דרך פשוטה למדוד את רגישות אתנול זבובים
19 בפברואר 2011
Assay פשוט למדוד את ההשפעות מרגיעים של אתנול על תסיסנית זבובים, המבוסס על אובדן ליישר רפלקס, מתואר.
שלום, אני תומס מייפלס מהמעבדה של ד"ר אדריאן רותן במחלקה לפסיכיאטריה במרכז הרפואי UT Southwestern בדאלאס. היום אני אדגים פרוצדורה פשוטה לקביעת הרגישות של זבובים לסדציה הנגרמת על ידי אתנול. בדיקה זו מבוססת על אובדן רפלקס הרכיבה ויכולת ההליכה של הזבובים לאחר חשיפה לאתנול.
מדד זה יכול לשמש לקביעת הבדלים ברגישות לאלכוהול בין זנים שונים של דרוזופילה ולבין מוטנטים. ניתן להשתמש בבדיקה זו גם כדי להשרות סבילות בזבובים, כאשר סבילות היא תגובה מופחתת לאלכוהול לאחר חשיפה חוזרת. בואו נתחיל.
עבור ניסוי זה, תזדקקו למבחנות הבאות. עם שמונה זבובים פירות, דור שאספת יום או יומיים לפני כן. ניתן לבצע את החשיפות עם זכרים או נקבות.
עם זאת, כל מבחנה צריכה להכיל רק מין אחד. מבחנת מזון ריקה שאינה מכילה זבובים, סכין גילוח, שני פקקי מבחנה העשויים מחומר דמוי כותנה. אם אין ברשותכם פקקים מסוג זה, ניתן להשתמש גם בכדורי צמר גפן, מיקרופיפיה של 1000 microliter עם טיפים, אתנול בריכוז 200 proof המכיל מאכל צבע שניתן להשיג בכל חנות מכולת, וטיימר.
הדבר הראשון שעלינו לעשות הוא להכין תא חשיפה שבו נחשף את הזבובים לאתנול וננטר את הניידות שלהם. כדי ליצור תא זה, חתכו תחילה פקק של מבחנה לחצי באמצעות להב תער. לאחר מכן, דחפו את אחד החצאים לתחתית המבחנה כך שיכסה את המזון.
פעולה זו יוצרת משטח ישר שאינו דביק עליו יכולים הזבובים ללכת. אם אתם משתמשים בכדור צמר גפן, לחצו אותו למטה בצורה חלקה ונסו להפוך אותו לפחות סיבי ככל האפשר כדי שהזבובים לא ייתקעו בסיבי הצמר. אם אתם מכינים מספר תאים, ודאו שהמזון ופקק המבחנה תופסים את אותו נפח בכל תא.
פעולה זו מבטיחה שהזבובים בכל תא יהיו חשופים לאתנול בנפח זהה. עם תרגול, קל לחשוף שלושה מבחנות של זבובים במקביל. לאחר הכנת תאי החשיפה, ניתן כעת לחשוף את הזבובים לאתנול.
ראשית, העבירו מבחנה של שמונה זבובים לתא חשיפה, ואטמו את התא באמצעות הפקק של המבחנה שבה היו הזבובים במקור. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפט 500 µL של אתנול צבוע בריכוז שבחרתם על קצה אחד של פקק מבחנה דמוי כותנה. לאחר מכן, החליפו את הפקק של תא החשיפה בפקק המצופה באתנול, כאשר הקצה המצופה באתנול מוכנס לתוך התא.
מיד לאחר הוספת הפקק המצופה באתנול לתא החשיפה, הפעל טיימר. הצבע שבאתנול מסייע להבטיח שהאתנול פונה פנימה אל תא החשיפה ולא אל דופן הבקבוקון. דבר זה חשוב במיוחד אם נעשה שימוש בכדורי צמר במקום בפקקי buzz, מכיוון שכל צד של כדור צמר יכול לפנות פנימה אל הבקבוקון.
