מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי
4 באפריל 2011
הטכניקה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הצומת לימפה מפשעתי (LN) הוא התווה. טכניקה כזו מאפשרת בזמן אמת, In vivo מחקר microvasculature הלימפה צומת ומבנה הן במהלך הומאוסטזיס וזיהום. טכניקה זו ניתן להתאים מחקרים סחר סלולריים לאתרים אחרים הצומת לימפה.
המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים ולהעריך in vivo את העורק המזין את קשרי הלימפה המפשעיים. הדבר מושג תחילה על ידי יצירת שטח עור (skin flap) באמצעות דיסקציה זהירה של העור באזור המפשעה של העכבר, המכסה את קשרי הלימפה המפשעיים. לאחר מכן, הרקמה החיברת המכסה את אזור קשרי הלימפה מופרדת.
בשלב הבא, יש להסיר את רקמת השומן שמסביב כדי לחשוף את כלי הדם התזונתיים של קשרית הלימפה. לבסוף, שינויים בכלי הדם של קשרית הלימפה מוצגים ומוערכים באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיה (intravital microscopy). למרות זאת, ההכנה שתראו היום היא המיקרו-סירקולציה של קשרית הלימפה המפשעת. טכניקות כירורגיות אלו יכולות לשמש להכנות אחרות, כגון שריר שלד וכן מוח.
באופן כללי, בעת ביצוע טכניקה זו, מתחילים מתקשים משתי סיבות עיקריות. הראשונה היא העובדה שמתעסקים בבעל חיים חי, והשנייה היא מכיוון שמבצעים ניתוח באזור קטן מאוד, כל הפרעה לכלי הדם עצמו או לאזור שסביבו עלולה להשפיע לרעה, מה שיפגע בניסוי שברצונכם לערוך. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית להצלחה.
ישנם מספר שלבים מורכבים המעורבים בתהליך, אשר קשה להעבירם מהטקסט ליישום בפועל של הטכניקה. חשוב לראות זאת כדי לבצע את הפעולה בצורה נכונה. עם הרבה הצלחה.
ראשית מרדימה את העכבר ומגלחת את אזור הניתוח. לפרטים נוספים, נא לעיין בכתב היד של המאמר. לאחר מכן, ניתן להניח את העכבר על לוח ניתוח שקוף במצב שכיבה על הגב.
הצמידו את העכבר ללוח על ידי הדבקה של כל כרית כף הרגל. יום לפני הניסוי, ערבבו את ה-thes guard 180 4 בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, השתמשו בצלחת פטרי סטנדרטית חד-פעמית כתבנית, שפכו את התערובת לעומק של כרבע אינץ' והניחו לה להתקשות במהלך הלילה. הוציאו את ה-thes guard מצלחת הפטרי והניחו אותה על הלוח הכירורגי.
הניחו את העכבר המורדם והגזור תחת מיקרוסקופ ההבדילה. בצעו חתך קו אמצע לאורך המשטח הוונטרלי של חלל הבטן באמצעות פינצטה מפלדת אל חלון מספר 5 ומספרי קפיץ בעלי להבים ישרים. לאחר מכן, המשיכו את חתך קו האמצע באלכסון לכיוון הגפיים והסיטו את העור לכיוון עמוד השדרה המסיבי.
ברגע שה-ln נראה בבירור, הצמד את העור שהורחקה באמצעות סיכות חרקים מפלדת אל-חלד ומלקחי אפוקסי inox אל ה-cigar. 180 4 pedestal. הוסף תמיסת סליין פיזיולוגית או PSS לאזור.
בשלב הבא, הסירו את השכבה הדקה של רקמת החיבור המכסה את האזור שסביב ה-ln. בעזרת פינצטה, אספו בזהירות חתיכות קטנות של רקמת חיבור והפרידו אותן מה-ln. לאחר מכן, בעזרת מספרי קפיץ, הסירו את רקמת השומן המכסה ומקיפה את ה-LN עד לחשיפת המיקרו-וסקולריקה (מיטת כלי הדם המיקרוסקופיים).
