Name: שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: למד שיטת דימות ביולומינסצנציה לזיהומים חיידקיים בעכברים חיים באמצעות חיידקים המבטאים לוציפראז. טכניקה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי התקדמות הזיהום ואיתור הנתיבים בריאות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים מעבדה חברי צ&#39;ירילו לדיונים בעלי ערך וסיוע לאורך כל תקופת המחקר הזה. אנו מודים לד&quot;ר יהושע היל המעבדה של ד&quot;ר ג&#39;יימס סמואל לקבלת סיוע במהלך הסרטה של ​​פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי מענק של 48,523 ביל ומלינדה גייטס ולהעניק AI47866 מן המכונים הלאומיים לבריאות.

1. זיהום ריאתי ידי אינטובציה Intratracheal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול עכברים, אופציונלי, סימני יכול להתבצע על האוזניים לזיהוי קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים עם קטמין (100 מיקרוגרם לכל גרם של משקל העכבר) ו xylazine (10 מיקרוגרם לכל גרם של משקל העכבר) על ידי חיסון intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עכברים בכלובים עד בהרדמה מלאה. לסחוט את כריות רגליהם כדי לבדוק דוושת רפלקס. עכברים צריך להציג מופחת או ללא תגובת רפלקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על דוכן אינטובציה שוכב על גבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן גומייה לעמוד אינטובציה, ואז למקם אותו תחת החותכות העליונות של העכבר. השתמש קלטת לתקן ידיים ורגליים על דוכן אינטובציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להזיז tougue מהפה באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס ספקולום עם octoscope בתוך הפה ולהסתכל לתוך oropharynx עד לפתיחת הגרון גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדריך מתקדם תיל מכוסה cathether לתוך קנה הנשימה עד catether הרכזת נמצאת החותכות. הסר חוט מדריך. מכניסים אוויר לתוך cathether לצפות התרחבות החזה לאשר אינטובציה הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 50 μL של חיידקים (ב מהתמונות המוצגות השתמשנו חיידק Calmette גרן (BCG) מביע לחץ חיפושית אדומה בלוציפראז (CBRLuc), שנבנה במעבדה שלנו, אלא כל זן חיידקי זורח יכול לשמש) פתרון באמצעות cathether באמצעות מזרק 1 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עכבר בכלוב ולצפות בו במהלך ההתאוששות מן ההרדמה. </li></ol> 2. בעלי חיים הרדמה והכנה הדמיה פליטת אור עכברים עם isoflurane מורדמים באמצעות XGI-8 מערכת Aneshesia גז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מערכת ההפעלה-8 XGI הרדמה, לשקול כל מיכל פילטר פחם ולכתוב את המשקל תאריך. אם המשקל הוא 50 גרם מעל המשקל ההתחלתי, להחליף אותו עם בלון חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מפלס isoflurane ב מאדה ולמלא אותו במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה פינוי בחלק הקדמי של מערכת XGI 8-הרדמה מוגדר LPM 8 (ליטר minuite). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אספקת החמצן מן הצילינדר בלחץ גבוה ולהגדיר אותו psig 55. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את החמצן לעבור (ירוק) על החלק הקדמי של מערכת XGI-8 הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זרימת הגז לחדר ההדמיה כדי לקבוע את רמת זרימת הגז. הגדר LPM 0.25 ואז לכבות את זרימת הגז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זרימת הגז לתא אינדוקציה הרדמה כדי להגדיר את רמת זרימת הגז. הגדר LPM 1.5 ולאחר מכן כבה זרימת הגז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את isoflurane עם מאדה ולהגדיר ל 2-2.5. רמת isoflurane יכול להיות מותאם בהתאם למספר בעלי חיים בשימוש במשקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום עכברים לתוך תא אינדוקציה ולסגור את המכסה. הפעל את זרימת הגז לתא אינדוקציה. עכברים מקום בחדר עבור 5-10 minuites עד שהם להרדים לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה אופטי לעיניים כדי להגן על העיניים עכבר במהלך הדמיה המקום עכברים בחדר הדמיה באחד הקונוסים האף על סעפת ההרדמה. השתמש לבלבל בין אור עכברים כדי למנוע השתקפות של אור על נושאים בעלי חיים הסמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק luciferin (150 מיקרוגרם / גרם של משקל הגוף) על ידי חיסון intraperitoneal. </li></ol> 3. פליטת אור הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנה הדמיה חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המערכת לא מאותחל, לאתחל את מערכת הדמיה IVIS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים עבור הדמיה על ידי לחיצה על הגדרת רצף בלוח הבקרה IVIS הרכישה. בחר הארה ולצלם במצב הדמיה. אם האפשרות לבצע DLIT 3D השיקום הוא הרצוי, בחר תמונות צילומי אור, זורח מבניים כחלק רצף התמונה. הגדרת זמן חשיפה של שניה 0.5-10 דקות. הגדר binning ו-F / להפסיק מבוסס על בהירות הצפוי של המדגם. הגדר עירור במסנן כדי לחסום פליטת לסנן לפתוח, אלא אם כן מתכננים לרכוש רק אורכי גל מסוימים של אור. במקרה של DLIT 3D חוקה, להגדיר מסנני פליטה כפולה של אורכי גל שונים על מנת לאפשר איתור מדויק של המקור. הגדר FOV מ-A עד D תלוי במספר של עכברים או באזור של חיה להיות צילמו. בחר A ו-B עבור עכבר 1, C עבור עכברים 2-3, 4-5 ו-D עבור עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ להוסיף באשף תמונה בלוח רכישת שליטה כדי להוסיף את ההגדרה ברצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל רצף הדמיה ידי לחיצה לרכוש. במקרה של בנייה 3D DLIT, תמונות זורח יירכשו עבור מסנני פליטה מרובה באורכי גל שונים. תמונות אור צילום מובנים יהיה גם רכש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הרכישה את התמונה ולערוך רמות לוחות תמונה יהיה גלוי. מלא כמו מידע מפורט ככל האפשר עבור כל ניסוי ב לערוך תמונה כדי להבטיח מעקב קל של תמונות בכל עת לאחר מכן לשמור את התמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ReRemove העכברים מן IVIS הדמיה קאמרית ולהחזיר אותם בכלובים שלהם. שימו לב ההתאוששות מןesthesia כדי להבטיח עכברים לא הושפעו באופן משמעותי על ידי ההליך. בעלי חיים צריכים להיות תחת פיקוח מתמיד עד שהם להחלים לחלוטין מן ההרדמה (בדרך כלל 1-2 דקות). </li></ol> 4. Ex vivo הדמיה וניתוח CFU עבור כימות של חיידקים בריאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק עכברים עם luciferin intraperitoneally באופן זהה עבור הדמיה, זמן קצר לפני המתת חסד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים בזריקה intraperitoneal של 100 דקות מ"ג / ק"ג 5 pentobarbitol לאחר ההזרקה luciferin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Explant הריאות של עכברים מקום סטרילי, צלחות פטרי סטרילי באמצעות מלקחיים ומספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי, המכיל איבר explanted בתחום ההדמיה קאמרית לרכוש תמונות פליטת אור באותו אופן כמו כל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדמיה, להסיר איבר explanted מתוך צלחת פטרי באמצעות מלקחיים סטרילית homogenize ב 1 מ"ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את דילולים ורקמות הצלחת על התקשורת סלקטיבית המתאימה. רקמה הומוגני יכול להיות מאוחסן -80 מעלות ציפוי מחדש זה צריך להיות הכרחי. לחלופין, רקמה הומוגני יכול לשמש להפקת RNA או DNA לכמת במספרים חיידקי ידי qPCR. </li></ol> 5. ניתוח הדמיה הארה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל "Imaging Software חי" ולגלוש קבצי תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש "Palette Tool" כדי להתאים את התמונות. לחץ על התמונה כדי לשנות את כוון תיקון / סינון הגדרות מינ '/ מקס עבור קשקשים צבע בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלים ROI ברשימה הנפתח עבור כימות של עוצמת אור. צורת בחר ROI, מספר וגודל. גרור ROI מסגרת לאזור הריבית על התמונה. ודאו כי