Name: דימות אופטי של נוירונים גנגליון סרטן Stomatogastric עם מתח רגיש צבעים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: למד דימות אופטי של נוירונים גנגליון סרטן Stomatogastric עם צבעים רגישי מתח. טכניקה זו מאפשרת הקלטת שינויי פוטנציאל ממברנה ואינטראקציות סינפטיות ללא נזק לתאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מכירים תמיכה על ידי בית הספר למדעי מחשוב הפקולטה למדעי החקלאות, והנדסה של אוניברסיטת ניוקסל, על ידי אוניברסיטת Ulm, ועל ידי SciMedia בע&quot;מ (טוקיו, יפן).

<ol><li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Bartos, M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercircuit+control+of+motor+pattern+modulation+by+presynaptic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intercircuit control of motor pattern modulation by presynaptic inhibition.</a> J. Neurosci. 17, 2247-2256 (1997).</li>
<li>Blitz, D. M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+pattern+selection+via+inhibition+of+parallel+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor pattern selection via inhibition of parallel pathways.</a> J Neurosci. 17, 4965-4975 (1997).</li>
<li>Stein, W., Smarandache, C. R., Nickmann, M., Hedrich, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+activity-dependent+synaptic+enhancement+at+a+crustacean+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of activity-dependent synaptic enhancement at a crustacean neuromuscular junction.</a> J Exp Biol. 209, 1285-12300 (2006).</li>
<li>Loew, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiometric+dyes%3A+Imaging+electrical+activity+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+%26+Appl+Chem%22%5BJournal%5D)">Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes.</a> Pure & Appl Chem. 68, 1405-1409 (1996).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> J Neurosci Meth. 102, 11-23 (2000).</li>
<li>Heinzel, H. G., Weimann, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behavioral+repertoire+of+the+gastric+mill+in+the+crab%2C+Cancer+pagurus%3A+an+in+situ+endoscopic+and+electrophysiological+examination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The behavioral repertoire of the gastric mill in the crab, Cancer pagurus: an in situ endoscopic and electrophysiological examination.</a> J Neurosci. 13, 1793-1803 (1993).</li>
<li>Zecevic, D., Wu, J. -Y., Cohen, L. B., London, J. A., Höpp, H. P., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hundreds+of+neurons+in+the+Aplysia+abdominal+ganglion+are+active+during+the+gill-withdrawal+reflex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hundreds of neurons in the Aplysia abdominal ganglion are active during the gill-withdrawal reflex.</a> J Neurosci. 9, 3681-3689 (1989).</li>
<li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dedicated+and+multifunctional+neural+circuits+generating+distinct+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors.</a> J Neurosci. 26, 10925-10933 (2006).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Ann Rev Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Grillner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+pattern+generation%3A+the+cellular+and+computational+logic+of+networks+in+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Biological pattern generation: the cellular and computational logic of networks in motion.</a> Neuron. 52, 751-766 (2006).</li>
<li>Yuste, R., MacLean, J. N., Smith, J., Lansner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cortex+as+a+central+pattern+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cortex as a central pattern generator.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 477-483 (2005).</li>
<li>Stein, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+stomatogastric+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of stomatogastric rhythms.</a> J Comp Physiol A. 195, 989-1009 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

צבען רגיש מתח הדמיה 8,9 של STG נוירונים בשילוב עם שיטות מסורתיות electrophysiology (הקלטות אלקטרודה תוך תאית ו) מאפשר הבנה משופרת של כמה קטן זה, עובד ידוע ומורכב עדיין המערכת העצבית. STG היא אב טיפוס של גנרטור דפוס מרכזי (CPG) רשתות נוירונים (זה כולל קצב השוער ובקיבה טחנת רשתות) 10, 11, וכך להבין טוב יותר את המאפיינים תפקודית מתהווה של STG גם יעזור להבין איך בכלל רשתות CPG ליצור רמה הרשת שלהם פונקציונליות. רשתות CPG לשחק תפקיד קריטי שליטה מוטורית 12 וגם יותר פונקציות קוגניטיביות 13, וכתוצאה מכך הבנה טובה יותר של תכונות מתהוות שלהם עשויה להיות השפעה גדולה בתחומים רבים של מדעי המוח.