בחשיפה זו, אנו משתמשים ב-100% alcohol, אשר מפעפע כעת אל תוך תא החשיפה שבו הזבובים שואפים אותו מהאוויר. בכל דקה לאחר הוספת הפקג המצופה ב-ethanol לתא החשיפה, נספור כמה זבובים הפכו לנייחים, כלומר כאלה שאינם מסוגלים להתהפך ולהליכת. ככל שהזבובים נשארים ניידים זמן רב יותר, כך הם עמידים יותר בכל מרווח של דקה אחת.
הבהילו את הזבובים על ידי הקשה על התא על גבי השולחן, כדי להבטיח שכל הזבובים המסוגלים לזוז אכן זזים. צפו בזבובים במשך 10 שניות לאחר ההקשה כדי לאפשר להם להתחיל לנוע או להתהפך בכל מרווח של דקה אחת. תיעדו כמה משמונת הזבובים נישארים ללא תנועה בתחילת הניסוי.
מרבית הזבובים ירוצו במהירות במעלה דופן הבקבוקון לאחר שייבהלו. לאחר כשישה דקות של חשיפה ל-100% ethanol, הם יתחילו לנוע באיטיות ולעתים בצורה לא עקבית תוך 12 דקות. מרבית הזבובים יהיו ללא תנועה, ולא יוכלו ללכת או להיזדקף כאשר הם שוכבים על גבם.
יש לספור רק זבובים המסוגלים להושיב את עצמם וללכת כזבובים ניידים; זבובים המזיזים את רגליהם או כנפיהם במקום בלבד יש לספור כזבובים נייחים. זבובים שנותרים על גבם לאורך כל תקופת התצפית ייספרו אף הם כנייחים, שכן חוסר יכולתם להושיב את עצמם היא סימן להרעלה. זבובים המרעידים את כנפיהם בעוצמה לאורך כל זמן התצפית בן עשר השניות ייספרו כמו כן כנייחים, גם אם הם משנים את מיקומם. הרוב המכריע של זבובים אלו הם נייחים בין פרקי תנועת כנפיים מהירה.
לסיכום, זבובים המסוגלים להתהפך ולהליכה נחשבים לניידים; זבובים שאינם מסוגלים להתהפך, מזיזים את רגליהם וכנפיהם במקומם, או מרעידים את כנפיהם במהירות נחשבים לנייחים. אם נחיל כללים אלו, נראה כי מספר רב יותר של זבובים מסוג wild type הופכים לנייחים ככל שזמן החשיפה לאדי אתנול עולה. הערך שבו משתמשת בדיקה זו כדי לכמת את הרגישות לאתנול הוא זמן סדציה חציוני, או MST.
אנו מגדירים את ה-MST כדקות החשיפה לאתנול הנדרשות כדי שארבעה משמונת הזבובים בתא החשיפה יהפכו לנייחים. ערך זה נקבע בקלות אם בדיוק ארבעה זבובים נייחים בפרק זמן תצפית מסוים. לדוגמה, אם בדיוק ארבעה זבובים נייחים לאחר 11 דקות של חשיפה, הרי ש-11 הוא ה-MST.
אם בדיוק ארבע זבובים נישארים סטטיים לאחר 11 דקות של חשיפה ובדקה ה-12 המצב נשאר זהה, יש לקחת את הערך הראשון, שכן זהו הזמן שבו הזבובים הגיעו לראשונה ל-ST שלהם. אם ארבעה זבובים אינם סטטיים בפרק זמן תצפית ספציפי, יש לבצע אינטרפולציה ליניארית של הזמן שבו ארבעה זבובים הפכו לסטטיים. לדוגמה, אם מספר הזבובים הסטטיים קפץ משלושה לחמישה בין הדקה התשעית לעשירית של החשיפה, ניתן לקבוע גרפית שה-MST הוא 9.5. הנתונים הבאים שנאספו באמצעות בדיקה זו מראים כי מערך ניסויי זה הוא דרך מדויקת למדידת רגישות לאתנול.
בניסויים הבאים נעשה שימוש ב-N של ששה עד שמונה מבחנות, כפי שצוין בתוך הברים. ה-MST של זבובים זכרים מסוג wild type שנחשפו ל-100%Ethanol הוא בערך 11 דקות עם שגיאת תקן נמוכה. השונות מדי יום היא נמוכה ובמרבית המקרים אינה מובהקת סטטיסטית, אך אנו עדיין ממליצים למדוד את קבוצות הניסוי והביקורת במקביל באותו היום.