כל ROI הם באותו גודל וצורה. לחץ ROI מדידה לשמור, להעתיק ו / או לייצא נתונים כמותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של 3D שחזורים DLIT, עומס התמונה ברצף, כולל התמונה אור מובנה. לחץ על הטופוגרפיה משטח בכלי פלאט. ברשימה הנפתח, לחץ על הכרטיסייה מחדש כדי ליצור את הטופוגרפיה משטח. בלגן משטח יופיע בחלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שחזור DLIT 3D של כלי פלאט. ברשימה הנפתח, לחץ על הכרטיסייה מאפיינים כדי להגדיר מאפיינים רקמות ספקטרום המקור. שרירים מומלץ ברוב הנסיבות. ברשימה הנפתח, לחץ על הכרטיסייה ניתוח כדי לבחור את אורך הגל לניתוח. לחץ על הכרטיסייה פרמטרים ואשר ערכי ברירת המחדל או לשנות פרמטרים DLIT במידת הצורך. לחץ על הכרטיסייה כדי להתחיל לשחזר ניתוח 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר שחזור 3D נגמר, תצוגת 3D יציג את התוצאות של שיקום 3D. לחץ על הכרטיסייה כדי לראות את תוצאות ניתוח נתונים על צפיפות, voxels פוטון ופרמטרים אלגוריתם DLIT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה ו / או לייצא את התוצאות של ניתוחי שחזור 3D לדמויות וקבצי נתונים. </li></ol> 6. נציג תוצאות: התמונות של פליטת אור עכברים נגועים בחיידקים bioluminescent יחד עם שליטה בעכבר נגוע מוצגים באיור 1. ריאתי עכברים נגועים בחיידקים bioluminescent לייצר אות משמעותי מן הריאות (איור 1). עוצמת הארה היא לכמת כמו בתוך השטף סך ההחזר על ההשקעה (האזור של עניין) (איור 2). נתונים כמותיים על עוצמת האור הוא מנורמל עבור יחידות המושבה להרכיב (CFU) של חיידקים המתקבל הריאות כדי לאשר את האות מופק החיידקים bioluminescent וניתן לעומת שליטה שלילית. מיקום ועוצמת האות ניתן לנתח עוד יותר על ידי שחזור 3D DLIT מקור הארה מבוסס על טומוגרפיה של משטח העכבר 11. ניתוחים אלו מאפשרים כימות ולוקליזציה של האות bioluminescent מיוצר. התוצאות של שיקום 3D של מקור זורח בעכברים נגועים מוכיח כי אור מופק הריאות של העכבר (איור 3). התמונות vivo לשעבר של הריאות וכתוצאה מכך עכבר הארה לאשר כי נפלט מהריאות, ולא רקמות איבר כלשהו juxtaposed מקרוב אחר או (איור 2C). <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הדמיה הארה של עכברים נגועים ריאתי עם חיידקים bioluminescent מתוייגים עם CBRluc. העכבר לשלוט נגוע נמצא משמאל ושני עכברים נגועים נמצאים בצד ימין. עכברים שהיו נגועים בחיידקים להביע CBRluc (n = 2) בציר intratracheal. 10 דקות לאחר ההזרקה luciferin, תמונות הארה נרכשו עבור 10 דקות ב 4 עמדות: הגב, בצד הגחוני, שמאל ימין. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. עוצמת האור כמותי של עכברים נגועים בחיידקים להביע CBRluc. (A, B) תמונות הארה של ניתוח ROI ואת השטף הכולל לכמת אור מן ההחזר על ההשקעה במיקומים הגבי ו הגחון, בהתאמה. עכברים נגוע הם בצד שמאל ושני עכברים נגועים נמצאים בצד ימין. תמונות הארה נרכשו מהריאות of עכברים נגועים נגוע ו CBRlux (n = 2). עוצמת האור סביב הריאות היה לכמת ידי ניתוח ROI. ג) תמונות לשעבר vivo של הריאות מן (למטה שתי קבוצות של הריאות) עכברים נגוע (למעלה) ו נגועים. Luciferin הוזרק לפני 5 miniuts של המתת חסד ותמונות נרכשו לאחר מכן. הערכים לכמת הם מנורמל ל CFU. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. שחזור 3D של מקור פליטת אור (ים) עכבר נגוע ריאתי. העכבר היה נגוע בחיידקים להביע CBRluc בזריקה intratracheal. רצף התמונה נרכשה באמצעות מסנני פליטה שונות של אורכי גל סדרתי של nm 540-700 ננומטר. רצף התמונה שימש הכינון מחדש 3D עבור מקור הארה בנושאים בעלי חיים ובו מתאר לעצמי מובנים. א) טומוגרפיה על העכבר מוצגת במיקומים שונים: מלפנים, מאחור, על ימין ועל שמאל. מקורות אור מוצגים voxels (תיבות אדום בתוך העכבר 3D) הממוקמים בתוך ריאה כפי שנקבע על ידי שחזור. ב) פוטון densiy המפה של הנתונים שנמדדו מדומה. השוואת צפיפות עקומות נמדד מדומה פוטון לספק את המידע באיכות השיקום. איכות שחזורים טובים התוצאה דומה לצפיפות פוטון נמדד מדומה.