<table><tbody><tr><td>MiCAM02</td><td>SciMedia</td><td></td><td>מערכת דימוי</td></tr><tr><td>BVAna v.10.08</td><td>SciMedia</td><td></td><td>תוכנה לניתוח נתונים עבור מערכת הדימוי MiCAM 02</td></tr><tr><td>HL-151</td><td>Moritex, Tokyo, Japan</td><td></td><td>מקור אור הלוגני בעל ריפל (ripple) נמוך במיוחד</td></tr><tr><td>BX51 WI</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>מיקרוסקופ זקוף לדימוי אפיפלורסצנציה</td></tr><tr><td>עדשת הדימוי 20x </td><td>Olympus Corporation</td><td>XLUMPLFL20XW/0.95</td><td>NA 0.95, WD 2.0mm</td></tr><tr><td>עדשת הדימוי 10x </td><td>Olympus Corporation</td><td>UMPLFL10XW</td><td>NA 0.30, WD 3.3mm</td></tr><tr><td>קוביות מסננים עם מסנן עירור 480-550 nm ומסנן פליטה 590nm </td><td>Olympus Corporation</td><td>MSWG2</td><td></td></tr><tr><td>שולחן אנטי-ויברציה</td><td>Scientifica Ltd</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>מניפולטור אלקטרודות PatchStar</td><td>Scientifica Ltd</td><td>PS-7000C</td><td>מניפולטור מיקרו-אלקטרודות</td></tr><tr><td>CED Power 1401</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>כרטיס רכישת נתונים</td></tr><tr><td>DL708E Oscilloscope</td><td>Yokogawa</td><td></td><td>מגבר תוך-תאי</td></tr><tr><td>מגבר דיפרנציאלי AC</td><td>University of Kaiserslautern, Germany</td><td></td><td>מגבר חוץ-תאי</td></tr><tr><td>P-97 Flaming &amp;#8211; Brown type electrode puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>מכשיר למשיכת אלקטרודות</td></tr><tr><td>Sigma Microcentrifuge 1-14</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>צנטריפוגה</td></tr><tr><td>Genex Pipettors Mline</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP7774</td><td>PIP7774</td></tr><tr><td>מיקרופיפטה מזכוכית עם פילמנט</td><td>Science Products</td><td>GB100TF 8P</td><td>זכוכית למיקרו&amp;#8211;אלקטרודות</td></tr><tr><td>MicroFil &amp;#8211; 34G</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>מחט Microfil</td></tr><tr><td>Spike 2 v6.10</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>תוכנת אלקטרופיזיולוגיה</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPQ</td><td>Cambridge BioScience</td><td>BT61014</td><td>צבע פלורסצנטי רגיש למתח</td></tr><tr><td>F-127 Pluronic Acid, DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td>ממס</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>רכיב לתמיסת מלח לסרטנים</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>רכיב לתמיסת מלח לסרטנים</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>רכיב לתמיסת מלח לסרטנים, תמיסת אלקטרוליט</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>רכיב לתמיסת מלח לסרטנים</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>רכיב לתמיסת מלח לסרטנים</td></tr><tr><td>Maleic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td>רכיב לתמיסת מלח לסרטנים</td></tr><tr><td>Elastosil RT-601</td><td>Wacker, Munich, Germany</td><td></td><td>ציפוי לכלי פטרי</td></tr></tbody></table>

דימות אופטי של נוירונים גנגליון סרטן stomatogastric עם מתח רגיש צבעים

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

מתח רגיש הדמיה צבען של נוירונים היא מתודולוגיה מפתח להבנת אופן רשתות נוירונים מאורגנים וכיצד פעילות סימולטנית של הנוירונים המשתתפים מוביל הופעתה של פונקציונליות אינטגרלי של הרשת. כאן אנו מציגים את המתודולוגיה של היישום של טכניקה זו כדי לייצר נוירונים דפוס מזוהה ב הגנגליון סרטן stomatogastric. אנו מדגימים את הטעינה של הנוירונים האלה עם הניאון מתח רגיש לצבוע Di-8-ANEPPQ ואנחנו מראים כיצד התמונה את הפעילות של הנוירונים טעון לצבוע באמצעות MiCAM02 מהירות גבוהה ברזולוציה גבוהה מצלמה CCD מערכת הדמיה. אנו מדגימים את ניתוח הנתונים הדמיה רשמה באמצעות תוכנת הדמיה BVAna הקשורים MiCAM02 מערכת ההדמיה. הדמיה סימולטני מתח רגיש לצבוע פעילות מפורט של נוירונים מרובים הגנגליון סרטן stomatogastric מיושם יחד עם טכניקות מסורתיות electrophysiology (הקלטות תאיים תאית) נפתח באופן קיצוני הזדמנויות חדשות להבנה של איך לעבוד מרכזי גנרטור דפוס רשתות עצביות.

