Name: מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: למד מיקרוסקופיה אינטרוויטלית של הצומת הלימפה המפשעתי בעכברים לחקר מיקרו-הזרקת הדם והמבנה התוך-גופי. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי תאים ותפקודים חיסוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו ממומנת על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות, קרן קנדה עבור חדשנות, באוניברסיטה של ​​קולומביה הבריטית המרכז לחקר דם אוניברסיטת צפון לפנה&quot;ס.

1. מגיב הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים לשמש לאורך הניסוי אמור להיות מוכן לפני תחילת פרוטוקול כירורגית. שים לב כי כל הפתרונות נעשו באמצעות טכניקה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS) היא המוכנה ביותר שני רכיבים: תמיסת מלח בסיסי ביקרבונט פתרון נתרן. הכן שני פתרונות בריכוז 20X ולאחסן ב 4 ° C. סודיום ביקרבונט ב 20X הוא 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) ואת תמיסת מלח בריכוז הבסיסי הוא 20X 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mM CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), ו 23.4mM MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). הפתרונות צריכים להיות מוכנים ב DH 2 O וכימיקלים יש להוסיף אחד בכל פעם ובחש עד פתרון ברור לפני הוספת כימיים הבא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2L של PSS על ידי דילול כמויות שוות של סודיום ביקרבונט ו תמיסת מלח בסיסי דילול ריכוז 1X (שני לדלל 2L של PSS 100 מ"ל של נתרן ביקרבונט כל תמיסת מלח בסיסי DH 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח 2L מקום בקבוק המכיל PSS ו PSS ב 37 ° C אמבט מים. לאזן את הפתרון עם 5% CO 2 / גז חנקן איזון 1 שעות לפני תחילתו של הליך כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימיקלים Vasoactive (Phenylephrine דוגמה, אצטילכולין, nitroprusside נתרן) מוכנים הטובה ביותר בריכוז 1M ב dH2O ומאוחסנים 100μl aliquots ב -20 ° C. </li></ol> 2. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את משקל העכבר לנהל את המינון הראשוני של נתרן pentobarbital ב 90mg/kg בזריקה intraperitoneal. לאורך כל ההליך העכבר נמצא במעקב מתמיד על מטוס הרדמה דרך קמצוץ הבוהן בחינה מדוקדקת של קצב הנשימה. זריקות נוספות של נתרן pentobarbital צריכה להינתן לפי הצורך ב 20mg/kg לשמור על מטוס הרדמה. המטוס של הרדמה כירורגית מתוחזק לפי תקנות פדרליות מוסדיים כפי שתואר בפרוטוקול טיפול בבעלי חיים אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (ACUC) מאוניברסיטת צפון לפנה"ס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שיער מאזור הבטן האגף / ירך על ידי גילוח. הסרת השיער הנותר משוחרר על ידי אלכוהול ספוגית ומלטף את האזור עם הקלטת. זה די כמו הליך זה הוא ניסיוני סופנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על לוח כירורגית ברור בעמדה פרקדן ולצרף את העכבר ללוח ידי מקליטה כל שודד דרכים על הלוח. טמפרטורת הגוף נשמרת באמצעות מנורת חום חיצוני לפקח באמצעות מדחום רקטלי, כדי להבטיח כי היפותרמיה אינו מתרחש כתוצאה הרדמה. </li></ol> 3. הליך כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ההליך הכירורגי כולו להבטיח רקמה חשוף נשמר תמיד superfused עם פתרון equilibrated PSS התחמם. חשוב גם לא ליצור קשר עם vasculature של עניין עם מכשירי ניתוח או לפצוע את ידי הצבת כלי להכריח אותם הרבה על ידי מניפולציה רקמת שומן ורקמת חיבור סביבם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר מתחת למשטח הביתור. ביצוע חתך קו האמצע על פני השטח הגחון של חלל הבטן לסגת העור כלפי עמוד השדרה של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העור הוא חזר בו, כך LN גלוי בקלות, להצמיד את העור על בסיס של 184 Sylgard שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שכבה דקה של רקמת חיבור שכיסה את האזור סביב LN </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את שכיסה רקמה