<ol><li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li>
<li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).</li>
<li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li>
<li>Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+coding+click+beetle+luciferases+can+elicit+bioluminescence+of+different+colors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors.</a> Science. 244, 700-702 (1989).</li>
<li>Wet, J. R. de, Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+firefly+luciferase+cDNA+and+the+expression+of+active+luciferase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).</li>
<li>Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistries+and+colors+of+bioluminescent+reactions%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review.</a> Gene. 173, 5-11 (1996).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).</li>
<li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li>
<li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).</li>
</ol>

מחקרים שנעשו בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש טקסס A &amp; M האוניברסיטה.

למרות הבאים הפרוטוקולים הללו יהיו בדרך כלל תוצאה של תמונות באיכות גבוהה, חשוב לשקול כמה נושאים מרכזיים על מנת לקבל נתונים מדויקים ועקביים של לימודי הדמיה. תמונות הארה יש רכשה כי יש ספירת 600 מתוך 60,000 כדי להבטיח כי האות מעל הרקע ואת המצלמה לא רווי. אם האות המתקבל הוא פחות מ 600 בתנאי החשיפה צריך להיות מותאם כדי להגדיל שחשוב. אם האות המתקבל הוא מעל 60,000 המצלמה רווי באזורים מסוימים. כאשר המצלמה רווי, כימות לא צריך להיות ניסיון באזורים רווי, למרות שזה עדיין אפשרי והכרחי לעתים בלת...

<table><tbody><tr><td>איזופלוראן</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>קטמין </td><td>Butler Animal Health Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קסילזין </td><td>MP Biomedicals</td><td>158307</td><td></td></tr><tr><td>לוסיפרין</td><td>GMT</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Fetal plus</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קתטר (22G x 1")&amp;#8221;)</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>חוט מוליך </td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3491</td><td></td></tr><tr><td>אוקטוסקופ עם ספקולום </td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3748</td><td></td></tr><tr><td>מערכת Xenogen IVIS</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת הרדמה XGI-8-gas</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לדימוי חי (Living Imaging)</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קונוסי אף שקופים</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחיצת הסתרה של אור </td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

הדמיה היא טכניקה ערך שיכולים לשמש כדי לפקח על תהליכים ביולוגיים. בפרט, נוכחות של תאים סרטניים, בתאי גזע, סוגי תאים חיסוניים ספציפיים, פתוגנים נגיפיים, טפילים וחיידקים ניתן בעקבות בזמן אמת תוך חיים בעלי חיים 1-2. יישום של הדמיה פליטת אור ללימוד פתוגנים יש יתרונות לעומת אסטרטגיות לניתוח קונבנציונלי של זיהומים במודלים של בעלי חיים 3-4. זיהומים ניתן דמיינו בתוך חיות אדם לאורך זמן, ללא צורך המתת חסד כדי לקבוע את המיקום והכמות של הפתוגן. הדמיה אופטית המאפשרת בחינה מקיפה של כל רקמות ואיברים, ולא דגימה של אתרים ידועים בעבר להיות נגועים. בנוסף, הדיוק של חיסון לתוך רקמות ספציפיות ניתן לקבוע ישירות לפני ביצוע חיות קדימה שהיו מחוסן הצלחה לאורך הניסוי כולו. השוני בין בעלי החיים יכול להיות נשלט, מאחר הדמיה מאפשר לכל בעל חיים אחר להיות בנפרד. הדמיה יש פוטנציאל לצמצם במידה ניכרת את מספר בעלי החיים הדרושים בגלל היכולת לקבל נתונים מנקודות זמן רב מבלי מדגם רקמות כדי לקבוע 3-4 לטעון הפתוגן. פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמיין זיהומים בבעלי חיים באמצעות דימות של פליטת אור רקומביננטי זנים של חיידקים להביע בלוציפראז. החיפושית לחץ (CBRLuc) ו luciferases גחלילית (FFluc) לנצל luciferin כמו מצע 5-6. האור המיוצר על ידי שתי CBRluc ו FFluc יש אורך גל רחב של nm 500-700 ננומטר, מה שהופך את אלה luciferases כתבים מעולה עבור דימות אופטי במודלים של בעלי חיים החיים 7-9. זה בעיקר בגלל אורכי הגל של האור יותר מאשר 600 ננומטר נדרשים כדי למנוע ספיגה של המוגלובין, ולכן עוברים דרך רקמות יונקים ביעילות. בלוציפראז הוא הציג גנטית לתוך חיידקים כדי לייצר אות אור 10. עכברים הם ריאתי מחוסן עם חיידקים bioluminescent intratracheally לאפשר ניטור של זיהומים בזמן אמת. לאחר הזרקת luciferin, תמונות נרכשים באמצעות מערכת דימות IVIS. במהלך הדמיה, עכברים מורדמים עם isoflurane באמצעות XGI-8 מערכת Anethesia גז. דמויות יכולות להיות מנותח למקם ולכמת את מקור האות, המייצגת את אתר זיהום חיידקי (ים) ומספר, בהתאמה. לאחר הדמיה, נחישות CFU מתבצעת על רקמת הומוגני כדי לאשר את קיומו של החיידק. כמה מנות של חיידקים המשמשים לקשר בין מספרי חיידקים עם הארה. הדמיה ניתן ליישם מחקר של הפתוגנזה והערכה של יעילות של תרכובות וחיסונים אנטיבקטריאלי.

