotype או של הנוגדן הניסויי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. המתן שעתיים לאחר הזרקת הנוגדן המונוקלונלי, לפני הרדמת העכבר והמשך בהדבקה תוך-אפית (intranasal) במהלך תקופת ההמתנה. הכן את תמיסת ההדבקה של *Histoplasma capsulatum* כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף, והרכב את מ apparatus החוט להדבקת העכבר על ידי קשירה הדוקה של חוט ניילון או כותנה בין שני מעמדי מוט, ולאחר מכן הרחק את המעמדים זה מזה כך שהחוט יהיה מתוח.ההרדמה היא באמצעות ketamine במינון של 100 milligrams per kilogram ו-xylazine במינון של 10 milligrams per kilogram. ניתן להכין זאת בשלב זה, כאשר לאנטיגנויות ניתן זמן מספיק להתפזר. הרדם את העכבר ואשר את הסדציה באמצעות בדיקת היעדר תגובה בבהו ללחיצה על בהוץ.תפסו בעזרת פינצטה. תלו בעדינות את העכבר מהשיניים הקדמיות שלו אל החוט. הזריקו לאט כ-50 µL של תמיסת ההחדרה (inoculum) אל תוך האוויר באמצעות מיקרופיפט.בעודכם מנטרים מקרוב את קצב הנשימה של העכבר. אפשרו לעכבר לנוח במצב זה במשך שתי עד חמש דקות לאחר ההדבקה תוך-אפית, כדי להקל על שקיעת השמרים בריאות החיה לאחר שהעכבר הודבק. החזיקו את העכבר בסביבה חמה ומנוטרת, תוך שימוש זהיר במנורת חימום במידת הצורך, עד להתאוששותו מההרדמה.כאשר העכבר מתעורר, החזירו אותו לכלוב נקי. עם גישה למזון ומים ad libido, העריכו באופן קליני את החיות המודבקות ואת החיות שקיבלו זריקה דמה (mock infected). לצורך מעקב אחר tachypnea, רפיקות (lethargy) וירידה במשקל, יש לבדוק את החיות פעמיים ביום על ידי אנשי המעבדה ופעם אחת ביום על ידי המטפלים בבעלי החיים.עם היסטופלסמוזיס כרונית עד לסמוך לסוף חייהם, בדרך כלל אין סימנים ניראים למחלה מלבד עלייה קלה בקצב הנשימה. במחלה בשלבים מתקדמים, העכברים הופכים רזים באופן משמעותי ופעילותם פוחתת. בדרך כלל, הם הופכים במהירות לחוליים יותר ומתים.יש להקלי את בעלי החיים הסובלים ממצוקה באופן הולם באמצעות פחמן דו-חמצני, בתוך תא ייעודי. יש לאשש את המוות על ידי היעדר תגובת רפלקס למגע בבהוות או צביטה, ויש למנות את בעלי החיים שהשביתו את נשימתם מדי יום.הכינו מבחנות קוניות של 15 מיליליטר המכילות 10 מיליליטר של PBS עבור כל איבר שייאסף. בצעו המתת חסקים בבעלי חיים שהודבקו עם אינוקולום תת-קטלני בריכוז 5x10⁶. כפי שהוצג בעבר, הוציאו את הריאות, הטחולים והכבדים, והכינו מיד מבחנות קוניות של 50 מיליליטר עם 5 מיליליטר של PBS.התקינו צלח פטרי עם מסנני תאים של 70 מיקרון עבור כל איבר שייעוך להומוגניזציה. מעכו each organ בנפרד באמצעות בוכנות של חמישה מיליליטר והעבירו למבחנות של 50 מיליליטר. לאחר מכן, בצעו דילול סדרתי של הומוגנאט האיבר בשלושה דילולים של 1:100, 1:1,000 ו-1:5,000, ו播ו 100 µL על מצע BHI.דגרו את צלחות האגר דם בטמפרטורה של 37 °C בתוך אינקובטור עם אחוז פחמן דו-חמצני רגיל של החדר למשך עד 14 ימים, וספרו את ה-CFUs. האיזוטייפ של הנוגדן המונוקלונלי הוא קריטי להגנה מפני hcaps Lotum, שכן עכברים שטופלו בנוגדיים מונוקלונליים מסוג IgG1 או IgG2 ל-HSP60 הראו הישרדות ממושכת באופן משמעותי בהשוואה לעכברי ביקורת שקיבלו נוגדן מונוקלונלי מסוג IgG2b ל-HSP60, או נוגדן מונוקלונלי כביקורת איזוטייפ, או PS. יתרה מכך, בעכברים שקיבלו נוגדיים מונוקלונליים מגנים, נצפתה הפחתה משמעותית במספר ה-CFUs בריאות ובטחול ביום השביעי, וירידה של 2 ו-2.5 יחידות לוג במספר השמרים בריאות ביום ה-14. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון קביעת העומס הפטרייתי המעיד על יחידות יוצרות מושבות (colony forming units), בדיקת הציטוקינים המעורבים בזיהום והערכת הטופולוגיה, במטרה לענות על שאלות נוספות, כגון הגדרת מנגנון הפעולה של שינוי המחלה על ידי הנוגדיים, תוך כדי ביצוע פרוצדורה זו.חשוב לזכור לעבוד בתנאי בטיחות ביולוגית בעת טיפול בעכברים המופקים (knock-on) ולפעול בהתאם לתקנות הרווחה לבעלי חיים עבור זיהומים תוך-נחריים.

passive-administration-monoclonal-antibodies-against-h-capsulatum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

וידאו זה מדגים את הניקוד אינדוקציה קליני במודל חיה של טרשת נפוצה: כרוני, relapsing Encephalomyelitis אוטואימונית ניסיונית התובע חולדות. המחלה, הנגרמת על ידי חולדות מחסנת עם תחליב המכיל חוט השדרה שלם חולדה adjuvant פרוינד של שלמה, מציג סימנים קליניים דומים מחלות אנושיות.

