שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

שיטות הדמיה של פליטת אור זיהומים חיידקיים בבעלי חיים החיים המתוארים. פתוגנים הם שונה להביע בלוציפראז הדמיה אופטית המאפשרת לגוף שלם של זיהומים בבעלי חיים. במודלים של בעלי חיים יכול להיות נגוע פתוגנים להביע בלוציפראז ואת כמובן כתוצאה של המחלה דמיינו בזמן אמת על ידי הדמיה פליטת אור.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לקבל תמונה כמותית של זיהום בבעלי חיים שיכולה לאפשר לוקליזציה של האורגניזם המזהם בתוך הרקמות והאיברים המארחים. עכברים מורדמים נדבקים תחילה תוך קנה הנשימה בחיידקים ביולומינסנטיים. לאחר מכן מוזרקים לעכברים נגועים לוציפריאן, המאפשר לבצע הדמיה חיה במערכת IVIS.

לאחר שהתקבלו תמונות גוף שלמות, הריאות הנגועות נקצרות. ניתן לבצע הדמיה של האיברים המבודדים כדי להדגים את הלוקליזציה האמיתית של הפתוגן. לאחר ההדמיה, הריאות הומוגניות ומצופות דילול על מצע גידול חיידקים לכימות העומס המיקרוביאלי.

בסופו של דבר, מתקבלות תוצאות המציגות את המיקום ומספר הפתוגנים הקיימים בתוך המארח בזמן אמת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת הוא שניתן לדמיין ולנטר פתוגנים בבעלי חיים על ידי הדמיה בזמן אמת המספקת תובנה לגבי הטיקים המרחביים של זיהום מיקרוביאלי. ידגימו את ההליך הזה ד"ר מיהי צ'אנג, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי, ו-SWAT Cillo, חוקר במעבדה שלי.

התחל בהזרקת עכברי שסתום C בני שישה עד 12 שבועות עם תמיסת הרדמה מעורבת מראש המכילה 100 מיקרוגרם קטמין ו-10 מיקרוגרם קסילזין לכל גרם משקל עכבר. החזירו את העכברים לכלובים שלהם עד שחומר ההרדמה ייכנס לתוקף. כדי לקבוע אם ההרדמה הושלמה, לחץ על כרית כף הרגל של כל עכבר וודא שלא תתרחש תגובת רפלקס דוושה.

לאחר שבעלי החיים מורדמים לחלוטין, קחו עכבר אחד והניחו אותו על האינטובציה. עומד שוכב על גבו. השתמש בסרט כדי לקבע את הרגליים והזרועות של העכבר על המעמד.

תקן גומייה למעמד האינטובציה. לאחר מכן הנח אותו מתחת לחותכות העליונות של העכבר. לאחר שהעכבר משותק, השתמש במלקחיים כדי למשוך בעדינות את הלשון מהפה.

לאחר מכן, הכנס בעדינות את הספקולום עם האוטוסקופ לתוך פיו של העכבר ומצא את פתח הגרון, שנמצא מול הוושט בצד הגחון של הפה והלוע. לאחר זיהוי פתח הגרון, הכנס קטטר בגודל 22 אינץ' המכיל חוט מנחה לקנה הנשימה עד שרכזת הצנתר תגיע לחותכות. הסר את חוט ההנחיה וחבר את הקטטר למשאבת הפלסטיק.

לאחר מכן דחף אוויר לתוך הקטטר. חזהו של העכבר יתנפח אם האינטובציה נכונה. לאחר אישור המיקום הנכון של הצנתר, פיפטה 50 מיקרוליטר של תמיסת חיידקים ביולוגית בריכוז הרצוי לתוך הצנתר, והצמידו מזרק מיליליטר אחד עם 50 מיקרוליטר אוויר כדי לדחוף את התמיסה לריאות העכבר.

פעמיים או שלוש, הסר את הקטטר והחזר את העכבר לכלוב שלו כדי לאפשר לו להתאושש מההרדמה. לפני ביצוע ההדמיה הביו-לומינסנציה, יש להרדים את העכברים באמצעות איזופלורן. לאחר הרדמה מלאה של העכברים, הוציאו אותם מתא האינדוקציה ומרחו בעדינות משחה אופטית כדי להגן על עיני החיה.

במהלך ההדמיה, הנח את העכברים בתא ההדמיה כל אחד ואחד מחרוטי האף על סעפת ההרדמה. השתמש במבלבל אור בין העכברים כדי למנוע השתקפות אור בין נושאי בעלי חיים סמוכים. לבסוף, הזריק לכל עכבר תוך-צפקי 150 מיקרוגרם לגרם משקל גוף של לוציפר.

אפשרו ללוציפר להתפזר בכל גופם של בעלי החיים למשך 10 דקות. ואז התחל לצלם. הפעל את תוכנת ההדמיה החיה ואתחל את מערכת ההדמיה IVIS.

כדי להגדיר תחילה את הפרמטרים, לחץ על הגדרת רצף. לאחר מכן בחר את מצב הזוהר והדמיית הצילום. בחר תמונות צילום זוהרות ואור מבני כחלק מרצף התמונות כדי לאפשר שחזור תלת-ממדי של DLIT.

