Orthotopic Xenografting של האדם בלוציפראז-Tagged ממאירה היקפיים נדן בתאי העצב גידול של In vivo בדיקה של סוכני המועמד טיפולית

שיטה אמינה עבור השתלת בלוציפראז-מתויג האדם ממאיר עצב היקפי נדן תאים סרטניים לתוך עצב השת של עכברים immunodeficient מתואר. השימוש הדמיה פליטת אור להפגין הקמת התקין של שתלי וקריטריונים גידול של הפרדה אקראית של בעלי חיים לקבוצות המחקר נדונות גם.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע אם חומר טיפולי מועמד מעכב ביעילות את הצמיחה של תאי M-P-N-S-T המושתלים בעצב הסיאטי של עכברים חסרי חיסון. זה מושג על ידי הסרת תאי הגידול מבקבוק רקמה, שטיפתם והחייאתם בתליית הריכוז המתאים. השלב השני של ההליך הוא לחשוף בניתוח את העצב הסיאטי ולאחר מכן להזריק לעצב 5,000 תאים.

השלב הבא הוא לקבוע את הצלחת ההשתלה באמצעות הדמיה מבוססת אור in vivo, המחלק את ה-CIN באופן אקראי לקבוצות מחקר ולהתחלת טיפול עם החומר הטיפולי המועמד. השלב האחרון של ההליך הוא איסוף הגידולים 30 יום לאחר ההשתלה וניתוח ההשפעות של החומר הטיפולי המועמד על הגידול. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות אם החומר הטיפולי הפחית את צמיחת הגידול באמצעות שיטות כגון השוואת משקלי הגידול, הסתכלות על שיעורי התפשטות יחסיים באמצעות צביעה חיסונית עבור KI 67 והערכת רמות המוות של תאי הגידול בביקורת ובעכברים שטופלו במבחני מנהרה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו השתלה תת עורית, הוא שהיא מדגמנת את המיקרו-סביבה הרגילה, אשר מדגמנת טוב יותר את צמיחת M-P-N-S-T המדגימה טכניקה זו תהיה איימי טורק, טכנאית מהמעבדה שלי. עכברים שאינם חסרי חיסון עירומים מוכנים יום לפני ההשתלה. השתמש בקוצץ כדי לגלח את השיער מעכבר מורדם שעובד על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.

השתמש בחומר אפילציה כימי כדי להסיר את כל השיער שנותר. לאחר הסרת כל השיער, הנח את העכבר על כרית חימום בכלוב בידוד ללא מצעים עד להתאוששות מלאה. ביום השתלת הצנטריפוגה התאים ב -3000 סל"ד למשך חמש דקות.

הסר את הסנאט בזהירות והשהה מחדש את כדור התא ב-DMEM 10 ללא פור מיצין לריכוז סופי של חמש פעמים 10 לתאים השלישיים לשלושה מיקרוליטר. שמור את התאים על הקרח עד שהם מוכנים לשימוש. כדי להתחיל, הניחו בעל חיים מורדם על כרית חימום ומרחו משחה עיניים על כל עין.

הצמד תג אוזניה עם מספר מזהה ייחודי לאוזן הימנית של כל עכבר. כדי להקל על הזיהוי לאורך המחקר, הניחו את החיה על בטנה ופרשו את רגליה האחוריות. מכסים את העכבר בווילון סטרילי וחושפים חלון כירורגי בו תתרחש ההשתלה.

מרחו בטדין על אתר הניתוח בעזרת אפליקטור עם קצה כותנה המתחיל במרכז האגף ומסתחרר בהדרגה החוצה לקצוות חלון הניתוח. לאחר מכן מורחים 70% אתנול על אתר הניתוח באותו אופן. מריחות עוקבות של בטדין ואחריו אתנול חוזרות על עצמן פעמיים נוספות.

הסר את התאים מהקרח ומערבול בעדינות או העבר את הצינור כדי להשעות מחדש את התאים המיושבים. השתמש בפיפטה כדי להסיר 3.2 מיקרוליטר מתרחיף התא ולהוציא אותו על פיסת פרפורם. משוך שלושה מיקרוליטר של מתלה התא למזרק המילטון בנפח 10 מיקרוליטר.

מצויד במחט 33 מד. החזיקו את התאים ואת התא המכיל מזרק על קרח עד שהם מוכנים לשימוש. השתמש בידית אזמל מספר ארבע, המצוידת בלהב אזמל מספר 22 כדי לבצע חתך דרך עור האגף ממש מתחת ומקביל לעצם הירך.