כאן אנו מציגים את המתודולוגיה של מהיר הדמיה ברזולוציה גבוהה פלואורסצנטי מתח רגיש צבען של פעילות מפורט של נוירונים הגנגליון stomatogastric סרטן.

דימות אופטי של נוירונים גנגליון סרטן Stomatogastric עם מתח רגיש צבעים

דימות של נוירונים באמצעות צבע רגיש למתח הוא מתודולוגיה מרכזית להבנת האופן שבו רשתות נוירונליות מאורגנות וכיצד הפעילות הסימולטנית...

מטרתו של הניסוי הבא היא להשתמש בצבעים רגישים למתח כדי להקליט באופן אופטי שינויים בפוטנציאל הממברנה ואינטראקציות סינפטיות בין נוירונים במחוללי התבנית המרכזיים של הגנגליון הסומטי של סרטן ה-St Somatic asterisk. דבר זה מושג על ידי טעינת נוירונים מזוהים ב-DD eight וב-at PQ באמצעות הזרקה של ion retic בעזרת מיקרו-אלקטרודות חדות, ובמקביל הקלטה חוץ-תאית של פעילות עצבי מוטורים. כשלב שני, פלואורסצנציית הצבע הרגיש למתח מעוררת על ידי אור ירוק, המאפשר הדמיה של שינויי פלואורסצנציה התואמים לשינויים בפוטנציאל ממברנת התא. לאחר מכן, נתוני התמונה מנותחים על ידי בחירת אזור עניין בממברנת הנוירון והשוואת האות האופטי לפעילות החשמלית החוץ-תאית שהוקלטה, וזאת כדי לזהות פוטנציאלי פעולה ופוטנציאלים סינפטיים.בתוצאות הנוירונים בתמונה ניתן לראות כי הקלטה אופטית של נוירונים מחוללי תבניות המקיימים אינטראקציה סינפטית יכולה להוות השלמה לטכניקות הקלטה מסורתיות ולפתוח הזדמנויות חדשות להבנת האופן שבו פועלות רשתות נוירונים של מחוללי תבניות מרכזיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הקלטות חוץ-ותאיות, הוא שלאחר מילוי הצבע, ניתן להשיג הקלטות אופטיות של שינויים בפוטנציאל ממברנה ואינטראקציות סינפטיות ללא המגבלות הסטריות הכרוכות במיקום האלקטרודות וללא נזק נוסף לנוירונים במהלך הקלטות ארוכות טווח. שיטה זו יכולה לספק תובנות נוספות לגבי יצירת תבניות בגנגליון הגסטרי של קיבה של סרטנים.ניתן ליישם זאת גם במערכות אחרות, כגון התניידות ונשימה בחולייתנים. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, מכיוון שהזרקת ה-D ובחירתו וההכנות המקדימות הן מורכבות, וכן יש להגדיר את הפרמטרים לניתוח נתוני התמונה באופן הולם כדי לזהות שינויים בפוטנציאל הממברנה. התחילו את ההכנות בהכנת תמיסת הצבע הפלואורסצנטי בבקבוקון פלסטיק; ערבבו 5 mg של הצבע הפלואורסצנטי הרגיש למתח D eight ו-FPQ עם 1 mL של תמיסת F1 27 onic acid ב-DMSO.