הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

המטרה הכוללת של הליך זה היא הרחבה מהירה של מספרים גדולים של תאי NK אנושיים. בשלב ה-Ex vivo, התחל בבידוד p BMCs או תאי NK מדגימת buffy coat או מדגימת דם מלא. לאחר מכן, בצע תרבית משותפת (co-culture) של pbmc עם תאים מציגי אנטיגן מלאכותיים להרחבת תאי NK.

מדיה מועשרת ב-IL-2 משמשת לתחזוקת תרבית של תאי NK למשך שלושה שבועות עם גרייה שבועית באמצעות aPCs, תוך הקפדה לשמור על מספר תאי ה-NK מתחת ל-1×10⁶ למילליטר של תרבית. לבסוף, המדיה מאפשרת לתקף את היעילות התפקודית של תאי ה-NK שהורחבו באמצעות בדיקת ציטוטוקסיות שאינה רדיואקטיבית. תנובת טיפוסית של תאי NK בשיטת הרחבה זו מניבה הרחבה חציונית של 21,000 מפעמים של תאי NK בסוף 21 ימים, בעלי ציטוטוקסיות גבוהה נגד גידולים שונים כפי שנקבע באמצעות בדיקת שחרור סידן.

סרטון רפואי זה יכול לסייע במתן תשובה לשאלה מרכזית בתחום הביולוגיה של תאי NK, מכיוון שבאופן היסטורי היה קושי רב להשיג מספרים גדולים של תאי NK. לטכניקה זו יש השלכות על האימונותרפיה של סרטן בבני אדם, מכיוון שבאופן היסטורי היה קושי רב לייצר מספיק תאי NK לצורך טיפול כזה. סיסלי, עוזרת המחקר הבכירה במעבדה שלי, תדגים טכניקה זו להשגת PBMC מדם של תורמים בריאים.

בדרך כלל משתמשים בשכבת Buffy coat מבנק דם כמקור. ראשית, יש להוסיף PBS כדי להתאים את נפח ה-Buffy coat ל-140 milliliters. לאחר מכן, יש להניח שכבה של 35 milliliters מהדגימה על 15 milliliters של fial PA עבור הפרדה במרכזפוגה בשיטת מדרג (gradient separation) במהירות של 400 G למשך 20 דקות.

ללא שבירה. השב את ה-P BMCs בזהירות מממשק הפלזמה של Fial PA והנח בצד את מבחנת ה-RBCs לשימוש מאוחר יותר. שטוף את ה-P BMCs שלוש פעמים עם PBS, תוך סבוב בצנטריפוגה בכל פעם ב-400 G למשך 10 דקות.

השתמש בחלק זה של P BMCs להרחבת תאי NK. כעת חזור לשפופרת הגרדיאנט. שאב החוצה את ה-fi.

העבירו את ה-RBCs לשני מבחנות צנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר ושטפו בעזרת PBS שנוסף עד לסימון של 50 מיליליטר. לאחר הצנטריפוגה, שאבו את העלייה על ידי skimming של החלק העליון של שכבת ה-RBCs, כדי להסיר גרנולוציטים.

בצעו שלושה שטיפות, ולאחר מכן השביו את ה-RBCs בנפח שווה של תמיסת else ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד. ניתן להשתמש בפרקציית RBCs זו לטיהור של תאי NK בשיטת roset SEP בתום שבועיים של הרחבה. כדי להרחיב ביעילות תאי NK תפקודיים ex vivo, השתמשו בתאי K 5 62 clone nine עם IL 21 קשור לממברנה, אשר יכונו להלן K 5 62.

תאי Clone nine IL 21 משמשים כתא מלאכותי מציג אנטיגן. ראשית, ספרו את ה-pbmc וחשבו את הנפח הדרוש ל-5×10⁶ תאים שיושבו לצורך הרחבת תאי NK. עבור כל 5×10⁶ תאי pbmc, הקרינו 10×10⁶ תאי K 5 62 clone nine IL 21. באמצעות מקרין גמא ב-100 Gray, ניתן להקפיא את התאים המוקרנים לשימוש עתידי. כעת, שטפו את התאים שהוקרנו מראש ב-PBS והשביו אותם למדיה להרחבת תאי NK.

כעת יש לערבב יחס של שניים לאחד של תאים שהוקרנו עם pbmc ב-40 milliliters של מדיום להרחבת תאי NK, ולהניח את בקבוק ה-T 75 במצב אנכי באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide. ביום השלישי, יש להפיק את התאים המגורה באמצעות סרכזגציה ב-400 G למשך חמש דקות, להחליף מחצית מהמדיום ב-NKEM טרי ולהמשיך בתרבית. יש לחזור על החלפת המדיום ביום החמישי. בתום שבוע, ספרו את מספר התאים והפרידו 5×10⁵ תאים לצורך פנוטיפינג באמצעות ציטומטריה של זרימה. עבור הגירוי השני, ספרו והקרינו יחס של אחד לאחד של K 5 62.