שומנית ו להקיף את הלימפה עד מיטה כלי הדם חשוף. הקטע העורקי המרכזי מניח הסמוכים LN והוא overlayed כלל על ידי ורדיד. הניתוח כולו נמשך 30 דקות בקירוב. </li></ol> 4. הדמיה וניתוח כלי השיט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קטע של כלי הריבית חשוף מתחת למשטח הביתור, מאובטח על הכנת המיקרוסקופ intravital. שים לב בעלי חיים נשאר על הלוח תוך ניתוח ברור על המיקרוסקופ intravital לאורך כל תקופת הניסוי. טמפרטורת הגוף נשמרת באמצעות מנורת החום שנמדד באמצעות מדחום רקטלי כמתואר בסעיף במהלך הניתוח. המטוס הרדמה מנוטר גם במהלך הניסוי, כמתואר בסעיף 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת superfusion קווי יניקה. Superfusion של PSS מתרחשת על ידי כוח המשיכה להאכיל מן המאגר, לתוך מאגר המים מחוממים ז'קט (מקטורן מים מופץ ומחומם waterbath במחזור) להיות perfused על ידי חנקן 5% CO 2 מאוזנת, לאורך קו טפטוף בשיעור של 10 מ"ל / min. קו יניקה יש להשתמש כדי להמשיך למשוך PSS superfused הרחק ההכנה. שים לב לפני הניסוי קווי יניקה ז'קט מים מנקים ביסודיות מאוחסן לאחר כל ניסוי. זה מבטיח סטריליות לקראת הניסוי הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הטמפרטורה של PSS superfusing. כוונו את הטמפרטורה שלבמחזור אמבט מים ו / או שיעור superfusion PSS כדי להשיג טמפרטורה של ~ 37 ° C על פני ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר vasculature לאזן עם PSS במשך לפחות 60 דקות לכמת את קוטר כלי שיט באמצעות קליפר וידאו. בדרך כלל, קוטר כלי צריך להיקבע בנקודות מרובות (למשל, בגיל 40, 50, ו - 60 דקות) כדי להבטיח את כלי התייצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הבריאות של כלי השיט באמצעות אגוניסט השריר החלק ספציפיים (דוגמה Phenylephrine, PE) ו אגוניסט ספציפי האנדותל (אצטילכולין דוגמה, ACH). ריכוז של אגוניסט צריך להיות מותאם בהתאם אגוניסט, אבל עבור PE ו אח כלי יש להעריך את ריכוז כל אחד על ידי תוספת מצטברת (10-5M ל 10-9M) כדי superfusate. כל יישום אגוניסט צריכים להיות מופרדים על ידי בשלב לשטוף (בדרך כלל 30 דקות) באמצעות כלי PSS עד חוזר בקוטר מנוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הערכה של בריאות כלי שיט, סמים vasoactive הבאים, תיוג פלורסנט, ותא התחקות ניסויים ניתן לבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תום הניסוי בבעלי חיים ניתנת מנת יתר של נתרן pentobarbital. החיה מנוטר על מנת להבטיח כי אז אין תגובה לצבוט הבוהן חוסר תנועה בדרכי הנשימה או פעימות לב. בשלב כזה זה מלווה נקע בצוואר הרחם. </li></ol> 5. נציג תוצאות: לאחר תקופת הכנה איזון אמור להניב תמונה ברורה המאפשרת זיהוי של עורקיק והן ורדיד המספקת את הלימפה מפשעתי. לא צריך להיות בתאי השומן המקיפים את כלי מינימלי כדי לאפשר קירות עורקיק ו ורדיד להיות נצפו בבירור את מחוגה וידאו להתווסף לחישוב קוטר כלי הדם. נקודת נפרד הכנה מוצלחת היא עורקיק יש היצע עשיר של דם נע לומן, וכי יש מידה משמעותית של הטון וסקולרית (כלומר עורקיק יש את היכולת vasoconstrict ו vasodilate להחליק שרירים אגוניסטים ספציפיים אנדותל בהתאמה) . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="איור 1"> באיור 1. תמונה מיקרוסקופית של Intravital מפשעתי הלימפה להאכיל עורקיק (חץ אדום) להאכיל את הלימפה equilibrated עם תמיסת מלח פיזיולוגית לרוץ בצד ורדיד הראשי (חץ ירוק). <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="איור 2"> איור 2. בתגובה vasoactive רגיל עד phenylephrine superfused (PE) על ידי תוספת מצטברת של ריכוזי מלח פיזיולוגיים 10 -9 מ -5 עד 10 מ ' הנוכחות של vasoconstriction החזקה היא המעידים על תפקוד נורמלי שריר חלק נוכח עורקיק. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="איור 3"> איור 3. בתגובה vasoactive רגיל עד superfused אצטילכולין (ACH) על ידי תוספת מצטברת של ריכוזי מלח פיזיולוגיים 10 -9 מ -5 עד 10 מ ' הנוכחות של התרחבות חזק הוא רמיזות של ההווה נורמלי תפקוד האנדותל ב עורקיק.