לאחר מכן, הגדר את זמן החשיפה לדקה אחת. לאחר מכן כוונן את ה-binning לבינוני ואת ה-F-stop לאחד. הגדר את מסנן העירור לחסימה ומסנני הפליטה שייפתחו לשחזור תלת מימד מאפשרים מסננים מרובים באורכי גל שונים.

כדי לאפשר לוקליזציה מדויקת של מקור האות, בחר את ה-FOV המתאים למספר העכברים המוצגים באופן חזותי. לאחר הגדרת כל ההגדרות, לחץ על הוסף באשף התמונות בלוח הבקרה של הרכישה כדי להוסיף את הגדרת הרצף ולחץ על רכוש כדי להתחיל את רצף ההדמיה במהלך הרכישה. רשום פרטים ותנאים ניסיוניים בחלון עריכת תמונה ושמור את התמונות.

לבסוף, הוציאו את העכברים מתא ההדמיה והחזירו אותם לכלובים שלהם. עקוב אחר בעלי חיים כל הזמן עד שהם מתאוששים מההרדמה. להדמיית רקמות המתת חסד אנושית של העכברים.

בשלב זה, קצרו באופן אספטי את הריאות של כל עכבר והעבירו את האיברים לצלחת פטרי סטרילית. הנח את צלחת הפטרי המכילה את הריאות הנגועות בתוך תא ההדמיה ורכוש תמונות ביולומינסנציה באותו אופן שתואר קודם לכן בסרטון זה. לאחר קבלת התמונות, הוציאו את צלחת הפטרי מתא ההדמיה ובעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו את הריאות לצינור המכיל מיליליטר אחד של PBS סטרילי באמצעות הומוגנייזר להומוגניזציה של הריאות למשך שתיים עד חמש דקות.

הכן דילול סדרתי של הריאות הומוגנטיות ב-PBS סטרילי. לאחר מכן צלחת 100 מיקרוליטר מכל דילול על צלחות פטרי המכילות מדיום סלקטיבי. דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שמושבות החיידקים נראות בבירור.

לאחר מכן ספרו את ה-CFU כדי להעריך את רמת ההדבקה. הפעל את תוכנת התמונה החיה ופתח את קבצי התמונה הרצויים מדפדפן הקבצים. בלוח הכלים.

לחץ על התאמת התמונה כדי לשנות את הגדרות התיקון והסינון כמו גם את ספי סרגל הצבעים. כדי לכמת את עוצמת הזוהר, השתמש באזור העניין או בכלי החזר ה-ROI מהרשימה הנפתחת למטה, בחר מספר וגודל של צורת החזר ROI. לאחר מכן לחץ על מדידת החזר ROI ושמור את פלט הנתונים הכמותיים כדי לשחזר תמונות תלת מימד.

ראשית, טען את רצף התמונות, כולל תמונות האור המובנות. לחץ על טופוגרפיית פני השטח בלוח הכלים. לאחר מכן, ברשימה הנפתחת, בחר את כרטיסיית השחזור כדי ליצור טופוגרפיה של פני השטח.

לאחר מכן, בחר שחזור תלת מימד DILT מלוח הכלים. לחץ על הכרטיסייה מאפיינים ברשימה הנפתחת והגדר את מאפייני הרקמה וספקטרום המקור לשריר. לחץ על לשונית הניתוח ובחר את אורך הגל לניתוח.

לאחר מכן לחץ על התחל. לאחר שכל ההגדרות הותאמו, לחץ על שחזור כדי להתחיל את ניתוח התלת מימד. לאחר השלמת השחזור התלת מימדי, בחר תצוגת תלת מימד כדי להציג את התוצאות על ידי לחיצה על כרטיסיית התוצאות, ניתן להציג את צפיפות הפוטונים, ווקסלי הנתונים ופרמטרי האלגוריתם, לשמור את התוצאות ולייצא את הנתונים והתמונות להמשך ניתוח.

כפי שמוצג באיור הזה, שני העכברים מימין שהיו נגועים תוך קנה הנשימה ב-10 עד שישי CFU של חיידקים ביולומינסנטים מייצרים אות חזק מאזור הריאה, בעוד שהעכבר הלא נגוע משמאל לא. ניתוח דומה באמצעות ריאות מנותחות מעכברים נגועים בלבד מאשר כי הזוהר נובע מהריאות ולא מרקמה אחרת הסמוכה זו לזו. ניתן לכמת בקלות את האות הנובע מהדגימה כשטף כולל בתוך אזור עניין.

ניתוח טומוגרפיה מאשר שמיקום הזוהר המוצג בתמונות אלה כקופסאות אדומות נופל בתוך האזור המכיל את ריאות העכבר כפי שנקבע על ידי שחזור תלת מימד. לבסוף, הדמיון בין עקומת צפיפות הפוטונים הנמדדת משמאל לעקומת צפיפות הפוטונים המדומה מימין מעיד על האיכות הטובה של השחזור. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לצלם בעלי חיים נגועים בתקדים ולנתח את התמונות לצורך לוקליזציה וכימות של זיכרונות.