פתח את חתך העור בעזרת המהדק הכירורגי כדי לחשוף את השריר הבסיסי. השתמש בזוג מספריים חדים כדי לנתח את הפאשיה העוברת לאורך הרגל ולחשוף את העצב הסיאטי שנמצא מתחת למבנה ליניארי לבן בעובי של חוט עבה הפועל תחת מיקרוסקופ. השתמש בזוג מלקחיים מעוקלים חדים כדי לנתח בזהירות מתחת לעצב ולשחרר אותו מהשריר שמתחתיו.

השאר את המלקחיים במקומם כדי לשמור על העצב מורם ומבודד בזהירות הכנס את המחט של מזרק המילטון לעצב בניסיון לשמור על זווית ההזרקה מקבילה ככל האפשר לעצב, כדי לא לנקב את הצד התחתון. לאחר שהמחט ממוקמת כראוי בעצב, הרפו את המתח המיוצר על ידי המלקחיים והזריקו לאט את התאים במהלך 45 עד 60 שניות. הזרקה איטית חיונית למניעת שטיפה חוזרת של תאי הגידול וכתוצאה מכך לאובדן שלהם.

לאחר שכל התאים הוזרקו בהצלחה, משוך לאט את המחט כדי למזער את אובדן החומר המוזרק. לאחר השלמת ההזרקה, הסר את המהדק הניתוחי ואת המלקחיים. לאחר מכן החזר בזהירות את העצב למיקומו המקורי.

סגור את החתך עם דבק כירורגי וטרינר, החזק אותו יחד עם מלקחיים למשך כ-20 שניות כדי לאפשר לדבק להתייבש. הכניסו את החיה לכלוב מחומם ללא מצעים עד להתאוששות מלאה. עקוב אחר בריאות העכברים.

עכברים יומיים מוסרים מהמחקר. אם עומס הגידול עולה על 10% ממשקל הגוף הרגיל של בעל החיים או ירידה במשקל עולה על 20%כדי לקבוע את הצלחת ההליך, בצע הדמיה ביולומינסנציה יום ושלושה לאחר ההשתלה. הזרקו לעכבר 2.5 מיליגרם לוציפר והניחו את החיה המורדמת על פלטפורמת ההדמיה המחוממת.

פליטת אור מהגחלילית המתבטאת בגידול מתגלה 10 דקות לאחר הזרקת המצע. שימוש בתוכנה של Xeno Gen הגדיר את זמני רכישת התמונות לטווח של שנייה אחת עד 10 דקות. לאחר מכן, צלמו תמונות בשחור-לבן של העכברים פסאודו-קולור.

קנה המידה של ביולומינסנציה מכוסה בתמונות אלה כדי לספק מדד לעוצמת פליטת האור. כדי להיות זכאים להיכלל בקבוצת ניסויים פרה-קליניים, עכברים חייבים להיות בעלי אות ביולומינסנציה הניתן לזיהוי, יום ושלושה לאחר ההשתלה, ועוצמת האות חייבת לעלות בין היום הראשון לשלישי. מוצגת כאן עלייה מתקדמת טיפוסית בביולומינסנציה שנצפתה יום עד 18 יום לאחר ההשתלה בקסנוגרפט אורתוטופי מבוסס כהלכה בעכבר עירום.

שימו לב לדמיון באותות שזוהו באזור העניין של עכברים שונים. הדמיה חוזרת 10 ימים ו-18 ימים לאחר ההשתלה מראה כי אותות ביולומינסנט גדלים בהדרגה באתר ההשתלה בעכברים בודדים. כימות האותות הביולוגיים שנצפו יום עד 24 ימים לאחר ההשתלה מראה כי למרות שהאותות הללו גדלים בהדרגה, צמיחת הגידול מואצת באופן ניכר בשלבים המאוחרים יותר של תקופת המחקר.

בהתחשב בצמיחה האגרסיבית של M pns ts, תאי הגידול המושתלים פורצים לעתים קרובות את המחסומים הרגילים של העצב ופולשים לרקמות סמוכות. מיקרוגרף צילום זה של אתר השתל מדגים את צמיחת הגידול ופלישה מוקדית לשריר השלד הסמוך לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו בעכבר אחד תוך 10 דקות כאשר היא נעשית כראוי.