<ol><li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li>
<li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li>
<li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li>
<li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li>
<li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li>
<li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מיקרוסקופיה Intravital של הצומת לימפה מפשעתי המובא כאן מספק את היכולת microvasculature תמונה של הצומת לימפה ב-vivo. לכן, זה מקל על אמצעי תצפית ישירה בזמן אמת. הדמיה של microvasculature LN הוא אתר ייחודי המאפשר אחד כדי ללמוד את הממשק בין התגובה החיסונית ועל כלי הדם. באמצעות הכנה זו, ניתן להתמקד כוון במיוחד התגובה החיסונית, שינויים בכלי הדם, או על אינטראקציה בין השניים. כמו עם כל הגישות ניסיוני, מיקרוסקופיה intravital תקן יש גם יתרונות ומגבלות. תקן IVM, כגון הכנת המתואר כאן, יכול בקלות להיות שונה, ואת כבר הוכיח בעבר על ידי המחברים, כדי לאפשר מיקרוסקופיה epifluorescent באמצעות הקדמה של צבעי ניאון נותב או אוכלוסיות תאים הנקרא. למרות IVM רגיל לא נותן את האפשרות של הדמיה תלת מימדי ו התחקות כגון תינתן על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים או אנגיוגרפיה, מעקב תא מושגת עדיין בשני ממדים המאפשר התא אל התא אל התא vasculature אינטראקציה להיות צפו לכמת ובשיתוף עם הממשל ב-vivo ו מכתים הבאים עם נוגדנים ניאון ניתן להשתמש כדי לתת נתונים על ביטוי החלבון / סמן בזמן אמת. יש לציין, טכניקות חלופיות הדמיה דורשים סביבה סטטית עבור תמונות, לחיצה על אזור הניתוח או תוספת של coverslip על הכנת שטוח יש צורך לעיתים קרובות. זה מגביל, אם לא מבטל, את היכולת פעיל perfuse מתווכים וסקולרית או אחר על הכנת להעריך שלמות כלי הדם ופיזיולוגיה וכו &#39;, או שימוש בטכניקות אחרות, כגון התרחבות ניסויים שנערכו במסגרת הכנת IVM. יתר על כן, תקן IVM אינה דורשת הכנה שטוח לחלוטין, אינו מושפע תנועה, כמו זה שנוצר על ידי הנשימה של החיה. תקן זה מאפשר IVM לשמש באזורים כירורגית יותר עם reproducibility יותר. זה בא לידי ביטוי על ידי הכנה צומת מפשעתי הלימפה המתוארת כאן. בהתחשב בגודל ובצורה של הצומת לימפה, הכנת לא ניתן שטוח מבלי לפצוע את הרקמות ואת המיקום של הצומת מעורר תנועה משמעותית עקב הנשימה של בעלי חיים. סוגיות אלה יהיה קשה להתגבר בשיטות אחרות, אבל הם עסקו בקלות באמצעות הכנה IVM תקן תיאר. לסיכום, הכנת שפורטו לעיל ניתן לשלב עם כל מספר של אחרים ביוכימיים, כלי הדם, ו / או טכניקות החיסונית כגון העברה של תת קבוצות של מופעל או התאים שכותרתו, אינדוקציה של היפוקסיה, ושוב הביטוי של דלדול של מתווכים וסקולרית. עם זאת, יישומים נוספים תלויים בריאות הכנה הראשונית. לכן, חיוני תמיד לבדוק את בריאותם של vasculature עתה צילמו ומוערכת. נקודות המפתח להשגת הכנה הבריאות הבטחת הכנה היא perfused הזמן בטמפרטורת הגוף עם PSS equilibrated ומזעור מגע ומתח דגש על אזור הניתוח במהלך הניתוח.

<a href="https://app.jove.com/t/6652">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/2551">10.3791/2551</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/2551">Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node</a>. The Authors&#160;and Discussion&#160;sections were&#160;updated.

