Name: הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-02T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: למדו שיטה להרחבת וטיהור תאי NK אנושיים לחקר אימונולוגיה וטיפול בסרטן. הפרוטוקול מייצר הרחבה של 21,000 מונים תוך 21 יום עם פעילות ציטוטוקסית גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות לורנס קופר, Harjeet סינג, ואת לנקה Hurton עבור עבודתם ביצירת הראשונית K562 aAPC ו mIL21 וקטורים היתוך. מימון עבור עבודה זו סופק על ידי תוכנית MD Anderson UT רופא המדען, קרן Baldrick סנט, ואת אגדות Friendswood.

<ol><li>McKenna, D. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practices+production+of+natural+killer+cells+for+immunotherapy%3A+a+six-year+single-institution+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practices production of natural killer cells for immunotherapy: a six-year single-institution experience.</a> Transfusion. 47, 520-520 (2007).</li>
<li>Koehl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+highly+purified+NK+cells+for+immunotherapy+after+haploidentical+stem+cell+transplantation+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Klinische+Padiatrie%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of highly purified NK cells for immunotherapy after haploidentical stem cell transplantation in children.</a> Klinische Padiatrie. 217, 345-345 (2005).</li>
<li>Klingemann, H. G., Martinson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">ex vivo expansion of natural killer cells for clinical applications.</a> Cytotherapy. 6, 15-15 (2004).</li>
<li>Ayello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cord+blood+natural+killer+and+lymphokine+activated+killer+lymphocytes+following+ex+vivo+cellular+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Characterization of cord blood natural killer and lymphokine activated killer lymphocytes following ex vivo cellular engineering.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 12, 608-608 (2006).</li>
<li>Carlens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+in+vitro+expansion+of+cytotoxic+human+CD3-CD56%2B+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new method for in vitro expansion of cytotoxic human CD3-CD56+ natural killer cells.</a> Hum Immunol. 62, 1092-1092 (2001).</li>
<li>Boissel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+increase+expansion+of+cord+blood+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord mesenchymal stem cells increase expansion of cord blood natural killer cells.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 14, 1031-1031 (2008).</li>
<li>North, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed+human+natural+killer+cells+lyse+NK-resistant+tumor+targets%3A+evidence+of+a+two-stage+process+in+resting+NK+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed human natural killer cells lyse NK-resistant tumor targets: evidence of a two-stage process in resting NK cell activation.</a> J Immunol. 178, 85-85 (2007).</li>
<li>Berg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical-grade+ex+vivo-expanded+human+natural+killer+cells+up-regulate+activating+receptors+and+death+receptor+ligands+and+have+enhanced+cytolytic+activity+against+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Clinical-grade ex vivo-expanded human natural killer cells up-regulate activating receptors and death receptor ligands and have enhanced cytolytic activity against tumor cells.</a> Cytotherapy. 11, 341-341 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+highly+cytotoxic+human+natural+killer+cells+for+cancer+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy.</a> Cancer Res. 69, 4010-4010 (2009).</li>
<li>Fujisaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+potential+of+human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Replicative potential of human natural killer cells.</a> Br J Haematol. 145, 606-606 (2009).</li>
<li>Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+expansion+of+natural+killer+cells+with+high+cytotoxicity+by+K562+cells+modified+to+co-express+major+histocompatibility+complex+class+I+chain-related+protein+A%2C+4-1BB+ligand%2C+and+interleukin-15%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Ex vivo expansion of natural killer cells with high cytotoxicity by K562 cells modified to co-express major histocompatibility complex class I chain-related protein A, 4-1BB ligand, and interleukin-15.</a> Tissue Antigens. 76, 467-467 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