בשלב הבא, סבב במערך צנטריפוגה את הצבע המומס למשך 20 דקות במהירות של 12,000 סיבובים לדקה. על מנת להפריד חלקיקים גדולים יותר שעלולים לסתום את המיקרו-אלקטרודה לאחר הצנטריפוגה, המשתמש יתכונן לשאיבת 200 µL העליונים של הנוזל העלון (supernatant) ולהעברתם לבקבוק פלסטיק נפרד. עטוף את הבקבוק בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור.יש לאחסן את תמיסה D במקפיא בטמפרטורה של 20°C- ביום הניסוי. יש להפשיר את תמיסת הצבע על ידי הנחת המבחנה העטופה במים בטמפרטורה של 25°C למשך 10 עד 15 דקות. כהכנה להקלטות, התחילו בבידוד מערכת העצבים הגסטרית הסומטית של ה-STS של סרטן ובהסרת המעטפת מהגנגליון הגסטרי הסומטי.מרחו וזלין סביב מקטע של עצב הiventricular lateral או LVN כדי ליצור תא מבודד חשמלית. השתמשו בחימר פיסולי כדי להצמיד את צלחת הפטרי למספחת העבודה של מיקרוסקופ הדימיון. הניחו חוט אלקטרודה מפלדת אל חלד בתא הוזלין כדי לבצע הקלטה מאזור ה-LVN, והניחו אלקטרודת פלדת אל חלד נוספת באמבט כאלקטרודת ייחוס.כאשר תמיסה D מופשרת, שאבו כמות מספקת של תמיסה D כדי למלא כשני שלישים ממחט microfill. הזריקו את תמיסה D ממחט ה-microfill לקצה של מיקרו-אלקטרודה מזכוכית. כסו את האלקטרודה המלאה בצבע בקופסה והמתינו 15 דקות.לאחר מכן, מלאו שוב את המיקרו-אלקטרודה בתמיסת פוטסיום כלוריד בריכוז של 3 molar. הניחו את המיקרו-אלקטרודה בחזרה בתוך קופסת אחסון כהה לאלקטרודות למשך 10 עד 20 דקות, כדי לאפשר לפעולה קפילרית למשוך את התמיסה אל קצהה הדק של האלקטרודה. לאחר 10 עד 20 דקות, הניחו את המיקרו-אלקטרודה במחזיק אלקטרודות וחברו אותה לראש המגבר התוך-תאי.המגבר התוך-תאי מחובר לכרטיס רכישת הנתונים המספק אות פולס להזרקת פולסי זרם אל המיקרו-אלקטרודה. לאחר מכן, כוון את המיקרו-אלקטרודה לזווית אלכסונית ומקם את קצהה מעל הגנגליון הגסטרי הסומטי. הורד את עדשת המיקרוסקופ עד שקצה האלקטרודה יהיה בפוקוס.לאחר מכן הורד את העדשה, תוך הקפדה לעצור לפני המגע עם המיקרו-אלקטרודה. לאחר מכן הורד את המיקרו-אלקטרודה עד להופעתה שנית. תוך התמקדות בעדשה ומעקב אחר ההתקדמות באוסצילוסקופ, נקב בעדינות את ממברנת הנוירון שנבחר מהגנגליים הגסטריים הסומטיים.בשלב זה, השוו בין פוטנציאלי הפעולה שנרשמו באופן תוך-תאי ובאופן חוץ-תאי. כדי לזהות את הנוירון שנפגז, התחילו בהזרקת צבע על ידי העברת המגבר התוך-תאי למצב הזרקת זרם והזרקת מדרגות זרם חיובי של 10 nano לתוך המיקרו-אלקטרודה. מדרגות הזרם צריכות להימשך שנייה אחת, כשהן מופרדות במרווחים של שנייה אחת ללא זרם.המשיכו בהזרקה הנוכחית למשך 30 דקות. לאחר 10 דקות של הזרקת צבע, השתמשו במערכת הדימוי MYCA zero two כדי לבדוק את התפשטות הצבע בתוך הנוירון. חזרו על פעולה זו ובדקו שוב לאחר 30 דקות.