אינדוקציה ניקוד קליני כרוני, relapsing Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית

זנים מסוימים עכבר מסוגלים לעמוד בפני גיוס של Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE) עם חלבון המיאלין הבסיסי. המתואר כאן הוא פרוטוקול חיסון פשוט הופך את חוסר התגובה וגורם למחלת שיתוק בכמה כתמים אופייניים EAE עכבר עמידים.

התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני

סרטון זה מדגים טכניקת הומוגניזציה יעילה ליצירת תחליב אנטיגן-אדג'ובנטי כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) במודל מורין. התחליב מכיל אנטיגן עצמי - גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (MOG) - בשלב המים, מוקף בשלב שמן רציף הכולל חיידק פתוגני בלתי פעיל. האמולסיה מבטיחה שחרור מתמשך של אנטיגנים לתגובה חיסונית ממושכת.

הכנת תחליב אנטיגן-אדג'ובנטי להשראת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית

Encephalomyelitis אוטואימוניות הניסויי (EAE) הוא מודל חיה הוקם בטרשת נפוצה. C57BL / 6 עכברים שחוסנו עם גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין פפטיד (MOG) 35-55 (ש"א 35-55), וכתוצאה משיתוק רפה עולה שנגרם על ידי תאי מערכת החיסון אוטוריאקטיבים במערכת העצבים המרכזית. פרוטוקולים לזירוז מחלה וניטור יידונו.

המיאלין oligodendrocyte גליקופרוטאין (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) מושרה ניסויי אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) בעכברים C57BL / 6

מוצג פרוטוקול אופטימלי ליצירת נוגדנים חד-שבטיים המבוססים על טכנולוגיית ההיברידומה. עכברים חוסנו בחומר חיסוני. תאי הטחול התמזגו על ידי PEG ודחף חשמלי עם תאי מיאלומה אלמותיים. תאי היברידומה המייצרים נוגדנים נבחרו על ידי HAT ובדיקת ELISA ספציפית לאנטיגן.

הדור של Murine חד-שבטיים נוגדנים על ידי Hybridoma טכנולוגיה

מאמר זה מספק נוהל מפורט על ההכנה ועל הערכה של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים לשימוש immunoassays שונים. הליך זה כולל חיסונים, תא היתוך, עקיף ELISA תחרותי שיבוט חיובי ההקרנה, ליפידים monoclonal הכנה. המפרט עבור אפיון נוגדנים באמצעות MALDI-תוף-MS וניתוחים אליסה הינם גם מסופקים.

דור של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים

כתב יד זה מציג פרוטוקול כדי לגרום אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית פעילה (EAE) בעכברים. שיטה לבידוד ואפיון של לימפוציטים הסתננו במערכת העצבים המרכזית (CNS) מוצגת גם כדי להראות כיצד לימפוציטים מעורבים בהתפתחות של מחלת החיסון האוטואימונית CNS.

זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

פרוטוקול זה מתאר את השלבים לגרימת דלקת אובאיטיס מיקובקטריאלית (PMU) בעכברים. שיטה זו מתארת את השלבים שיעזרו לייצר דלקת עיניים אמינה וחזקה במערכת מודל העכבר. באמצעות פרוטוקול זה, יצרנו עיניים אוביטיות ועיניים של עמיתים לא מודלקים מחיות בודדות לצורך הערכה נוספת עם מבחנים אימונולוגיים, תעתיקיים ופרוטאומיים.

דלקת אובאיטיס מיקובקטריאלית ראשונית (PMU) כמודל לאובאיטיס פוסט-זיהומית

כדי לגרום לאנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית, מודל חייתי של טרשת נפוצה, עכברים מחוסנים בתחליב מים בשמן המכיל אוטואנטיגן ואדג'ובנט שלם של פרוינד. בעוד שקיימים מספר פרוטוקולים להכנת אמולסיות אלה, מוצג כאן פרוטוקול הומוגניזציה מהיר, פשוט וסטנדרטי להכנת אמולסיה.

שיטת הומוגניזציה מהירה, פשוטה וסטנדרטית להכנת אמולסיות אנטיגן/אדג'ובנטיות לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חלופי לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית בעכברי C57BL/6, תוך שימוש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG)35-55 אפיטופ אימונוגני המושהה באדג'ובנט של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium  paratuberculosis שהומת בחום.

פעילות אדג'ובנטית של Mycobacterium paratuberculosis בשיפור האימונוגניות של אוטואנטיגנים במהלך אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

עכברים בדרך כלל עמידים לזיהומים על ידי Mycobacterium abscessus, מה שמסבך את הגילוי והפיתוח של אנטיביוטיקה נחוצה מאוד נגד זיהומים ריאתיים. כאן, אנו מתארים שיטה להכנת חיסון וזיהום תוך-קנה שהוכח כגורם לזיהום מתמשך בעכברים בעלי יכולת חיסונית.

הכנת מורסה מיקובקטריום משובצת חרוז אגר לחיסון עכברים בעלי יכולת חיסונית תוך קנה הנשימה

למדו על ניהול פסיבי של נוגדנים חד שבטיים נגד Histoplasma capsulatum בעכברי C57BL/6. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לבחון את יעילות החיסון ההומורלי נגד זיהומים פטרייתיים ולפתח אסטרטגיות טיפול חדשות.

מינהל פסיבי של נוגדנים חד שבטיים נגד ח capsulatum ואחרים פתוגנים פטרייתיים

גלה סרטונים נוספים