NK הרחבת התא ומדיה הפעלה (NKEM) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 90% RPMI 1640 (Cellgro) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10% עוברית שור סרום (Gibco) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x פניצילין / סטרפטומיצין (Cellgro) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x-L-גלוטמין (Gibco) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר מדיה לפני השימוש. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 U / mL IL2 (Proleukin, חיסונים נוברטיס אבחון, Inc) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - מדולל ממלאי IU / μl 200. הוסף IL2 לכמות הרצויה של התקשורת רק לפני השימוש בכל פעם. </li></ul></li></ul> PBMC ו NK תא בידוד <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ficoll-Paque (GE Healthcare) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Alsever של פתרון (Sigma) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RosetteSep האדם העשרה NK תא קוקטייל (Stemcell טכנולוגיות) </li></ul> Cytotoxicity NK Cell Assay <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calcein-AM (Invitrogen) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון הוא במלאי בחנות, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​קפוא 50 aliquots μL. ממיסים בתקשורת NKEM להשיג דילול הרצוי עבור צביעת התא. </li></ul></li></ul> נוגדנים הרשימה של נוגדנים המשמשים phenotyping תא NK המפורטות בטבלה להלן; <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> נוגדן </td><td> נפח לכל מבחן </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> Tube 1 </td><td valign="top"> אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC אלוטיפ FITC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 555748 555749 557224 340442 </td></tr><tr><td> Tube 2 </td><td valign="top"> CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 אלכסה 647 FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 558407 558563 557991 555341 557710 </td></tr><tr><td> Tube 3 </td><td valign="top"> CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2 / 3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 5 5 70 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen R &amp; D מערכות Miltenyi BIOTEC R &amp; D מערכות BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071 </td></tr><tr><td> Tube 4 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen </td><td valign="top"> 340410 555388 555341 558664 </td></tr><tr><td> Tube 5 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 559789 555341 51-1609-42 </td></tr><tr><td> Tube 6 </td><td valign="top"> CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS הצפת סך נפח </td><td valign="top"> 5 5 5 5 80 100 </td><td valign="top"> BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences </td><td valign="top"> 340410 550816 555341 17-1979-42 </td></tr></tbody></table>

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים nk

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells 

טבעיים (NK) תאים הרוצח לשחק תפקיד חשוב במעקב החיסונית כנגד מגוון רחב של מיקרואורגניזמים גידולים זיהומיות. זמינות מוגבלת של תאים NK ואת היכולת להרחיב את במבחנה הגביל התפתחות של תא חיסוני NK. כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב את כמויות עצומות של תפקודי vivo לשעבר בתאי NK באמצעות K562 תאים להביע קרום הנכנס IL21, כתא אנטיגן הצגת מלאכותי (aAPC). טיפולים NK תא המאמצת עד כה נוצלו מוצר תא מתקבל על ידי leukapheresis היציב של התורם ואחריו דלדול בתאי T או סלקציה חיובית של תאים NK. המוצר מופעל בדרך כלל IL-2 לילה ומנוהלים אז למחרת 1. בשל שכיחות נמוכה של תאים NK בדם ההיקפי, מספר קטן יחסית של תאים NK הועברו בניסויים קליניים. חוסר היכולת להפיץ בתאי NK במבחנה כבר את הגורם המגביל להפקת מספרים תא מספקת תוצאה קלינית אופטימלית. יש הרחבה של תאים נ&quot;ח (פי 5-10 על 1-2 שבועות) יש להיות מושגת באמצעות מינון גבוה של IL-2 בלבד 2. הפעלה של תאים T עצמיים יכולים לתווך הרחבת התא NK, ככל הנראה גם באמצעות שחרור ציטוקין המקומי 3. תמיכה עם stroma mesenchymal או תאים מלאכותיים הצגת אנטיגן (aAPCs) יכול לתמוך את התפשטות תאים NK מדם הן פריפריה דם טבורי 4. NKp46 משולב והפעלה CD2 ידי נוגדן חרוזים מצופים משווק כיום להרחבת התא NK (Miltenyi BIOTEC, אובורן CA), וכתוצאה מכך כ -100 הרחבה של פי 21 ימים. ניסויים קליניים תוך שימוש aAPC-מורחבת או המופעל בתאי NK נמצאים בעיצומם, אחד באמצעות שורת תאים leukemic CTV-1 אל התאים הממשלה להפעיל NK 5 ללא הרחבה משמעותית. במשפטו השני מנצל EBV-LCL להרחבת התא NK, השגת הרחבה 490 פי פירוש ב 21 ימים 6. השלישי מנצל aAPC K562 מבוססי transduced עם 4-1BBL (CD137L) ואת קרום הנכנס IL-15 (MIL-15) 7, אשר השיגה הרחבה נ&quot;ק ממוצע 277 של פי 21 ימים. אמנם, התאים נ&quot;ח הרחיבה באמצעות K562-41BBL-mIL15 aAPC הם ציטוטוקסיים מאוד במבחנה in vivo בהשוואה לתאי NK מורחבת, ולהשתתף ADCC, התרבות שלהם מוגבל על ידי ההזדקנות המיוחסת התקצרות הטלומרים 8. לאחרונה התרחבות של פי 350 של תאים NK נמסר באמצעות K562 מיקה להביע, 4-1BBL ו IL15 9. השיטה שלנו הרחבת התא NK המתוארים כאן מייצר התפשטות מהירה של תאים NK ללא הזדקנות השגת הרחבה 21,000 פי חציון 21 ימים.