אם מילוי הצבע הצליח, הכתם הצבוע סביב המיקרו-אלקטרודה אמור לגדול בין התמונות שצולמו בדקה ה-10 ובדקה ה-30. הוצא את האלקטרודה מהנוירון ואפשר לנוירון להירגע למשך 20 עד 30 דקות לפחות כדי לאפשר לצבע להתפשט עוד יותר בתא. במהלך זמן זה, ניתן להזריק צבע לנוירון נוסף.עברו לעדשה עם יעילות העברה גבוהה של 20x במערכת הדימות MYAM zero two. מקמו מחדש את שולחן העבודה של המיקרוסקופ לפי הצורך, והתמקדו בנוירון בשדה D. הזינו את נתוני ההקלטה החוץ-תאיים למערכת הדימות דרך ערוץ הכניסה האנלוגי שלה.כבה את תאורת החדר ואת כל מקורות האור הנותרים. בנוסף, סגור מסך שחור סביב מתקן ההקלטה כדי למנוע חשיפה לאור ממקורות חיצוניים. הגדר את מערכת ההדמיה לרזולוציית הפיקסלים ולזמן ההדמיה המתאימים המוצגים בטבלה.אם צביעת הנוירונים אינה חזקה מספיק, השתמש בהגדרת ה-H bin. הגדר את רמת התאורה של המיקרוסקופ לנמוכה ככל האפשר כדי למנוע פוטו-מודולציה ונזק פוטו-כימי לנוירונים המוקלטים. הגדר את משך מפגשי הדימוי לבין 4 ל-16 שניות.לאחר מכן, רשמו את הפעילות הספונטנית של נוירוני ה-DY לאורך מספר מפגשי דימוי. כדי להתחיל בניתוח התגובות האופטיות באמצעות תוכנת הדימוי BV A NA, בחרו אזור מעגלי מתאים עבור כל נוירון שהוקלט במידה ונדרש החלקה זמנית (temporal smoothing) של הנתונים. לדוגמה, אם ה-D מייצר כמות פלואורסצנציה נמוכה יחסית, השתמשו בתוכנה כדי לבצע החלקה זמנית של שלושה עד חמישה יחידות זמן.שני הנוירונים המוזרקים בצבע בחלק השמאלי העליון של איור זה זוהו כנוירון PD ונוירון LP על בסיס רישומים תוך-תאיים. עקומות המתח מימינם מראות את התגובות האופטיות הספונטניות של כל נוירון. הרישום החוץ-תאי של ה-LVN מוצג בתחתית האיור.נוירוני ה-LP וה-PD הם חלק ממחולל התבנית המרכזי (CPG) של הפילורוס בגנגליון הגסטרי הסומטי של סרטן, והם מעכבים זה את זה באופן הדדי. ניתן להתאים היטב את ההקלטות האופטיות שלהם להקלטות החוץ-תאיות של ה-LVN. התמונה המוכנסת למטה מציגה חפיפה של מספר סריקות של פוטנציאלי פעולה של ה-LP ואת הממוצע שלהם, מה שמדגים את ההתאמה בין הפעילויות שהוקלטו באופן אופטי ובאופן חשמלי.ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן לבצע אותה בשעה וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כמו צביעה אימונוהיסטוכימית כדי לענות על שאלות נוספות, כגון איזה סוג של סינפסה היה מעורב בעירור השינויים שנצפו בפוטנציאל הממברנה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ההקלטה האופטית של מספר נוירונים מזוהים ובעלי אינטראקציה בגרגני הקיבה (gastric ganglia).