שיטות הדמיה של פליטת אור זיהומים חיידקיים בבעלי חיים החיים המתוארים. פתוגנים הם שונה להביע בלוציפראז הדמיה אופטית המאפשרת לגוף שלם של זיהומים בבעלי חיים. במודלים של בעלי חיים יכול להיות נגוע פתוגנים להביע בלוציפראז ואת כמובן כתוצאה של המחלה דמיינו בזמן אמת על ידי הדמיה פליטת אור.

דימות הוא טכניקה בעלת ערך שניתן להשתמש בה כדי לנטר תהליכים ביולוגיים. בפרט, נוכחותם של תאי סרטן, תאי גזע, סמנים ספציפיים...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג תמונה כמותית של זיהום בבעלי חיים חיים, שתאפשר איתור של האורגניזם המדביק בתוך רקמות ואיברים של המאכסן. עכברות המורדמות מודבקות תחילה באופן תוך-קשייתי (intratracheally) בחיידקים ביו-לומינצנטיים. לאחר מכן, מוזרק לעכברות המודבקות Luciferian, המאפשר ביצוע דימות חי במערכת IVIS.לאחר קבלת תמונות של הגוף כולו, יש להוציא את הריאות המודבקות. ניתן לבצע דימות של האיברים המבודדים כדי להדגים את המיקום המדויק של הפתוגן. לאחר הדימות, את הריאות הומוגניזים ומדללים אותן בצלחות עם מצע גידול חיידקי לצורך כימות העומס המיקרוביאלי.בסופו של דבר, מתקבלים תוצאות המראות את המיקום ומספר הפתוגנים הנוכחים בתוך המארח בזמן אמת. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן להדמות ולנטר פתוגנים בבעלי חיים חיים באמצעות דימות בזמן אמת, דבר המספק תובנה לגבי המאפיינים המרחביים של זיהום מיקרוביאלי. את הפרוצדורה זו יעמידו על הדגם ד"ר Mihi Chang, עמיתת פוסט-דוקטורט במעבדתי, ו-SWAT Cillo, חוקר במעבדתי.התחל בהזרקה תוך-peritoneal לעכברים מסוג BALB/c בני שבוע 6 עד 12, של תמיסת הרדמה מוכנה מראש המכילה 100 micrograms של ketamine ו-10 micrograms של xylazine לכל גרם ממשקל העכבר. החזר את העכברים לכלובים שלהם עד להשפעת חומר ההרדמה. כדי לקבוע האם ההרדמה הושלמה, לחץ על כרית כף הרגל של כל עכבר וודא כי לא מופיעה תגובת רפלקס של כף הרגל.לאחר שהבעלי החיים נמצאים תחת הרדמה מלאה, קחו עכבר אחד והניחו אותו על מעמד האינטובציה. העמידו אותו במצב שכיבה על הגב. השתמשו בסרט דביק כדי לקבע את רגליו וזרועותיו של העכבר למעמד.הצמידו גומייה למעמד האינטובציה. לאחר מכן, מקמו אותה מתחת לשירישי העליונים של העכבר. ברגע שהעכבר מקובע, השתמשו בפינצטה כדי למשוך בעדינות את הלשון החוצה מהפה.בשלב הבא, הכניסו בעדינות את הספקולום עם האוטוסקופ לתוך פיו של העכבר ואתרו את פתח הגרון, הממוקם לפני הוושט בצדו הבטני של האורופרינקס. לאחר זיהוי פתח הגרון, הכניסו לקנה הנשימה קטטר במידה 22 gauge ובאורך שפה אחת (one inch) המכיל תיל מנחה, עד שחור קטטר מגיע לשיניים החותכות. הוציאו את התיל המנחה וחברו את הקטטר למשאבה מפלסטיק.לאחר מכן, דחפו אוויר אל תוך הקטטר. חזהו של העכבר יתנפח אם האינטובציה בוצעה כהלכה. לאחר שאישור מיקומו הנכון של הקטטר הושג, העבירו בעזרת פ pipette‏ 50 µL של תמיסת חיידקים ביולומינסנטיים בריכוז הרצוי אל תוך הקטטר, וחברו מזרק של 1 mL המכיל 50 µL של אוויר כדי לדחוף את התמיסה אל תוך ריאות העכבר.הוצא את הקטטר ושבב את העכבר לכלובו פעמיים או שלוש, כדי לאפשר לו להתאושש מההרדמה. לפני ביצוע הדמיית הביולומיננס, הרדם את העכברים באמצעות isoflurane. ברגע שהעכברים מורדמים לחלוטין, הוצא אותם מתא ההשראה ומרח בעדינות משחה אופטית להגנה על עיני בעל החיים.במהלך הדמיה, מקמו את העכברים בתא ההדמיה ואת כל אחד מהקונוסים לאף על מניפולטור ההרדמה. השתמשו במחיצה לאור בין העכברים כדי למנוע החזר אור בין בעלי חיים סמוכים. לבסוף, והקיפו לכל עכבר בזרקור תוך-פריטוני 150 micrograms לגרם משקל גוף של Lucifer.אפשרו ללוסיפרין להתפזר ברחבי גופי בעלי החיים למשך 10 דקות. לאחר מכן התחילו את הדימוג. הפעילו את התוכנה לדימוג חי והאתחילו את מערכת הדימוג IVIS.כדי להגדיר ראשית את הפרמטרים, לחצו על sequence setup. לאחר מכן בחרו במצב הדמיית לומנסנס וצילום. בחרו בתמונות לומנסנס צילומיות ותמונות אור מבני כחלק מרצף התמונות כדי לאפשר שחזור תלת-ממדי ב-DLIT.