Erratum: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> נתרן כלוריד </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> אשלגן כלוריד </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> סידן כלוריד Dihydrate </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> נתרן Nitroprusside </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> Phenylephrine </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> אצטילכולין </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד heptahydrate </td><td> סיגמא אולדריץ </td></tr><tr><td> Pentobarbitol נתרן </td><td></td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופית intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

בלוטות הלימפה (של LN), הנמצא בכל הגוף, הם מרכיב בלתי נפרד של מערכת החיסון. הם משמשים כאתר לזירוז של תגובה חיסונית אדפטיבית, ולכן, את התפתחותם של תאים מפעיל. ככזה, LNs הם המפתח הלחימה פתוגנים הפולשים ושמירה על הבריאות. הבחירה של LN ללמוד מוכתב על ידי נגישות המודל הרצוי; הלימפה מפשעתי ממוקם היטב ובקלות תומך במחקרים של מודלים רלוונטיים ביולוגית של העור וזיהומים הרירית באיבר המין. LN מפשעתי, כמו LNs כל, יש רשת ענפה כלי הדם המספקים לו את הדם. באופן כללי, זו רשת כלי הדם כוללת את עורקיק להאכיל העיקרי של LN כי לאחר מכן סניפים הזנות venules אנדותל גבוהה (HEVs). HEVs מתמחים עבור קידום הסחר של תאים חיסוניים לתוך LN במהלך הומאוסטזיס והן זיהום. איך HEVs להסדיר סחר לתוך LN תחת שניהם בנסיבות אלה הוא אזור של חיפושים אינטנסיביים. להאכיל LN עורקיק, יש השפעה ישירה על הזרם HEVs והוא האספקה ​​העיקרי של חומרים מזינים בדם עשיר התא לתוך LN. יתר על כן, שינויים עורקיק ההזנה מעורבים בקידום אינדוקציה של תגובה חיסונית אדפטיבית. Microvasculature LN יש חשיבות ברור בשמירה על אספקת הדם האופטימלי LN ועל ויסות זרם לתוך תא החיסון LN, אשר הם מרכיבים חיוניים לתפקוד תקין LN התגובה החיסונית לאחר מכן. היכולת ללמוד את microvasculature LN in vivo היא המפתח הבהרת איך את המערכת החיסונית ואת microvasculature אינטראקציה ומשפיעים זה על זה בתוך LN. כאן, אנו מציגים שיטה בתחום ההדמיה vivo של הצומת לימפה מפשעתי. אנו מתמקדים הדמיה של microvasculature של LN, תשומת לב מיוחדת שיטות להבטיח את המחקר של כלי בריא, היכולת לשמור על דימות של כלי קיימא במשך מספר שעות, וכימות של גודל כלי הדם. שיטות זלוף של microvasculature עם תרופות vasoactive כמו גם את הפוטנציאל לאתר ולכמת תנועה הסלולר מוצגים גם. מיקרוסקופיה Intravital של LN מפשעתי מאפשר הערכה ישירה של כלי הדם פונקציונליות בזמן אמת ממשק של ממשק ישיר בין תאים חיסוניים, LN, ואת microcirculation. טכניקה זו פוטנציאל להיות בשילוב עם טכניקות החיסונית רבים וסימון התא ניאון כמו גם מניפולציות כמו ללמוד vasculature של LNs אחרים.

הטכניקה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הצומת לימפה מפשעתי (LN) הוא התווה. טכניקה כזו מאפשרת בזמן אמת,<em&gt; In vivo</em&gt; מחקר microvasculature הלימפה צומת ומבנה הן במהלך הומאוסטזיס וזיהום. טכניקה זו ניתן להתאים מחקרים סחר סלולריים לאתרים אחרים הצומת לימפה.