optical-imaging-neurons-crab-stomatogastric-ganglion-with-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול זה מדגים כיצד מתח רגיש צבעים לאפשר הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית של רשתות עצביות שלמים כגון plexuses של מערכת חזירי הים העצבים enteric, עם רזולוציה מתכווננת אשר נע בין חד תאים למעגל רב ganglionic.

הקלטה אופטית של הפעילות החשמלית גינאה חזיר רשתות enteric באמצעות מתח רגיש צבעים

סרטון זה מדגים הליך לצפייה בשינויים בפעילות העצבית בפרוסת מוח המוכתמת בצבע רגיש למתח. הצבע משקף שינויים בפוטנציאל הממברנה של תא העצב על ידי שינוי עוצמת הפלואורסצנטיות שלו. באמצעות יישום גירויים חשמליים וטכניקות הדמיה מתקדמות, תהליך זה מאפשר מעקב חזותי אחר שינויים בזמן אמת בפוטנציאל הממברנה העצבית בהתבסס על פלואורסצנטיות VSD.

הקלטה אופטית של פעילות עצבית בפרוסות מוח מוכתמות בצבע רגיש למתח

מקור: Shannonhouse, J.,  et al. In vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גב שלמים. J. Vis. Exp. (2023). הסרטון מדגים טכניקת הדמיית סידן in vivo לניטור פעילות עצבית בגרעיני השורש הגבי (DRG) של עכבר טרנסגני. נוירונים DRG מבטאים אינדיקטור סידן המגביר את עוצמת הקרינה בעת הקישור לסידן. גירויים מכניים או תרמיים המופעלים על כפה אחורית מייצרים פוטנציאל פעולה המתפשט ל-DRG, גורם לזרימת סידן בתאי העצב וכתוצאה מכך פליטת פלואורסצנטיות מוגברת.

הדמיית סידן in vivo של הרכבים עצביים בגרעיני השורש הגבי השלמים של עכבר

כאן אנו מתארים את דיסקציה של חוט העצב הבטני של הסרטנים. אנו גם מדגימים טכניקה אלקטרופיזיולוגית לתיעוד תנועה פיקטיבית מנוירונים מוטוריים של שחייה.

מערכת Swimmeret של סרטן הנהרות: מדריך מעשי לDissection של חוט העצב ותאי הקלטות של התבנית מוטורית

מערכת העצבים המעי (ENS) היא רשת של נוירונים וגליה הממוקמת בדופן המעי ושולטת ברפלקסים של המעי. פרוטוקול זה מתאר שיטות לרישום הפעילות של נוירונים מעיים וגליה בתכשירים חיים של ENS באמצעות הדמיית Ca2+.

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

כאן, אנו מתארים שיטה לטעינת צבע סידן רגיש דרך גדם העצב הצפרדע לתוך קצות העצבים. כמו כן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת וניתוח של טרמינטים סידן מהיר בקצות העצבים ההיקפיים.

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

פרוטוקול זה מציג שיטה להדמיית פעילות אוכלוסיה עצבית עם רזולוציה של תא יחיד במינים לא מהונדסים של חוליות באמצעות צבעים רגישים למתח ספיגה ומערך פוטודיודות. גישה זו מאפשרת זרימת עבודה מהירה, שבה ניתן לבצע הדמיה וניתוח במהלך יום אחד.

הדמיה אופטית מבוססת פוטודיודה להקלטת דינמיקה ברשת עם רזולוציית נוירון יחיד בבלתי חוליות לא מהונדסים

כאן אנו מציגים כיצד לחשוף את גנגליון geniculate של עכבר מעבדה חי, מרדים וכיצד להשתמש הדמיית סידן כדי למדוד את התגובות של הרכבים של נוירונים אלה לטעום גירויים, המאפשר ניסויים מרובים עם ממריצים שונים. זה מאפשר השוואות מעמיקות של אילו נוירונים מגיבים לאו תיוהמים.

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

פרוטוקול זה מתאר את החשיפה הכירורגית של גנגליון השורש הגבי (DRG) ואחריו GCaMP3 (אינדיקטור Ca2+ מקודד גנטית; חלבון פלואורסצנטי ירוק-קלמודולין-M13 חלבון 3) Ca2+ הדמיה של הרכבים עצביים באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3 תוך הפעלת מגוון גירויים על הכף האחורית ipsilateral.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECI) מאפשרים ניתוח חזק ברמת האוכלוסייה של איתות נוירונים חושי. כאן, פיתחנו גישה חדשנית המאפשרת הדמיית GECI in vivo של פעילות גרעיני גרעינים של חולדות.

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

פרוטוקול זה מתאר הדמיית סידן in vivo GCaMP של נוירונים שלמים של גנגליון טריגמינלי (TG). תיאור זה כולל ניתוח חשיפה ל-TG, הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית in vivo של נוירונים TG, יישום גירויים סומטיים במהלך הדמיה מיקרוסקופית של נוירונים TG וניתוח נתוני הדמיית סידן in vivo GCaMP.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים

למד דימות אופטי של נוירונים גנגליון סרטן Stomatogastric עם צבעים רגישי מתח. טכניקה זו מאפשרת הקלטת שינויי פוטנציאל ממברנה ואינטראקציות סינפטיות ללא נזק לתאים.

דימות אופטי של נוירונים גנגליון סרטן Stomatogastric עם מתח רגיש צבעים

גלה סרטונים נוספים