בשלב הבא, הגדירו את זמן החשיפה לדקה אחת. לאחר מכן, התאימו את ה-binning לרמה בינונית ואת ה-F-stop לערך 1. הגדירו את מסנן העירור (excitation filter) למצב חסימה (block) ואת מסנני הפליטה (emission filters) למצב פתוח (open); לצורך שחזור תלת-ממדי, הפעילו מספר מסננים באורכי גל שונים.כדי לאפשר לוקליזציה מדויקת של מקור האות, בחרו את ה-FOV התואם למספר העכברים הנצפים. לאחר הגדרת כל ההגדרות, לחצו על add ב-image wizard בלוח בקרת הרכישה (acquisition control panel) כדי להוסיף את הגדרת הרצף, ולחצו על acquire כדי להתחיל את רצף ההדמיה במהלך הרכישה. רשמו את פרטי התנסוי והתנאים בחלון edit image ושמרו את התמונות.לבסוף, הוצאו את העכברים מתא ההדמיה והחזירו אותם לכלוביהם. עקבו אחר בעלי החיים באופן רציף עד להתאוששותם מההרדמה. לצורך הדמיית רקמות, בצעו הרדמה והריגה הומנית לעכברים.בשלב זה, הוציאו באופן אספטי את הריאות של כל עכבר והעבירו את האיברים לצחנת פטרי סטרילית. הניחו את צחנת הפטרי המכילה את הריאות המודבקות בתוך תא ההדמיה וקבלו תמונות בביולומינצנציה באופן שתיארו קודם לכן בסרטון זה. לאחר קבלת התמונות, הוציאו את צחנת הפטרי מתא ההדמיה ובעזרת פינצטה סטרילית, העבירו את הריאות למבחנה המכילה 1 mL של PBS סטרילי; בעזרת הומוגניзатор, בצעו הומוגניזציה לריאות למשך שתיים עד חמש דקות.הכינו דילולים סדרתיים של הומוגנאטים מהריאה ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, פזרו 100 µL מכל דילול על צלחות פטרי המכילות מצע בריאה סלקטיבי. הדגרירו את התרביות בטמפרטורה של 37 °C עד להופעת מושבות חיידקיים גלויות לעין.לאחר מכן, ספרו את ה-CFU כדי להעריך את רמת הזיהום. הפעילו את תוכנת ה-living image ופתחו את קבצי התמונה הרצויים מדפדפן הקבצים. בלוח הכלים.לחצו על adjust image כדי לשנות את הגדרות התיקון והסינון וכן את ספי Threshold של סולם הצבעים. כדי לכמת את עוצמת הלומניסנציה, השתמשו בכלי ה-region of interest או ב-ROI מהרשימה הנגלגלת, ובחרו את צורת ה-ROI, את מספרם ואת גודלם. לאחר מכן, לחצו על ROI measurement ושמרו את פלט הנתונים הכמותיים כדי לשחזר תמונות בתלת-ממד.ראשית, טענו את רצף התמונות, כולל תמונות האור המובנה. לחצו על surface topography בפלטת הכלים. לאחר מכן, ברשימה הנפתחת, בחרו בלשונית reconstruct כדי להפיק טופוגרפיה של פני השטח.בשלב הבא, בחרו ב-DILT 3D reconstruction מלוח כלי העבודה. לחצו על לשונית properties ברשימה הנפתחת והגדירו את תכונות הרקמה (tissue properties) ואת ספקטרום המקור (source spectrum) כ-muscle. לחצו על לשונית analyze ובחרו את אורך הגל לניתוח.לאחר מכן לחצו על start. ברגע שכל ההגדרות הותאמו, לחצו על reconstruct כדי להתחיל בניתוח התלת-ממדי. עם השלמת השחזור התלת-ממדי, בחרו ב-3D view כדי להציג את התוצאות. בלחיצה על לשונית results ניתן לצפות בצפיפות הפוטונים (photon density), בווקסלי הנתונים (data voxels) ובפרמטרי האלגוריתם (algorithm parameters); שמרו את התוצאות וייצאו את הנתונים והתמונות לצורך ניתוח נוסף.כפי שמוצג בדמות זו, שני העכברים מימין, שהודבקו תוך-קשקשית ב-10⁶ CFU של חיידקים ביו-לומנסנטיים, מייצרים אות חזק מאזור הריאות, בעוד שהעכבר הבלתי-מדובק משמאל אינו מייצר אות כזה. ניתוח דומה המשתמש בריאות מופרדות מעכברים מדובקים בלבד מאשר כי הלומנסנסיה מקרינה מהריאות ולא מרקמה אחרת הסמוכה אליהן. ניתן לכמת בקלות את האות המקרין מהמדגם כש flux כולל בתוך אזור עניין (region of interest).ניתוח טומוגרפי מאשר כי מיקום הלומנסנס (luminescence), המוצג בתמונות אלו כתיבות אדומות, נמצא בתוך האזור המכיל את ריאות העכבר כפי שנקבע באמצעות שחזור תלת-ממדי. לבסוף, הדמיון בין עקומת צפיפות הפוטונים שנמדדה משמאל לעקומת צפיפות הפוטונים המדומה מימין מעיד על האיכות הגבוהה של השחזור. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לצלם בעלי חיים שנדבקו ב-precedent ולנתח את התמונות לצורך לוקליזציה וכימות של ה-reminiscence.

