Name: FISH לאבחון גנטי טרום השרשה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: למד את טכניקת FISH לאבחון גנטי טרום השרשה בעוברי אדם. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של הפרעות כרומוזומליות וטרנסלוקציות בתאים בודדים לפני השתלת העובר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Lysing ואת הפצת גרעין מ Blastomere ביופסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמוגה Cell חיץ של תאים מתפשט (0.2% Tween20 ב 0.01 M HCl, pH 2.0) יש להכין 24 שעות מראש ומאוחסנים ב -20 ° C. הכן 100 מ"ל ו 20 מ"ל לסנן לתוך מיכל 30 מ"ל אוניברסלי סטרילי באמצעות מזרק סטרילי 20 מ"ל ולסנן מזרק. לוותר על 1 aliquots מ"ל לתוך צינורות 10-15 1.7 מ"ל microcentrifuge סטרילית, סגור את התווית צינורות לפני ההקפאה. מומלץ יש שתי קבוצות שונות לשימוש, האצווה חדשים האצווה הקודם, אשר נבדק יכול לשמש אם קבוצה חדשה אינה משביעת רצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו את מאגר תמוגה בטמפרטורת החדר 30 דקות לפני ההליך ביופסיה. למטרות מעשיות את טמפרטורת העבודה יהיה בין בטמפרטורת החדר הטמפרטורה יד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון עיגול קטן (בקוטר של כ 5 מ"מ) בחלק התחתון של שקופית אמין מצופה (למשל Genetix) באמצעות עט היהלומים מראש תווית את השקופית עם מספר התיק, מספר שקופיות ייחודית, ותאריך ביופסיה. השתמש שקופית נפרדת עבור כל blastomere לפי סדר מספרי, ועל תווית עם מספר העובר. שקופיות צריך להיות מסומן בעיפרון קשה כגון 4H, וגם "מחק" עם כפפת לטקס כדי להסיר כל אבק גרפיט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום נפח קטן של חיץ תמוגה בתוך המעגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את blastomere ביופסיה לתוך המאגר תמוגה. אם יש צורך להוסיף למאגר תמוגה במעגל עד התא מתחיל lyse, התא צריך lyse לחלוטין הציטופלסמה לפזר לפני מתייבש חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הגרעין כדי לוודא שהוא נשאר בתוך המעגל הוא לא איבד, אם התא אין גרעין או יש גרעינים רבים, ביופסיה תא אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את השקופית אוויר יבש בטמפרטורת החדר. </li></ol> 2. בשנת הכלאה באתרו של גרעין יחיד Blastomere <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרת אתנול (70, 90 ו - 100%) מורכב במים מזוקקים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל והגדר את גוש חם (למשל Hybaid Omnislide או Vysis Hybrite) ל 75 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו בדיקות, מערבולת, ו צנטריפוגות. ריאגנטים צריך להיות עדים ומאומת יהיה נכון לפני ממציאה את התערובת בדיקה. פיפטה כרכים כפי שצוינו על ידי היצרן כדי לפצות את התערובת בדיקה צינור 0.65 מ"ל סטרילי microcentrifuge ו מערבולת צנטריפוגות לפני השימוש. הנפח הכולל של התערובת בדיקה צריך להיות מספיק כדי לאפשר 2 μL לכל גרעין להיבדק מעוגלות עד μL 10 הקרוב כדי לאפשר מרווח בטיחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לשטוף את השקופיות בצנצנות coplin באמצעות פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) (pH 7.0: 0.14 M NaCl, KCl 3 מ"מ, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 מ"מ KH 2 PO 4) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות פעמיים מים מזוקקים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את השקופיות עם הסדרה אתנול (70, 90, ו - 100%) עבור כל 2 דקות בטמפרטורת החדר אוויר יבש. ודא שקופיות שקועים לחלוטין אם בכלל אבק גרפיט צף אל פני השטח, לספוג עם טישו נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את המיקום של גרעין בתוך מעגל על ​​ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים עם אתנול 100% עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 2 μL של תערובת בדיקה, ולכסות עם 9 x 9 מ"מ coverslip (1 / 4 של 18 x 18 מ"מ coverslip מס '1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצוות של coverslip עם גומי מלט (למשל מסטיק פרה, פרה הגהה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Codenature את השקופיות על גוש חם 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן להכליא את השקופיות לילה (16-20 שעות) בתא humidified על 37 ° C. תערובות בדיקה מורכב כולו בדיקות centromere (כלומר לסקס צמודות מקרים) ייתן תוצאה משביעת רצון לאחר 60 דקות של הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אמבט מים עם צנצנות coplin מספיק חום כדי 71 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ציטראט 0.4x מלוחים סטנדרטי (SSC) פתרון לשטוף מחמירים (pH 7.0 בשעה 71 ° C, 0.06 M NaCl, 6 מ"מ C 6 H 5 O 7 Na 3 0.2 H 2 O) חום המים באמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 50 מ"ל של לשטוף מחמירים לכל coplin צנצנת נדרש לבדוק כי הטמפרטורה היא 71 מעלות צלזיוס מיד לפני השימוש באמצעות מדחום נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את המלט גומי משקופית כל לשטוף את coverslip באמצעות% 4x SSC/0.05 Tween20 (pH 7.0) בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות בכביסה 0.4x SSC מחמירים על 71 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שטפי לא יותר מ 6 שקופיות צנצנת coplin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות Tween20 SSC/0.05% 4x בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התערובת בדיקה כוללת בדיקה שכותרתו בעקיפין (ים), לנקז את השקופיות של נוזל עודף וליישם 20 μL של נוגדן מצומדות fluorescently תחת מרובע 20 מ"מ x 20 של Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתא humidified על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Parafilm ולשטוף פעם Tween20 SSC/0.05% 4x בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עבור 2 דקות ב PBSלא בטמפרטורת החדר ומסננים את השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 6 μL של DAPI / Vectashield (160 ננוגרם של 4 ',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride ב 1 מ"ל של מדיום Vectashield הרכבה, וקטור Laboratories) ל 22 מ"מ x 22 לא. 0 coverslip ו להפוך את השקופית על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם וסוגרים את הקצוות של coverslip עם מסמר לכה ברורה. </li></ol> 3. ניתוח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאובזר כראוי עם מסננים מתאימים עבור בדיקות משומשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון אותות ידי להדמיה ישירה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, רווק הלהקה עוברים מסננים לכל fluorochrome ב assay. כל גרעין צריך להיות הבקיע שני האנליסטים. קו מנחה כללי צריך להוביל מניה של אות אחת שבה שני אותות צפופים הם פחות מאחוז אחד מושלם (האות רוחב) בנפרד, עם זאת, פסק הדין מבוסס על ניסיון צריך להיות למימוש לפרש את האותות משתנה, בעוצמה גודל ההפרדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנות הדמיה (למשל איזיס, MetaSystems, Altlussheim, גרמניה; CytoVision, Genetix) כדי ללכוד תמונה של גרעין לאישור האבחנה החזותית ועל התמונה בארכיון במסגרת תוכנית אבטחת האיכות במעבדה. </li></ol> 4. נציג תוצאות: Metaphase גרעינים שלבי הביניים של לימפוציטים בתרבית דם היקפיים צריכים להיבדק כדי לוודא שנבחרו בדיקות ספציפיות הכרומוזומים טרנסלוקציה, אינפורמטיבי עבור breakpoints (בדיקות subtelomere צריך להכליא רק את קטעי translocated ואת החללית centromere (ים) ממוקדת פלח (s)) ואת אותות גרעינים שלבי הביניים צריך להיות בהיר בדידים. ניקוד מספר אותות עבור כל בדיקה גרעינים 100 שלבי הביניים של כל אחד מבני הזוג, מומלץ להעריך את היעילות של assay. במקרה זה 2 אותות דורגו ב -95% -99% של גרעיני עבור כל בדיקה. איור 1 מציג metaphase ו גרעין שלבי הביניים מתוך כהכנה טרנסלוקציה הדדית בין זרועות קצרות של כרומוזומים 5 ו - 9. אותות גרעינים שלבי הביניים מתוך בלסטומרים העובר צריך להיות בהיר בדידה הבקיע