שימו לב גם לכך שהזבובים שנחשפו ביום A וביום B אינם אותם פרטים. אלו הם אחים המייצגים את אותו המאגר הגנטי; זבובים זכרים ונקבות שנחשפו ל-100% Ethanol אינם מראים הבדל ב-MST. עם זאת, אנו ממליצים להיצמד למין אחד.
אם נחשף זבובים זכרים ונקבות למינונים עולים של אתנול, נקבל עקומת תגובה למינון טובה המראה ירידה מובהקת סטטיסטית ב-MST כפונקציה של ריכוז אתנול גבוה יותר. בדיקה זו משחזרת גם פנוטיפים שפורסמו בעבר ונמדדו באמצעות מערך אידוי אתנול מורכב יותר; זבובים עם מוטציית right rabbit one הראו עלייה משמעותית ב-MST. עלייה זו נצפתה ב-100% וכן ב-90% Ethanol.
באמצעות בדיקה זו, אנו יכולים גם להשרות ולמדוד סבילות לאתנול ב flies. סבילות מוגדרת כהפחתה בתגובה לאלכוהול, בעקבות חשיפה מוקדמת לאלכוהול להשראת הסבילות. חשפו מבחנה של flies לאתנול למשך זמן השווה בקירוב לפעמיים ה-MST שלהם.
לדוגמה, אנו חושפים את זכרי ה-Berlin wild type למסננת של 100% ethanol למשך 24 דקות. לאחר החשיפה, הקישו בעדינות את שמונת הזבובים חזרה אל מבחנת המצע שלהם, שם תניחו להם להתאושש במשך ארבע שעות. רשמו את ה-MST המקורי של הזבובים על המבחנה לאחר ארבע שעות התאוששות, חשפו שוב את אותם הזבובים בדיוק לאותו מנה של ethanol ורשמו את ה-MST השני שלהם.
כפי שניתן לראות בגרף זה, ה-MST של החשיפה השנייה לאתנול גבוה משמעותית מה-MST של החשיפה הראשונה, מה שמעיד על כך שהזבובים פיתחו סבילות להשפעות המרדימות של האתנול. מדד לסבילות מחושב על ידי חלוקת ה-MST השני של מבחנה נתונה של זבובים ב-MST הראשון של אותם זבובים, והחסרת 1 מהתוצאה; הערך מבוטא כאחוז סבילות, שבמקרה שלנו הוא כ-50%. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר בדיקה פשוטה למדידת השפעות הסדציה של אתנול בזבובי דרוזופיליה (Drosophila), תוך התמקדות באובדן רפלקס הזקיפה. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להעריך הבדלים ברגישות לאלכוהול בין זנים שונים ומוטציות של זבובים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התנהגותית
- רגישות לאלכוהול
רקע
- Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל לחקר השפעות האתנול.
- אובדן רפלקס ההזדקפות הוא מדד נפוץ לסדציה בזבובים.
- הבנת הרגישות לאלכוהול יכולה לספק תובנות לגבי השפעות גנטיות וסביבתיות על התנהגות.
- ניתן להשתמש במבחן זה גם כדי לחקור התפתחות של סבילות בזבובים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה למדידת סדציה המושרית על ידי אתנול ב-Drosophila.
- כימות הבדלים ברגישות לאלכוהול בין זני זבובים שונים.
- בדיקת ההשפעות של חשיפה חוזרת לאתנול על סבילות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תאי חשיפה באמצעות מבחנות ופקקים.
- מריחת אתנול על תא החשיפה להרגעת הזבובים.
- תצפית על ניידות הזבובים ויכולת ההתהפכות לאחר החשיפה.
- חישוב זמן ההרגעה החציוני (MST) על סמך התנהגות הזבובים.
תוצאות עיקריות
- זבובים מפגילים טשטוש מוגבר עם זמני חשיפה ממושכים יותר לאתנול.