בצעו שיבוט של תשעה תאי IL 21 כדי להרחיב את אוכלוסיית התאים, ולאחר מכן שלבו את התאים במדיום להרחבת תאי NK בריכוז של 2.5 × 10⁵ תאים סה"כ למילליליטר. העבירו כעת את התאים לבקבוקי T 75 והמשיכו בטיפוח; בימים 10 ו-12 בצעו מעבר (passage) של התאים במדיום להרחבת תאי NK בריכוז של 2.5 × 10⁵ תאים למילליליטר. ביום ה-14 להרחבה, ספרו שוב את התאים ובצעו ניתוח פנוטיפי של דגימה באמצעות ציטומטריה עם זרימה.

טהרו את הרחבת התאים זו, שנגזרה מ-PBMC, באמצעות פרוטוקול טיהור rosette SEP ואמתו את טהוריות תאי ה-NK באמצעות פנוטיפ של ציטומטריית זרימה. בצעו סטימולציה שלישית על תאי ה-NK המטוהרים באמצעות יחס של אחד ለአחד של תאי irradiated K 5 62 clone nine IL 21. לבסוף, ביום 21, נתחו את תאי ה-NK שהורחבו באמצעות ציטומטריית זרימה תוך שימוש בפאנל נוגדנים מלא לפנוטיפ.

הקפיאו מנות של תאים ב-FBS המכיל 10% DMSO בצפיפות מקסימלית של 5×10⁷ תאים למבחנה. השתמשו בתאי NK טריים או קפואים לצורך בדיקת הציטוטוקסיות. אם משתמשים בתאי NK קפואים, ראשית הפשירו מבחנה של תאי NK וזרועים אותם ב-NKEM למשך 24 שעות כדי לאפשר התאוששות של התאים ביום הבדיקה; השהו 10⁶ תאי מטרה ב-1 ml של NKEM המכיל calcium am והדגירו למשך שעה אחת ב-37 °C עם ניעור מדי פעם; בלוח UBO בעל 96 בארות, הוסיפו בשלוש חזרות 200 µL של תאי NK המשהים בריכוז של 1×10⁶ תאים ל-ml ובצעו דילול סדרתי של התאים כפי שצוין.

לאחר שעה של טעינת סידן, שטפו את תאי המטרה במצע להתרבות של תאי NK פעמיים על ידי סבוב במערך צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-400 G. כעת ספרו מחדש את תאי המטרה וסספנדו אותם בריכוז של 10⁵ תאים למילליליטר. הוסיפו 100 µL של תאי מטרה לכל באער בלוח 96 באערים וסובבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-100 G כדי ליצור מגע בין התאים, ולאחר מכן הדגירו ב-37 °C וב-5% carbon dioxide למשך ארבע שעות.

על מנת להשעות באופן אחיד את הסידן ששוחרר, ערבבו בעדינות את התרבית באמצעות פיפטא (pipetting) של תאי המשקע ב-100 G למשך חמש דקות, והעבירו 100 µL של הנוזל העליון (supernatant) לפלטת 96 בארות חדשה בעלת תחתית שטוחה, תוך הקפדה להימנע מבועות; במידת הצורך, פוצצו בועות שעלולות להיווצר באמצעות מחט דקה. קראו את הפלטה באמצעות קורא פלטות פלואורסצנטי המוגדר עם מסנן עירור של 485 nm ומסנן פליטה של 530 nm.

חשבו את אחוז הליזה הספציפית. בדרך כלל, הרחבה של 5×10⁶ PBMC שבודדו מ-buffy coat מניבה בין 1×10⁹ ל-10¹⁰ תאי NK; תאי ה-NK המורחבים מביעים קולטני NK שונים הדומים לאלו של תאי NK ראשוניים שאינם מורחבים ב-buffy coat.

תאי NK עשויים להוות 2% עד 18% מה-pbmc ביום ה-14. טיהור באמצעות Rosette SEP של תאים שהורחבו יכול להביא להתאוששות של 40% עד 70% מתאי ה-NK שנמצאים בתרבית, ברמת טוהר של 99% של תאי NK כפי שהוכח על ידי CD3 negative CD56 positive. תאי NK שהורחבו הפגינו ציטוטוקסיות נגד מגוון של שורות תאי גידול, כולל נוירובלסטומה, AML, אוסטאוסרקומה ומלנומה.

כאן מוצגת הריגה מייצגת של A ML כאחוז ליזיס ספציפי. סרטון ה-BIOT בשידור חי מראה הריגה של תאי NK של קו תאי נוירובלסטומה CHP 1 34 הטעונים בסידום am לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח של ייצור ציטוקינים על ידי תאי NK והעברה אדפטיבית במודלים של גידולים בבעלי חיים, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לתפקודי תאי ה-NK.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן להרחיב ולטהר מספרים גדולים של תאי NK. ניתן לבצע זאת ישירות מתאי PBMC, ולאחר מכן לטהר את תאי ה-NK, או שניתן להתחיל את ההרחבה באמצעות תאי NK שטוהרו בשיטת הרוזטה. בשלב התחלתי, Buffy coat טיפוסי יניב בין 15 ל-40 מיליון תאי NK, שכולם יכולים לשמש להרחבת מספרים גדולים מאוד של תאי NK באמצעות התוכנית המתוארת בשיטה זו.