שיטות העברה מהירים לוקליזציה של פתוגנים מחלת ליים בתוך גוט טיק

המטרה הכוללת של הליך זה היא להזריק מיקרו ולמקם תאי בורליה ברג דה פרי במעיים של הקרציות. זה מושג על ידי הכנת מחטי נימי הזכוכית ומילוין בתאי beberg de ferry. לאחר מכן, תאי הדחייה של הבברג מועברים לתוך מעי הקרציות באמצעות מיקרו-הזרקה.

לאחר מכן מנתחים את הקרצייה ומסירים את רקמות המעיים. לבסוף, מבוצע תיוג אימונופלואורסצנטי של דחיית בברג במעי הקרציות. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המדגימות לוקליזציה של בברג למעבורת במעי הקרציות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

היי, אני ד"ר רות פול פול, עוזרת פרופסור באוניברסיטת מרילנד במחלקה לרפואה וטרינרית. היום שניים מחברי המעבדה שלי טורו קהיר, פוסט-דוקטורנט ואדם קולמן, סטודנט לתואר שני, יראו לכם את ההליך להדבקה מלאכותית של קרציות באמצעות מיקרו-הזרקה שאנו מבצעים באופן שגרתי במעבדה. לאחר המיקרו-הזרקה, ננתח את הקרצייה ונדמה את החיידקים במעיים של הקרציות באמצעות מיקרוסקופ CE קונפוקלי.

היתרון העיקרי של מיקרו-הזרקת קרציות של דור של קרציות נגועות טבעיות הוא משך ההליך. מיקרו-הזרקה מקצרת את כל ההליך משעות שבוע מכיוון שנדרשים כחמישה שבועות כדי לייצר קרציות נגועות בתהליך האכלה טבעי. ניתן להתאים טכניקה זו גם להזרקת ריאגנטים שימושיים אחרים כגון RNA דו-גדילי ל-RNAi או אנטי-סרה להפרעות נוגדנים ספציפיות בתוך הקרצייה.

כדי להתחיל לייצר מספר מחטי מיקרו-הזרקה על ידי חימום ומשיכה של צינורות נימי זכוכית מילימטר אחד במכשיר משיכת מיקרופיפט זכוכית. הסר בזהירות את צינורות הנימים השבירים. אחסן את המחטים המאוגדות כשהקצה פונה כלפי מעלה על סרט דבק בצלחת פטרי.

לאחר מכן, גדל את המעבורת בתרבות BSK. בינוני עד ריכוז של כ-10 לשבעת התאים לכדור מיליליטר b berg de ferry על ידי צנטריפוגה ב-3000 פעמים G למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, הסר את ה-snat והשהה מחדש לחלוטין את הגלולה במדיום BSK על ידי מעבר עדין דרך מיקרו-טיפ סטרילי של 200 מיקרוליטר לריכוז סופי של 10 עד תשעת התאים למיליליטר.

מכיוון שהתאים מושעים מחדש בצפיפות תאים גבוהה ועלולים להתקבץ יחד, יש להשתמש בתרחיף התאים מיד להזרקת מיקרו להכנת קרציות, להניח סרט דבק דו צדדי שקוף על מגלשת זכוכית העובדת על מחצלת דביקה, להסיר בזהירות קרציות מהמיכל בעזרת מברשת קטנה הנח את המספר הנדרש של קרציות להזרקה על סרט ההדבקה בצד הגחון כלפי מעלה לאותו כיוון. טען חמישה מיקרוליטר מתרבית beberg de ferry לתוך מחט הנימים המאוגדת. בעזרת עומס מיקרו של 20 מיקרוליטר של קצה פיפט, בדוק את המחט לאיתור בועות אוויר כלואות וטען מחדש את המחט בתרבית חיידקים.

במידת הצורך, צפו בקרצייה תחת מיקרוסקופ דו-עיני המנתח, והתמקדו באזור הצמצם האנאלי של הקרצייה. גע בעדינות בקצה המחט הנימים על מנת לשבור את הצינור שבו הקוטר מעט קטן מזה של הצמצם האנאלי של הקרצייה היוצר את מחט המיקרו-הזרקה. שלב זה הוא קריטי שכן כל ניסיון להזריק לקרציות קצות מחט לא מתאימים גורם לפציעה ולמוות אפשרי.

אל הקרצייה המוזרקת. הנח את הקרציות המשותקות מתחת למיקרוסקופ המשקפת המנתח והתמקד בצמצם האנאלי, המכוסה בשתי צלחות אנאליות הניתנות להזזה. בעזרת מלקחיים עדינים, גע בעדינות והפעל לחץ עדין מאוד על כל אזור ליד פתח פי הטבעת.

זה יאפשר הפרדה של הלוחות האנאליים ופתיחת הנקבוביות האנאליות המתחברות למעיים. הכנס בזהירות את קצה המחט מעט לפתח פי הטבעת דרך הפתיחה הכפויה של הלוחות האנאליים. יש לשמור על החדרת מחט למינימום מכיוון שקצה הזכוכית עלול לפגוע במעי האחורי השקוף למחצה שמתחבר לרקטום.

שימוש במזרק מיקרו המצויד בבקרת כף רגל אוטומטית להזריק תמיסת beberg de ferry באמצעות הפרמטרים הבאים. לחץ הזרקה של 1000 הקטור פסקל 0.2 שניות זמן הזרקה ושמונה לחץ פיצוי של הקטור פסקל. כל קרצייה מקבלת זריקה אחת לאחר מיקרו-הזרקה.