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מאמר זה מתאר את הממשל...

הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

מקור: Valentine, M. E., et al. יצירת מוטציות של מחיקת גנים בתוך המסגרת ב-Pseudomonas aeruginosa ובדיקת הנחתת אלימות במודל עכבר פשוט של זיהום. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את השימוש בביולומינסנציה כדי לדמיין ולהשוות את ההתנהגות in vivo של זני חיידקים אלימים ומוחלשים בעכברים. הוא מתאר את הכנת תרחיפי החיידקים הביו-לומינסנטים והזרקתם התוך-צפקית לעכברים. הזן האלים מפגין התפשטות מערכתית, בעוד שהזן המוחלש נשאר מקומי ומתנקה בהדרגה, כפי שמצוין על ידי אות הדעיכה.

מעקב אחר דינמיקת זיהום חיידקי בעכבר באמצעות ביולומינסנציה

מקור: דה וריס, ס. ר. ואח', מודל חיסון מאוחר של זיהום פצע כרוני בפסאודומונס אארוגינוסה . J. Vis. Exp. (2020).הסרטון הזה מדגים טכניקת הדמיה ביולומינצנטית למעקב אחר התקדמות זיהום חיידקי במודל עכבר חי. חיידקים פתוגניים שהונדסו באמצעות מערכת הדיווח luxABCDE פולטים אור באתר הזיהום, ומאפשרים ויזואליזציה של חיידקים פעילים מטבולית. על ידי הדמיית העכבר לאורך זמן, החוקרים יכולים לעקוב באופן לא פולשני אחר דינמיקת הזיהומים ולכמת את עוצמת האות הביולומינצנטי.