- ה-MST עבור זבובים זכרים מסוג בר (wild type) שנחשפו ל-100% אתנול הוא כ-11 דקות.
- שונות ברגישות נצפית בין זני זבובים שונים.
- הבדיקה מספקת כימות ברור של הרגישות לאתנול.
מסקנות
- בדיקה זו היא כלי יעיל לחקר רגישות לאתנול ב-Drosophila.
- התוצאות יכולות לספק מידע למחקרים על גורמים גנטיים המשפיעים על התגובה לאלכוהול.
- ניתן להתאים את השיטה לתכנונים ניסויים שונים במחקרי התנהגות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
מדידה כמותית של סדציה המושראת על ידי אתנול ב-Drosophila מספקת מודל חסון לניתוח מנגנונים גנטיים ונוירו-התנהגותיים העומדים בבסיס רגישות וסבילות לאלכוהול. בדיקה זו מאפשרת תיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים והפחתת סיכונים מכניסטיים עבור פורטפוליו של נוירופרמקולוגיה המתמקד בביולוגיה של התמכרויות. הפשטות והשחזוריות שלה תומכות בסריקה ניתנת להרחבה ובהשוואות בין זנים, ובכך מגבירות את הביטחון החזוי במסלולי מחקר תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של גורמים גנטיים המשפיעים על רגישות וסבילות לאתנול.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של גנים מועמדים או מסלולים המעורבים בתגובה לאלכוהול.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות פנוטיפים התנהגותיים במגוון זנים ומוטנטים.
- מספק מדד הניתן לשחזור לצורך תיעוד ותיעדוף מטרות במחקר של ביולוגיה של התמכרויות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק בדיקה כמותית ואחידה להערכת פנוטיפים של סדציה המושרית על ידי אתנול.
- תומך בחזרתיות ובניתביות עם דרישות טכניות מינימליות.
- מאפשר בדיקה מקבילה של מספר גנוטיפים או תנאים ניסיוניים לצורך ניתוח השוואתי.
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו ולידציה עבור תהליכי סריקה גנטית או סריקת תרכובות בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם נקודות קצה התנהגותיות רלוונטיות למחלה לצורך מידול של הפרעות בשימוש באלכוהול.
- מספק רצף מגילוי גנטי ועד לתיקוף פרה-קליני של תרכובות נוירו-אקטיביות.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמת סיכונים על בסיס תוצאות התנהגותיות כמותיות.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור בין גנוטיפ לפנוטיפ.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
בדיקה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקה גנטית מוקדמת ועד לתיקוף התנהגותי פרה-קלני, ובכך היא תומכת הן בזיהוי מטרות והן במחקרים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: מכמת תגובות התנהגותיות לאתנול לצורך בחינת השערות והבהרת מסלולים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור (זמן הרדמה חציוני) להשוואות בין תנאים שונים.
- אנליזה: מספקת נקודות קצה סטטיסטיות (MST, עקומות תגובה למסלול) לביסוס קבלת החלטות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים גנטיים למודלים פרה-קליניים של רגישות וסבילות לאלכוהול.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לרקעים גנטיים שונים ולמערכי ניסוי מגוונים בקרב צוותי מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות ובמחקרים מכניסטיים של תגובה לאלכוהול.
- ערך תפעולי: מפשט את הקמת הבדיקה, ומאפשר יצירה מהירה וניתנת לשחזור של נתונים בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות יעילה של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי פיתוח של נוירופארמקולוגיה.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תיעדוף של מטרות ומודלים למסלולי מחקר של התמכרויות, מותאם לסיכונים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בסיסית בטיפול ב-Drosophila ובתצפית התנהגותית.
- נדרש מינימום של ציוד — מבחנות זבובים סטנדרטיות, פפטות וטיימרים מספיקים.
- סטנדרטיזציה של הגדרת תא החשיפה היא קריטית לשחזוריות בין ניסויים.
- הבדיקה ניתנת להתאמה לזני זבובים, למגדרים ולריכוזי אתנול שונים.
- מומלץ לבצע מדידה מקבילה של קבוצות ביקורת וקבוצות ניסוי באותו היום כדי למזער שונות.