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

קשרי לימפה (LNs), הממוקמים ברחבי הגוף, הם מרכיב בלתי נפרד של מערכת החיסון. הם משמשים כאתר להשראת חיסון אדפטיבי...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים ולהעריך in vivo את העורק המזין את קשרי הלימפה המפשעיים. הדבר מושג תחילה על ידי יצירת שטח עור (skin flap) באמצעות דיסקציה זהירה של העור באזור המפשעה של העכבר, המכסה את קשרי הלימפה המפשעיים. לאחר מכן, הרקמה החיברת המכסה את אזור קשרי הלימפה מופרדת.בשלב הבא, יש להסיר את רקמת השומן שמסביב כדי לחשוף את כלי הדם התזונתיים של קשרית הלימפה. לבסוף, שינויים בכלי הדם של קשרית הלימפה מוצגים ומוערכים באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיה (intravital microscopy). למרות זאת, ההכנה שתראו היום היא המיקרו-סירקולציה של קשרית הלימפה המפשעת. טכניקות כירורגיות אלו יכולות לשמש להכנות אחרות, כגון שריר שלד וכן מוח.באופן כללי, בעת ביצוע טכניקה זו, מתחילים מתקשים משתי סיבות עיקריות. הראשונה היא העובדה שמתעסקים בבעל חיים חי, והשנייה היא מכיוון שמבצעים ניתוח באזור קטן מאוד, כל הפרעה לכלי הדם עצמו או לאזור שסביבו עלולה להשפיע לרעה, מה שיפגע בניסוי שברצונכם לערוך. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית להצלחה.ישנם מספר שלבים מורכבים המעורבים בתהליך, אשר קשה להעבירם מהטקסט ליישום בפועל של הטכניקה. חשוב לראות זאת כדי לבצע את הפעולה בצורה נכונה. עם הרבה הצלחה.ראשית מרדימה את העכבר ומגלחת את אזור הניתוח. לפרטים נוספים, נא לעיין בכתב היד של המאמר. לאחר מכן, ניתן להניח את העכבר על לוח ניתוח שקוף במצב שכיבה על הגב.הצמידו את העכבר ללוח על ידי הדבקה של כל כרית כף הרגל. יום לפני הניסוי, ערבבו את ה-thes guard 180 4 בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, השתמשו בצלחת פטרי סטנדרטית חד-פעמית כתבנית, שפכו את התערובת לעומק של כרבע אינץ' והניחו לה להתקשות במהלך הלילה. הוציאו את ה-thes guard מצלחת הפטרי והניחו אותה על הלוח הכירורגי.הניחו את העכבר המורדם והגזור תחת מיקרוסקופ ההבדילה. בצעו חתך קו אמצע לאורך המשטח הוונטרלי של חלל הבטן באמצעות פינצטה מפלדת אל חלון מספר 5 ומספרי קפיץ בעלי להבים ישרים. לאחר מכן, המשיכו את חתך קו האמצע באלכסון לכיוון הגפיים והסיטו את העור לכיוון עמוד השדרה המסיבי.ברגע שה-ln נראה בבירור, הצמד את העור שהורחקה באמצעות סיכות חרקים מפלדת אל-חלד ומלקחי אפוקסי inox אל ה-cigar. 180 4 pedestal. הוסף תמיסת סליין פיזיולוגית או PSS לאזור.בשלב הבא, הסירו את השכבה הדקה של רקמת החיבור המכסה את האזור שסביב ה-ln. בעזרת פינצטה, אספו בזהירות חתיכות קטנות של רקמת חיבור והפרידו אותן מה-ln. לאחר מכן, בעזרת מספרי קפיץ, הסירו את רקמת השומן המכסה ומקיפה את ה-LN עד לחשיפת המיקרו-וסקולריקה (מיטת כלי הדם המיקרוסקופיים).בשלב זה, חשוב להקפיד לא לבוא במגע עם כלי הדם המדוברים באמצעות מכשירים כירורגיים, ולא לפגוע בכלי הדם על ידי הפעלת כוח רב מדי בעת מניפולציה של הרקמה שסביבם. הדרך המיטבית לפינוי השומן מה-ln היא על ידי הרפיית רקמת החיבור, החזקת הרקמה השומנית בעזרת פינצטה, ולאחר מכן הסרה עדינה של רקמת השומן עד לשדה ראייה נקי. לאחר הסרת רקמות החיבור והשומן, ניתן יהיה לראות את המקטע העורקי המרכזי הסמוך ל-LN ואת הווריד הנלווה העליו הוא מונח.