כאן אנו מתארים שיטה יעילה להרחיב ולטהר מספר גדול של תאים NK האדם להעריך את תפקידם.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

תאי NK (תאים ממיתים טבעיים) ממלאים תפקיד חשוב במעקב חיסוני נגד מגוון של מיקרואורגניזמים זיהומיים וגידולים. זמינות מוגבלת של...

המטרה הכוללת של הליך זה היא הרחבה מהירה של מספרים גדולים של תאי NK אנושיים. בשלב ה-Ex vivo, התחל בבידוד p BMCs או תאי NK מדגימת buffy coat או מדגימת דם מלא. לאחר מכן, בצע תרבית משותפת (co-culture) של pbmc עם תאים מציגי אנטיגן מלאכותיים להרחבת תאי NK.מדיה מועשרת ב-IL-2 משמשת לתחזוקת תרבית של תאי NK למשך שלושה שבועות עם גרייה שבועית באמצעות aPCs, תוך הקפדה לשמור על מספר תאי ה-NK מתחת ל-1×10⁶ למילליטר של תרבית. לבסוף, המדיה מאפשרת לתקף את היעילות התפקודית של תאי ה-NK שהורחבו באמצעות בדיקת ציטוטוקסיות שאינה רדיואקטיבית. תנובת טיפוסית של תאי NK בשיטת הרחבה זו מניבה הרחבה חציונית של 21,000 מפעמים של תאי NK בסוף 21 ימים, בעלי ציטוטוקסיות גבוהה נגד גידולים שונים כפי שנקבע באמצעות בדיקת שחרור סידן.סרטון רפואי זה יכול לסייע במתן תשובה לשאלה מרכזית בתחום הביולוגיה של תאי NK, מכיוון שבאופן היסטורי היה קושי רב להשיג מספרים גדולים של תאי NK. לטכניקה זו יש השלכות על האימונותרפיה של סרטן בבני אדם, מכיוון שבאופן היסטורי היה קושי רב לייצר מספיק תאי NK לצורך טיפול כזה. סיסלי, עוזרת המחקר הבכירה במעבדה שלי, תדגים טכניקה זו להשגת PBMC מדם של תורמים בריאים.בדרך כלל משתמשים בשכבת Buffy coat מבנק דם כמקור. ראשית, יש להוסיף PBS כדי להתאים את נפח ה-Buffy coat ל-140 milliliters. לאחר מכן, יש להניח שכבה של 35 milliliters מהדגימה על 15 milliliters של fial PA עבור הפרדה במרכזפוגה בשיטת מדרג (gradient separation) במהירות של 400 G למשך 20 דקות.ללא שבירה. השב את ה-P BMCs בזהירות מממשק הפלזמה של Fial PA והנח בצד את מבחנת ה-RBCs לשימוש מאוחר יותר. שטוף את ה-P BMCs שלוש פעמים עם PBS, תוך סבוב בצנטריפוגה בכל פעם ב-400 G למשך 10 דקות.השתמש בחלק זה של P BMCs להרחבת תאי NK. כעת חזור לשפופרת הגרדיאנט. שאב החוצה את ה-fi.העבירו את ה-RBCs לשני מבחנות צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר ושטפו בעזרת PBS שנוסף עד לסימון של 50 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, שאבו את העלייה על ידי skimming של החלק העליון של שכבת ה-RBCs, כדי להסיר גרנולוציטים.