בשלב זה, חשוב להקפיד לא לבוא במגע עם כלי הדם המדוברים באמצעות מכשירים כירורגיים, ולא לפגוע בכלי הדם על ידי הפעלת כוח רב מדי בעת מניפולציה של הרקמה שסביבם. הדרך המיטבית לפינוי השומן מה-ln היא על ידי הרפיית רקמת החיבור, החזקת הרקמה השומנית בעזרת פינצטה, ולאחר מכן הסרה עדינה של רקמת השומן עד לשדה ראייה נקי. לאחר הסרת רקמות החיבור והשומן, ניתן יהיה לראות את המקטע העורקי המרכזי הסמוך ל-LN ואת הווריד הנלווה העליו הוא מונח.
לאחר שקטע כלי הדם הרלוונטי נחשף תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, קבעו את הדגימה על המיקרוסקופ האינטרה-ויטלי. הגדירו את קווי הסופרפוזיה והשאיבה. במהלך חלק זה של הפרוצדורה, חיוני להבטיח שהרקמה החשופה תישמר תמיד תחת סופרפוזיה של תמיסת PSS מאוזנת.
סופרפוזיה (Superfusion) של PSS מתבצעת באמצעות כוח הכבידה. הזנה ממאגר ראשוני למאגר בתוך מעטפת מים מחוממת, המופעל בזרם של 5% Carbon dioxide במאזן חנקן, ולאחר מכן דרך קו טפטוף בקצב של 10 milliliters לדקה. יש להשתמש בקו שאיבה כדי להמשיך להרחיק את ה-PSS שסופרפוזיה בו מהדגימה על ידי מיקומו בתחתית השכיב של העור (skin flap); לאחר מכן יש לבדוק ולהתאים את הטמפרטורה של אמבט המים המ巡גז ואת קצב הסופרפוזיה של ה-PSS כדי להשיג טמפרטורה אופטימלית של כ-36 degrees Celsius.
במהלך ההכנה, אפשרו לכלי הדם להגיע לשיווי משקל עם PSS למשך 60 דקות לפחות. ודאו שהבעל החיים אינו סובל מהיפותרמיה באמצעות מד חום רקטלי וספקו מנורת חימום חיצונית. בזמן שה-PSS מגיע לשיווי משקל, כמותו את קוטר כלי הדם.
השתמשו במדפי השלייה של הווידאו בנקודות זמן מרובות כדי לוודא שהכלי התייצב; התייצבות מוגדרת כשגודל הקוטר נשאר עקבי בטווח של חמישה מיקרומטרים למשך תקופה של 20 דקות. מדידות הקוטר נרשמות במחשב באמצעות תוכנת chart lab. לאחר תקופת השיווי, העריכו את תקינות הכלי באמצעות אגוניסט ספציפי לשריר חלק, כגון פנילפרין (phenylephrine), כפי שמוצג כאן עם פנילפרין.
הוסיפו את האגוניסט למערכת. יש להעריך שמונה אגוניסטים בכל עלייה לוגריתמית בריכוז המצטבר של האגוניסט בעת הוספתו ל-SUP fate בין המנהלות של כל אגוניסט. יש לבצע שלב שטיפה באמצעות PSS למשך 30 דקות או עד שהכלי חוזר לקוטר המנוחה שלו.
להלן תוצאות מייצגות של בלוטת לימפה מincludegraphics inguinal לאחר תקופת ההשוואה. הזנה של העורק בתמיסות מלח פיזיולוגיות מניבה תמונה ברורה המאפשרת זיהוי הן של העורק המזין, המסומן כאן בחץ אדום, והן של הווריד, המסומן בחץ ירוק, אשר מספקים את בלוטת הלימפה המפקיעה. הגרף מציג תגובה וזוואקטיבית טיפוסיים של עורק המזין בבלוטת לימפה מפקיעה להוספה מצטברת של SUP fused phenylephrine לתמיסת מלח פיזיולוגית.