לאחר שקטע כלי הדם הרלוונטי נחשף תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, קבעו את הדגימה על המיקרוסקופ האינטרה-ויטלי. הגדירו את קווי הסופרפוזיה והשאיבה. במהלך חלק זה של הפרוצדורה, חיוני להבטיח שהרקמה החשופה תישמר תמיד תחת סופרפוזיה של תמיסת PSS מאוזנת.סופרפוזיה (Superfusion) של PSS מתבצעת באמצעות כוח הכבידה. הזנה ממאגר ראשוני למאגר בתוך מעטפת מים מחוממת, המופעל בזרם של 5% Carbon dioxide במאזן חנקן, ולאחר מכן דרך קו טפטוף בקצב של 10 milliliters לדקה. יש להשתמש בקו שאיבה כדי להמשיך להרחיק את ה-PSS שסופרפוזיה בו מהדגימה על ידי מיקומו בתחתית השכיב של העור (skin flap); לאחר מכן יש לבדוק ולהתאים את הטמפרטורה של אמבט המים המ巡גז ואת קצב הסופרפוזיה של ה-PSS כדי להשיג טמפרטורה אופטימלית של כ-36 degrees Celsius.במהלך ההכנה, אפשרו לכלי הדם להגיע לשיווי משקל עם PSS למשך 60 דקות לפחות. ודאו שהבעל החיים אינו סובל מהיפותרמיה באמצעות מד חום רקטלי וספקו מנורת חימום חיצונית. בזמן שה-PSS מגיע לשיווי משקל, כמותו את קוטר כלי הדם.השתמשו במדפי השלייה של הווידאו בנקודות זמן מרובות כדי לוודא שהכלי התייצב; התייצבות מוגדרת כשגודל הקוטר נשאר עקבי בטווח של חמישה מיקרומטרים למשך תקופה של 20 דקות. מדידות הקוטר נרשמות במחשב באמצעות תוכנת chart lab. לאחר תקופת השיווי, העריכו את תקינות הכלי באמצעות אגוניסט ספציפי לשריר חלק, כגון פנילפרין (phenylephrine), כפי שמוצג כאן עם פנילפרין.הוסיפו את האגוניסט למערכת. יש להעריך שמונה אגוניסטים בכל עלייה לוגריתמית בריכוז המצטבר של האגוניסט בעת הוספתו ל-SUP fate בין המנהלות של כל אגוניסט. יש לבצע שלב שטיפה באמצעות PSS למשך 30 דקות או עד שהכלי חוזר לקוטר המנוחה שלו.להלן תוצאות מייצגות של בלוטת לימפה מincludegraphics inguinal לאחר תקופת ההשוואה. הזנה של העורק בתמיסות מלח פיזיולוגיות מניבה תמונה ברורה המאפשרת זיהוי הן של העורק המזין, המסומן כאן בחץ אדום, והן של הווריד, המסומן בחץ ירוק, אשר מספקים את בלוטת הלימפה המפקיעה. הגרף מציג תגובה וזוואקטיבית טיפוסיים של עורק המזין בבלוטת לימפה מפקיעה להוספה מצטברת של SUP fused phenylephrine לתמיסת מלח פיזיולוגית.ריכוזים שבין 10⁻⁹ molar ל-10⁻⁵ molar, המלווים בכיווץ כלי דם (vasoconstriction) חזק, מעידים על תפקוד תקין של השריר החלק בעורקים. גרף זה מציג תגובה וזו-אקטיבית טיפוסית להוספה מצטברת של acetylcholine למי מלח פיזיולוגיים, בריכוזים שבין 10⁻⁹ molar ל-10⁻⁵ molar.נוכחות של התרחבות כלי דם (vasodilation) חסונה מעידה על תפקוד אנדותלי תקין בעורקים. בניסיון להכין דגם זה, אחד הדברים המרכזיים שיש לזכור הוא לצמצם למינימום את ההפרעה לכלי הדם ולאזור שסביבו כדי למקסם את סיכויי ההצלחה. בעקבות הליך זה, ניתן להטמיע שיטות נוספות, כגון פלואורסצנציה, כדי לבחון תפקודי תא אחרים, כגון תעבורת תאים (cell trafficking).לאחר הפיתוח של טכניקה זו, היא סללה את הדרך לגישור בין התחומים של אימונולוגיה וביולוגיה וסקולרית אל תחום חדש של אימונולוגיה וסקולרית.