בצעו שלושה שטיפות, ולאחר מכן השביו את ה-RBCs בנפח שווה של תמיסת else ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד. ניתן להשתמש בפרקציית RBCs זו לטיהור של תאי NK בשיטת roset SEP בתום שבועיים של הרחבה. כדי להרחיב ביעילות תאי NK תפקודיים ex vivo, השתמשו בתאי K 5 62 clone nine עם IL 21 קשור לממברנה, אשר יכונו להלן K 5 62.תאי Clone nine IL 21 משמשים כתא מלאכותי מציג אנטיגן. ראשית, ספרו את ה-pbmc וחשבו את הנפח הדרוש ל-5×10⁶ תאים שיושבו לצורך הרחבת תאי NK. עבור כל 5×10⁶ תאי pbmc, הקרינו 10×10⁶ תאי K 5 62 clone nine IL 21. באמצעות מקרין גמא ב-100 Gray, ניתן להקפיא את התאים המוקרנים לשימוש עתידי. כעת, שטפו את התאים שהוקרנו מראש ב-PBS והשביו אותם למדיה להרחבת תאי NK.כעת יש לערבב יחס של שניים לאחד של תאים שהוקרנו עם pbmc ב-40 milliliters של מדיום להרחבת תאי NK, ולהניח את בקבוק ה-T 75 במצב אנכי באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide. ביום השלישי, יש להפיק את התאים המגורה באמצעות סרכזגציה ב-400 G למשך חמש דקות, להחליף מחצית מהמדיום ב-NKEM טרי ולהמשיך בתרבית. יש לחזור על החלפת המדיום ביום החמישי. בתום שבוע, ספרו את מספר התאים והפרידו 5×10⁵ תאים לצורך פנוטיפינג באמצעות ציטומטריה של זרימה. עבור הגירוי השני, ספרו והקרינו יחס של אחד לאחד של K 5 62.בצעו שיבוט של תשעה תאי IL 21 כדי להרחיב את אוכלוסיית התאים, ולאחר מכן שלבו את התאים במדיום להרחבת תאי NK בריכוז של 2.5 × 10⁵ תאים סה"כ למילליליטר. העבירו כעת את התאים לבקבוקי T 75 והמשיכו בטיפוח; בימים 10 ו-12 בצעו מעבר (passage) של התאים במדיום להרחבת תאי NK בריכוז של 2.5 × 10⁵ תאים למילליליטר. ביום ה-14 להרחבה, ספרו שוב את התאים ובצעו ניתוח פנוטיפי של דגימה באמצעות ציטומטריה עם זרימה.טהרו את הרחבת התאים זו, שנגזרה מ-PBMC, באמצעות פרוטוקול טיהור rosette SEP ואמתו את טהוריות תאי ה-NK באמצעות פנוטיפ של ציטומטריית זרימה. בצעו סטימולציה שלישית על תאי ה-NK המטוהרים באמצעות יחס של אחד ለአחד של תאי irradiated K 5 62 clone nine IL 21. לבסוף, ביום 21, נתחו את תאי ה-NK שהורחבו באמצעות ציטומטריית זרימה תוך שימוש בפאנל נוגדנים מלא לפנוטיפ.הקפיאו מנות של תאים ב-FBS המכיל 10% DMSO בצפיפות מקסימלית של 5×10⁷ תאים למבחנה. השתמשו בתאי NK טריים או קפואים לצורך בדיקת הציטוטוקסיות. אם משתמשים בתאי NK קפואים, ראשית הפשירו מבחנה של תאי NK וזרועים אותם ב-NKEM למשך 24 שעות כדי לאפשר התאוששות של התאים ביום הבדיקה; השהו 10⁶ תאי מטרה ב-1 ml של NKEM המכיל calcium am והדגירו למשך שעה אחת ב-37 °C עם ניעור מדי פעם; בלוח UBO בעל 96 בארות, הוסיפו בשלוש חזרות 200 µL של תאי NK המשהים בריכוז של 1×10⁶ תאים ל-ml ובצעו דילול סדרתי של התאים כפי שצוין.