ריכוזים שבין 10⁻⁹ molar ל-10⁻⁵ molar, המלווים בכיווץ כלי דם (vasoconstriction) חזק, מעידים על תפקוד תקין של השריר החלק בעורקים. גרף זה מציג תגובה וזו-אקטיבית טיפוסית להוספה מצטברת של acetylcholine למי מלח פיזיולוגיים, בריכוזים שבין 10⁻⁹ molar ל-10⁻⁵ molar.
נוכחות של התרחבות כלי דם (vasodilation) חסונה מעידה על תפקוד אנדותלי תקין בעורקים. בניסיון להכין דגם זה, אחד הדברים המרכזיים שיש לזכור הוא לצמצם למינימום את ההפרעה לכלי הדם ולאזור שסביבו כדי למקסם את סיכויי ההצלחה. בעקבות הליך זה, ניתן להטמיע שיטות נוספות, כגון פלואורסצנציה, כדי לבחון תפקודי תא אחרים, כגון תעבורת תאים (cell trafficking).
לאחר הפיתוח של טכניקה זו, היא סללה את הדרך לגישור בין התחומים של אימונולוגיה וביולוגיה וסקולרית אל תחום חדש של אימונולוגיה וסקולרית.
סקירה כללית
מאמר זה מתווה טכניקה לביצוע מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (intravital microscopy) של קשרי הלימפה המפקיים, המאפשרת מחקר בזמן אמת, in vivo, של המיקרו-וסקולטורה והמבנה של קשרי הלימפה במהלך הומאוסטזיס וזיהום. ניתן להתאים את השיטה למחקרי תנועת תאים ולאתרים אחרים של קשרי לימפה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- דימוי מיקרו-וסקולרי
- מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית
רקע
- מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (Intravital microscopy) מאפשרת הדמיה של רקמות חיות.
- הקשר הלימפתי הפמורי (inguinal lymph node) הוא קריטי למחקרי תגובה חיסונית.
- הבנת כלי הדם בקשרים לימפטיים חשובה למחקרים ביולוגיים מגוונים.
- ניתן להחיל טכניקות אלו על רקמות אחרות, כגון שריר שלד ומוח.
מטרת המחקר
- להדמיה ולהערכה של העורק המזין את קשרי הלימפה המפשעיים in vivo.
- להערכת שינויים בכלי הדם של קשרי הלימפה במצבים פיזיולוגיים שונים.
- לספק מדריך פרוצדורלי מפורט עבור חוקרים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- יצירת פתח בעור לחשיפת קשרי הלימפה המפשעיים.
- דיסקציה של רקמות חיבור ורקמות שומן המקיפות את קשרי הלימפה.
- שימוש במיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (intravital microscopy) להדמיה של רשת כלי הדם המיקרווסקולרית.
- מתן תמיסות סלין פיזיולוגי להשגת תנאי הדמיה אופטימליים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של כלי הדם בבלוטת הלימפה המפשעת.
- הדגמה של תפקוד תקין של השריר החלק בתגובה עורקית.
- הערכה כמותית של יציבות קוטר כלי הדם.
- זיהוי ברור של מבנים עורקיים וורידליים המספקים את בלוטת הלימפה.
מסקנות
- הטכניקה מספקת תובנות קריטיות לגבי המיקרוסירקולציה בבלוטות הלימפה.
- הדגמות חזותיות משפרות את ההבנה של שלבים כירורגיים מורכבים.
- ניתן להתאים שיטה זו למגוון תכנוני ניסויים בביולוגיה של כלי דם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיה אינטרה-ויטלית (Intravital microscopy) של קשרי הלימפה המפשעיים מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של דינמיקה מיקרו-וסקולרית, החיונית להבנת תנועת תאי מערכת החיסון ואינטראקציות כליות-חיסוניות. טכניקה זו תומכת בהסרת סיכונים מנגנונית (mechanistic de-risking) בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי אספקת מדדים כמותיים ותפקודיים של בריאות כלי הדם ותגובתם בתנאים פיזיולוגיים. היא מגשרת בין האימונולוגיה לביולוגיה של כלי הדם, ומספקת ערך ניבוי לתיקוף מטרות (target validation) בנתיבי פיתוח למחלות דלקתיות, זיהומים ואימונו-אנקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של השערות טיפוליות על ידי ויזואליזציה של תגובות מיקרו-וסקולריות בזמן אמת לחומרים וזו-אקטיביים, ובכך תומך בתיקוף של מטרות תפקודיות.