intravital-microscopy-of-the-inguinal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ההתקדמות מיקרוסקופיה 2-פוטון אפשרו בזמן...

Intravital הדמיה של בלוטות לימפה popliteal עכבר

שיטות הדמיה שפותחו לאחרונה באמצעות פלואורסצנטי קרוב אינפרא אדום (NIRF) עשויות לעזור להבהיר את תפקיד מערכת הלימפה משחקת בהתפשטות גרורה סרטני, תגובה חיסונית, תיקון פצע, ומחלות אחרות הקשורים לימפטי.

דימות אופטי לא פולשנית של כלי דם הלימפה של עכבר

בסרטון זה, אנו מדגימים את הטכניקה לדמיין את בלוטת הלימפה המפשעתית במודל עכבר באמצעות הדמיית אולטרסאונד בתדר אולטרה גבוה. טכניקת הדמיה לא פולשנית זו מאפשרת מעקב אחר השינוי בנפח בלוטות הלימפה בחיה לאורך זמן.

עכבר ניתוח נפח בלוטות הלימפה המפשעות: טכניקת הדמיה אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד כדי לקבוע את נפח בלוטת הלימפה המפשעתית במודל העכבר

סרטון זה מדגים הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתליאליים γδ (IELs) בעכברים טרנסגניים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. ההליך הכירורגי כולל יצירת קו ניקוב וביצוע חתך אורכי כדי לחשוף את רירית המעי ואת villi. העכברים הטרנסגניים מבטאים חלבוני כתב באופן בלעדי ב-γδ IELs, מה שמאפשר מעקב אחריהם. הדמיה תוך-חיונית לוכדת את התנועה הדינמית של γδ IEL ירוק המסומן בפלואורסצנטיות לאורך קרום המרתף של תא האפיתל של המעי.

הדמיה תוך חיונית של לימפוציטים תוך-אפיתליאליים של גמא דלתא

סרטון זה מדגים את הליך הבידוד הכירורגי של בלוטת הלימפה המתנקזת מפשעתית מדגם עכבר. חתך באזור הבטן מספק גישה לבלוטת הלימפה המפשעה, אשר נקטף בניתוח. בלוטת הלימפה השקופה שנקטפה יכולה לשמש למחקרים אימונולוגיים.

קצירת בלוטת לימפה מנקזת מפשעתית ממודל מורין

ההדמיה intravital ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת עד 120 מיקרומטר עומק בבלוטות הלימפה של עכברים בוגרים מושגת על ידי מרחבית ויסות דפוס העירור של מיקרוסקופ שני פוטונים רב המוקדים. ב100 עומק מיקרומטר מדדנו החלטות 487 ננומטר (לרוחב) ו551 ננומטר (צירי), ובכך לעקוף את מגבלות פיזור ועקיפות.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לתמונה אוכלוסיות תאים שונות בבלוטות לימפה ניקוז ללא שינויים במבנה האיברים.

חזותי מבנה צומת לימפה ולוקליזציה לסלולר באמצעות Ex-Vivo Confocal מיקרוסקופ

אנו מתארים שיטה כדי להמחיש gfp γδ iels התווית באמצעות הדמיה intravital של המעי הדק מורטין על ידי מיקרוסקופית הפוכה דיסק מיקרוסקופ קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת מעקב של תאים חיים בתוך רירית עד 4 h והוא יכול לשמש כדי לחקור מגוון של אינטראקציות מעיים החיסונית-אפיתל.

אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין

כאן, אנו מראים כיצד לבצע מיקרוסקופ לאחר הנימי של השריר הראשי של העכבר. בדרך כלל מיושם מודלים שונים של דלקת אלח דם, במיוחד אלה המושרה על ידי נוגדנים ו ציטוקינים, אנו להדגיש את הרלוונטיות שלה במחקר של מוסקולופאאס מעורבים חדירה מוגזמת שרירי לוקיציט.

הסתננות לאוציט של שריר Cremaster בעכברים המוערך על ידי מיקרוסקופ אינטרטל

מלנומה היא מחלה אגרסיבית מאוד שמתפשטת במהירות לאיברים אחרים. פרוטוקול זה מתאר את היישום של הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד, יחד עם עיבוד 3D, כדי לפקח על הנפח של בלוטות הלימפה מפשעתיות במודל העכבר Braf / Pten של מלנומה גרורתית.

ניתוח נפח בלוטות הלימפה על ידי הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד במודל העכבר המהונדס גנטית Braf /Pten של מלנומה

למד מיקרוסקופיה אינטרוויטלית של הצומת הלימפה המפשעתי בעכברים לחקר מיקרו-הזרקת הדם והמבנה התוך-גופי. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחרי תאים ותפקודים חיסוניים.

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

גלה סרטונים נוספים