הדמיית ביולומינסציה של זיהומים חיידקיים בעכברים

מקור: ולנטיין, מ. א. ואחרים, יצירת מוטנטים למחיקת גנים בתוך המסגרת ב-Pseudomonas aeruginosa ובדיקת החלשת אלימות במודל פשוט של זיהום בעכברים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את השימוש בגישה של הדמיה מבוססת ביולומינסצנציה לניטור זיהום חיידקי במודל עכבר חי. הדמיה ביולומינצנטית רציפה וצילום רנטגן מאפשרת הדמיה בזמן אמת ומיקום אנטומי של הזיהומים המתפשטים ברחבי המארח.

הדמיה בזמן אמת של זיהום חיידקי במודל עכבר באמצעות ביולומינסציה

מקור: Luyts, N., ואחרים. מעקב אורך של זיהומים בדרכי השתן וטיפול בהם בעכברים באמצעות הדמיית ביולומינצנציה. J. Vis. Exp. (2021).הסרטון הזה מדגים את ההשראה והמעקב אחר זיהום בדרכי השתן במודל עכבר באמצעות E. coli ביולומינסנציוני שהוזרק לשלפוחית השתן, שם מתרחשים הידבקות, פלישה ושכפול תוך-תאי של חיידקים. האור הנפלט מהאופרון הביולומינצנטי משמש כסמן בזמן אמת לעומס חיידקים במהלך התקדמות הזיהום.

המחשה של זיהום בדרכי השתן במודל עכבר באמצעות ביולומינסצנציה

סרטון זה מדגים שיטה למעקב אחר זיהומים נגיפיים במודלים של עכברים באמצעות וירוס רקומביננטי של לוציפראז וחלבון פלואורסצנטי המבטא חלבון פלואורסצנטי שפעת A. שיטה זו מאפשרת הן מחקרי in vivo והן מחקרי ex vivo, ומאפשרת לחוקרים לקבל תובנות לגבי דינמיקה נגיפית והשפעות של התערבויות.

וירוס שפעת של כתב לוציפראז-פלואורסצנטי למעקב אחר זיהומים ויראליים

הדמיה רבת שיטה היא גישה יקרת ערך לחקר התישבות חיידקים במודלים של בעלי חיים קטנים. פרוטוקול זה מתאר זיהום של עכברים עם...

הדמיה של multimodality 4D<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; זיהומים בעכברים

Streptococcus pneumoniae הוא פתוגן המוביל גורם לדלקת ריאות שנרכשה בקהילה קשה ואחראית ליותר מ -2 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם. ההשפעה של גורמי חיידקים מעורבים בכושר או ארסיות יכולה להיות במעקב בזמן אמת במודל דלקת ריאות או בקטרמיה עכבר אקוטי באמצעות חיידקי bioluminescent.

בעקבות בזמן אמת השפעת גורמי דלקת ריאות ארסיים בעכבר דלקת ריאות דגם אקוטי באמצעות חיידקי Bioluminescent

אנו מתארים את הדמיה אופטית של עכברים נגועים עם שחפת Mycobacterium (מ. שחפת) באמצעות כתב אנזים קרינה פלואורסצנטית (שופט). פרוטוקול זה מאפשר את זיהוי רגיש וספציפי של מ. שחפת במודלים של בעלי חיים פרה-קליניים למחקר פתוגנזה, therapeutics וחיסון.

הדמיה שחפת Mycobacterium בעכברים עם הכתב אנזים קרינה פלואורסצנטית

שפעת וירוסים (IAVs) הם פתוגנים הנשימה מדבקת הגורמות מגיפה שנתית ומדי פעם גיפות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לעקוב אחר זיהומים ויראליים בvivo באמצעות רומן רקומביננטי לוציפראז והבעת הביטוי הדו-כתבת b IAV (בירפעת). גישה זו מספקת לחוקרים כלי מצוין כדי ללמוד IAV ב-vivo.

לוציפראז-כתבת פלורסנט וירוס שפעת עבור הדמיה חיה וכימות של זיהום נגיפי

כתב יד זה מתאר את הניהול התוך-עבזי של חיידקים אורופתיוגניים עם לוקס אופרון כדי לגרום לדלקת בדרכי השתן בעכברים ואת אורך האורך שלאחר מכן בניתוח vivo של העומס החיידקי באמצעות הדמיית ביו-לומינציה.

מעקב אורך של דלקות בדרכי השתן והטיפול שלהם בעכברים באמצעות הדמיית ביו-לומינציה

למד שיטת דימות ביולומינסצנציה לזיהומים חיידקיים בעכברים חיים באמצעות חיידקים המבטאים לוציפראז. טכניקה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי התקדמות הזיהום ואיתור הנתיבים בריאות.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

גלה סרטונים נוספים