- ערך תפעולי: מספק מדידות כמותיות של קוטר כלי דם המשמשות כסמנים ביולוגיים הניתנים לשחזור של תפקוד כלי דם במודלים של מחלות.
- ביטחון ניבוי: מעריך את תפקוד השריר החלק והאנדותל, ובכך מסייע בהפחתת סיכונים עבור מטרות המעורבות בבקרת כלי דם ובגיוס תאי מערכת החיסון.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור תהליכי עבודה המשכיים על ידי קביעת תפקוד כלי דם בסיסי ויציבות לפני בדיקת תרכובות.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פרוטוקולי סופרפוזיה (superfusion) מבוקרים וקריטריוני ייצוב (קוטר בטווח של 5 µm למשך 20 min), ובכך מבטיח הערכה אמינה של התרכובות.
- מדרגיות: מאפשר דימות לאורך זמן במשך מספר שעות, מה שמקל על הערכת תגובות תלויות-זמן במסעי סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לניטור אורך-סיבוב של תגובות וסקולריות במודלים רלוונטיים למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בקבלת החלטות על קידום מבוסס ניהול סיכונים באמצעות כימות התפקוד הוסקולרי, המהווה גורם מכריע ביעילות התגובה החיסונית של קשרי הלימפה.
- התאמה לביומרקרים תרגומיים: קוטר כלי הדם והתגובתיות שלהם משמשים כביומרקרים תרגומיים המתואמים עם תנועת תאי מערכת החיסון ותפקוד ה-LN.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת מדדים וסקולריים פונקציונליים המכוונים את בחירת המטרה ואת ההבנה המכניסטית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על ממשקים מיקרו-וסקולריים-אימונולוגיים במהלך הומאוסטזיס ושיבוש.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות כלי דם מיוצבים ותוצרי מדידה כמותיים (קוטר, תגובתיות) המאפשרים השוואה בין תנאים ניסיוניים.
- אנליטיקה: מייצרת תוצרים מדידים, כולל שינויים בקוטר כלי הדם ותגובות של כיווץ כלי דם (vasoconstriction) והרחבת כלי דם (vasodilation), המאפשרים השוואה סטטיסטית של השפעות הטיפול.
- מחקר תרגומי: מקשרת להמשכיות פרה-קלינית על ידי מידול של תרומות וסקולריות לתגובה החיסונית, דבר הרלוונטי לפיתוח של עזרים (adjuvants) ומודולטורים אימונולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מקריאה פלטפורמת דימוי אינטרה-ויטלי הניתנת לשימוש חוזר ומיושמת על פני מספר אתרי LN ומודלי מחלה, ובכך ממקסמת את ההשקעה בתשתית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באינטראקציה בין מערכת כלי הדם למערכת החיסון.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות סופרפוזיה (superfusion) מבוקרת, ויסות טמפרטורה וקריטריונים לייצוב.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי אספקת נתונים תפקודיים של כלי דם המפחיתים סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות של אימונומודולציה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על נתוני תפקוד כלי דם, התומך בקידום יעיל מבחינת הון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרו-כירורגיה ובדימות תוך-חי (intravital imaging) כדי למזער את ההפרעה לכלי הדם במהלך הכנת הרקמה.
- תלוי בהגדרות מיקרוסקופיה תוך-חי עם קווי סופר-פוזיה (superfusion) ושאיבה להבטחת תנאי דימות יציבים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים לכימות כלי דם (למשל, מדידת קוטר באמצעות קליפרים בווידאו) להשגת תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הטכניקה לאתרים אחרים של קשרי לימפה או לרקמות כגון שריר שלד או מוח.
- מוגבל בשל האתגר הטכני של שמירה על כלי דם חיוניים לאורך תקופות דימות ממושכות, דבר המחייב ניהול קפדני של הטמפרטורה והפרפוזיה.