הקרצייה צריכה להראות סימני תנועה או זחילה בתגובה לגירויים דומים ללפני ההזרקה. כדי לנתח קרציות למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, הניחו תחילה טיפה של מי מלח חוצצים פוספט על שקופית זכוכית נקייה לדיסקציה ועוד אחת על שקופית מצופה פולי L ליזין למיקרוסקופיה, הכינו שקופית זכוכית נוספת עם סרט דבק דו צדדי. לאחר מכן, הסר את הקרצית מהמיכל והניח אותה על סרט דבק דו צדדי.

בעזרת מברשת קטנה מתחת למיקרוסקופ החיתוך view והתמקדו בקרצייה, הניחו סכין גילוח חד על הקרצייה בין זוג הרגליים הראשון והשני. לחץ כלפי מטה בחוזקה וחתך את הקרצייה לשני חלקים, חשף את הבטן מיד הטביע את הבטן בטיפה של PBS באמצעות מלקחיים עדינים. תפוס את השלד החיצוני הגבי והגחוני סביב מקום החתך.

משוך בזהירות את המגן הגבי כלפי מעלה והרחק מהקרצייה, וחשף את המעי החום. הקפד לשמור את קרציות החיתוך מתחת ל-PBS בכל עת. צרורות בלוטות הסאלי השקופות למחצה ממוקמות משני צידי האזור הקדמי של המעי וניתן להסיר אותן בשלב זה אם רוצים.

החזק את השלד החיצוני שנותר במקומו בעזרת מלקחיים, משוך בזהירות את המעי החוצה מהבטן. נקו בזהירות את המעיים על ידי הסרת רקמות כלואות כמו קנה הנשימה. בעזרת קצה המלקחיים העדינים, העבירו במהירות את מעי הקרציות לטיפה של PBS על מגלשת זכוכית פולי L ליזין.

הפרד את המעיים לחתיכות קטנות יותר באמצעות להבים עדינים או על ידי לחיצה עדינה עם קצה המלקחיים העדינים. שאפו בזהירות עודף PBS סביב רקמות המעי. אפשר לרקמות המעי להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.

תקן את מעי הקרציות על ידי טבילתו באצטון למשך 10 דקות. הניחו לו להתייבש באוויר ניתן לאחסן מגלשות בטמפרטורת החדר בשלב זה במשך חודשים במינוס 20 מעלות צלזיוס בכלי אטום. לתיוג אימונופלואורסצנטי של המעי, צייר עיגול סביב מעי הקרציות הקבוע בעזרת עט פאפ או מכשיר אחר לרירית מחסום הידרופובי.

זה יעזור לשמור על תמיסות הצביעה במהלך שלבי הדגירה הבאים. כסו את מעי הקרציות בטיפה אחת או כמה טיפות של חוצץ חוסם למשך 30 דקות. בטמפרטורת החדר.

הסרום המשמש לחסימה תלוי במקור החיה המארחת של הנוגדן. אל תאפשר למגלשה להתייבש מנקודה זו ואילך. שאפו לאט את המאגר החוסם.

דגרו על המעי עם תמיסות נוגדנים ראשוניות או משניות מתאימות. אנו משתמשים בפלואורסצאין, איזותיוציאנט או FXI המסומנים כאנטי-B ברג. דחה נוגדנים בדילול של 1 עד 100 במאגר חוסם למשך שעה.

בטמפרטורת החדר, מכסים את המיכל בנייר אלומיניום כדי להגביל את החשיפה לאור. הסר את תמיסת הנוגדנים על ידי שאיפה עדינה. דגרו על המעיים עם צבע פלואורסצנטי כדי לסמן רקמות קרציות כגון DPI או פרופידיום יודיד.

בדרך כלל אנו משתמשים ב-20 מיקרוגרם למיליליטר פרידיום יודיד ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, שוטפים שלוש פעמים עם 0.05% עד 20 ב-PBS למשך חמש דקות. לבסוף, הרכיבו את השקופית בגליצרול חוצץ המכיל מגיב אנטיפה וכסו בזהירות במכסה זכוכית. ניתן לאחסן מגלשות החלקה בשלב זה למשך מספר חודשים בארבע מעלות צלזיוס בתמונת מיכל אטומה ומקומית b berg de ferry תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

מיקרו-הזרקת קרציות מוצגת כאן עם מחט מלאה בכחול מבריק קומאסי לנראות. מלקחיים עדינים משמשים להפעלת לחץ עדין על הגוף, המאפשר הפרדה של הלוחות האנאליים ופתיחת הנקבוביות האנאליות למיקרו-הזרקה. כאן, האזור הקדמי של דיברטיקולום מעיים מוצג עם מעבורת ביברג בתוך המעיים.

גרעיני המעיים והספירוצ'טים מסומנים עם מעבורת פרופידיום יודיד או מעבורת אנטי בברג מצומדת fitzy בהתאמה. לאחר שהשתלטנו, גילינו ש-10 קרציות יכולות להיות הזרקת כוח מיקרו עם מאה אלף שורדים באופן טבעי ונגועים בפר. בעוד שקרציות יכולות לשמש באופן מיידי לניסויים אחרים, אנו בדרך כלל מחכים יום או יומיים כדי לוודא שהקרציות שורדות את ההליך לפני שנמשיך.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד ליצור קרציות נגועות מלאכותיות על ידי חיידקי מחסום מיקרו ומקומיים בתוך מעי הקרציות באמצעות זרימות חיסוניות קונפוקליות. מיקרו עבודה עם קרציות ומחטי זכוכית עדינות מלאות בפתוגן אנושי כגון דגיגי ברליה בריור עלולה להיות מסוכנת בזמן העבודה. היו מודעים למיקומן של קרציות ומחטים ותרגלו אמצעי זהירות ברמה 2 של בטיחות ביולוגית בכל עת.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.