לאחר שעה של טעינת סידן, שטפו את תאי המטרה במצע להתרבות של תאי NK פעמיים על ידי סבוב במערך צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-400 G. כעת ספרו מחדש את תאי המטרה וסספנדו אותם בריכוז של 10⁵ תאים למילליליטר. הוסיפו 100 µL של תאי מטרה לכל באער בלוח 96 באערים וסובבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-100 G כדי ליצור מגע בין התאים, ולאחר מכן הדגירו ב-37 °C וב-5% carbon dioxide למשך ארבע שעות.על מנת להשעות באופן אחיד את הסידן ששוחרר, ערבבו בעדינות את התרבית באמצעות פיפטא (pipetting) של תאי המשקע ב-100 G למשך חמש דקות, והעבירו 100 µL של הנוזל העליון (supernatant) לפלטת 96 בארות חדשה בעלת תחתית שטוחה, תוך הקפדה להימנע מבועות; במידת הצורך, פוצצו בועות שעלולות להיווצר באמצעות מחט דקה. קראו את הפלטה באמצעות קורא פלטות פלואורסצנטי המוגדר עם מסנן עירור של 485 nm ומסנן פליטה של 530 nm.חשבו את אחוז הליזה הספציפית. בדרך כלל, הרחבה של 5×10⁶ PBMC שבודדו מ-buffy coat מניבה בין 1×10⁹ ל-10¹⁰ תאי NK; תאי ה-NK המורחבים מביעים קולטני NK שונים הדומים לאלו של תאי NK ראשוניים שאינם מורחבים ב-buffy coat.תאי NK עשויים להוות 2% עד 18% מה-pbmc ביום ה-14. טיהור באמצעות Rosette SEP של תאים שהורחבו יכול להביא להתאוששות של 40% עד 70% מתאי ה-NK שנמצאים בתרבית, ברמת טוהר של 99% של תאי NK כפי שהוכח על ידי CD3 negative CD56 positive. תאי NK שהורחבו הפגינו ציטוטוקסיות נגד מגוון של שורות תאי גידול, כולל נוירובלסטומה, AML, אוסטאוסרקומה ומלנומה.כאן מוצגת הריגה מייצגת של A ML כאחוז ליזיס ספציפי. סרטון ה-BIOT בשידור חי מראה הריגה של תאי NK של קו תאי נוירובלסטומה CHP 1 34 הטעונים בסידום am לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח של ייצור ציטוקינים על ידי תאי NK והעברה אדפטיבית במודלים של גידולים בבעלי חיים, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לתפקודי תאי ה-NK.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן להרחיב ולטהר מספרים גדולים של תאי NK. ניתן לבצע זאת ישירות מתאי PBMC, ולאחר מכן לטהר את תאי ה-NK, או שניתן להתחיל את ההרחבה באמצעות תאי NK שטוהרו בשיטת הרוזטה. בשלב התחלתי, Buffy coat טיפוסי יניב בין 15 ל-40 מיליון תאי NK, שכולם יכולים לשמש להרחבת מספרים גדולים מאוד של תאי NK באמצעות התוכנית המתוארת בשיטה זו.

expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מתארים שיטה להפעלה והרחבת תאי NKT אדם מאוכלוסיות תאי T בתפזורת באמצעות תאי מציגי אנטיגן מלאכותיים (aAPC). השימוש בaAPC CD1d המבוסס מספק שיטה סטנדרטית ליצירת מספר רב של תאי NKT פונקציונליים.

Antigen המלאכותי הצגת תא הפעלה (aAPC) מתווכות והרחבת תאי T קטלניים טבעיים

סרטון זה מדגים טכניקה להרחבת תאי הרג טבעי (NK) ישירות מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) באמצעות קו תאי הזנה. PBMCs מתורבתים יחד עם תאים מזינים לימפובלסטואידים מהונדסים גנטית המבטאים אינטרלוקין-21 הקשור לקרום (mIL-21), ולתרבית מתווספים הציטוקינים אינטרלוקין-2 (IL-2) ואינטרלוקין-15 (IL-15). יחד, קוקטייל זה של ליגנדות מוביל להתרחבות ממושכת של תאי NK עם טוהר גבוה.

Ex Vivo התרחבות של תאי הרג טבעיים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח, הרחבה, ובתחום ההדמיה vivo של תאי NK הנגזרים מhESCs וiPSCs.

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

כאן אנו מציגים פרוטוקול מותאם שניתן להשתמש בו כדי ליצור מספר רב של תאי T רוצחים טבעיים קבועים של עכברים מטחול עכבר. הפרוטוקול מתאר גישה שבאמצעותה ניתן להעשיר תאי iNKT טחול, לבודד ולהרחיב אותם במבחנה באמצעות מספר מוגבל של בעלי חיים וריאגנטים.

שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר

שיטה פשוטה ואמינה מתוארת כאן כדי לנתח קבוצה של פונקציות תא NK כגון degranulation, ציטוקינים וייצור chemokine בתוך תת תא NK שונה.

Flow Cytometry מבוסס Assay עבור הניטור של פונקציות תא NK

שיטה מבוססת cytometry זרימה כדי לקבוע באופן כמותי את הפעילות ציטוטוקסיות של תאים אנושיים של הרוצח הטבעי מוצגים כאן.

וזמינותו Cytotoxicity מבוססי Cytometry זרימה להערכה של פעילות תאי NK אנושי

פרוטוקול לחקר אירועים המונעים על ידי FcγRIIIa על ידי נוגדנים טיפוליים בתאי הרג טבעיים אנושיים מתואר כאן. פלטפורמת גירוי מלאכותית זו מאפשרת חקירה של פונקציות אפקט במורד הזרם כגון degranulation, ייצור chemokine / ציטוקינים, ומסלולי איתות בתיווך FcγRIIIa וחלקי Fc של נוגדנים המעורבים בכריכה.

הערכה של אירועי תאי רוצח טבעי אנושי המונעים על ידי מעורבות FcγRIIIa בנוכחות נוגדנים טיפוליים

אנו מתארים פרוטוקול מהיר וחזק להעשרת תאי T (iNKT) של הרוצח הטבעי invariant מטחול העכבר ולהרחיב אותם במבחנה למספרים מתאימים למחקרי מבחנה ומחקרי ויוו.

טיהור והתרחבות של עכבר Invariant טבעי רוצח תאי T עבור במבחנה ו in vivo מחקרים

כאן אנו מציגים שיטה להרחבת ההרג הטבעי של הדם ההיקפי (PBNK), תאי NK מרקמות הכבד, ותאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-NK שמקורם בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) או דם טבורי (CB). פרוטוקול זה מדגים את התרחבותם של תאי NK ו-CAR-NK באמצעות תאי הזנה של 221-mIL-21 בנוסף לטוהר הממוטב של תאי NK מורחבים.

הריג טבעי (NK) ושיטת הרחבת תאי CAR-NK באמצעות קו תאי B מאוגד-IL-21-שונה

הפרוטוקול הנוכחי מראה כיצד להבדיל בין תאי CD3−/CD45+CD56+ עם ציטוטוקסיות קלה מתאי גזע פוטנציאליים מורחבים אנושיים (hEPSCs) בתנאי תרבית תלת-ממדית ודו-ממדית. זה מאפשר אימות פנוטיפי שגרתי ללא הרס של microenvironment מורכב.

יצירת תאי הרג טבעיים מתאי גזע פוטנציאליים מורחבים אנושיים

למדו שיטה להרחבת וטיהור תאי NK אנושיים לחקר אימונולוגיה וטיפול בסרטן. הפרוטוקול מייצר הרחבה של 21,000 מונים תוך 21 יום עם פעילות ציטוטוקסית גבוהה.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

גלה סרטונים נוספים