באמצעות נפרדים לעבור הלהקה מסננים את הצבעים. איור 2 מראה גרעין blastomere עם דפוס אות רגיל (2 עותקים לכל לוקוסים נבדק) עולה בקנה אחד עם כרומוזום משלים רגיל או מאוזן על כרומוזום 5 ו -9, ו - גרעין עם דפוס אות חריג בקנה אחד עם מוצר מאוזן של טרנסלוקציה כי יש monosomy (עותק אחד) עבור מגזר translocated של כרומוזום 5 ו טריזומיה (3 עותקים) עבור מגזר translocated של כרומוזום 9. <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 התפשטות metaphase ו גרעין שלבי הביניים שהוכן בתרבית לימפוציטים דם היקפיים מן הספק של טרנסלוקציה הדדית בין זרועות קצרות של כרומוזומים 9 ו - 5 עם נקודות עצירה ב 5p14.3 ו 9p24.1:. 46, XY, t (5 : 9) (p14.3;. p24.1) איש לא (5, 9) (5ptel48-, 9ptel30 +; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +). בדיקות FISH נבחרו בשני מגזרים translocated (5p14.3 → 5pter, אדום Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, ירוק Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) והמגזר ממוקדת של כרומוזום 9 (9p24.1 → 9qter, כחול אבוט CEP 9 אלפא לווין SpectrumAqua). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. אותות גרעינים blastomere שלבי הביניים מיום-3 עוברי שנתפסו באמצעות מסנן שונה עבור כל fluorochrome ו התמזגו ויצרו תמונה מורכבת. (א) שני אותות בדיקה עבור כל המצביעים שני עותקים של מוקד אחד, אשר עולה בקנה אחד עם משלים רגיל או מאוזן של כרומוזומים טרנסלוקציה. (ב) אות אחת אדום, שלושה אותות ירוק שני אותות כחול המעיד על עותק אחד של המגזר translocated של כרומוזום 5, שלושה עותקים של המגזר translocated של כרומוזום 9 ושני עותקים של המגזר ממוקדת של כרומוזום 9, אשר עולה בקנה אחד עם סמוכים -1 הפרדה של טרנסלוקציה וכתוצאה מכך מוצר מאוזן עם monosomy עבור 5p14.3 → 5pter ו טריזומיה עבור 9p24.1 → 9pter.

<ol><li>Scriven, P. N., Handyside, A. H., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+translocations%3A+segregation+modes+and+strategies+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Chromosome translocations: segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis.</a> Prenat. Diagn. 18, 1437-1449 (1998).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for chromosome rearrangements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 194-201 (2009).</li>
<li>Harper, J. C., Coonen, E., Ramaekers, F. C. S., Delhanty, J. D. A., Handyside, A. H., Winston, R. M. L., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+sex+of+human+preimplantation+embryos+in+two+hours+using+an+improved+spreading+method+and+fluorescent+in+situ+hybridisation+using+directly+labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of the sex of human preimplantation embryos in two hours using an improved spreading method and fluorescent in situ hybridisation using directly labelled probes.</a> Hum. Reprod. 9, 721-724 (1994).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for sex-linked diseases and sex-selection for non-medical reasons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 230-235 (2009).</li>
<li>Munné, S., Lee, A., Rosenwaks, Z., Grifo, J., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+major+chromosome+aneuploidies+in+human+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos.</a> Hum. Reprod. 8, 2185-2192 (1993).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for infertility (preimplantation genetic screening). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 203-229 (2009).</li>
<li>Scriven, P. N., Bossuyt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy%3A+theoretical+models+for+preimplantation+genetic+testing+of+a+single+nucleus+using+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.+Hum+Reprod%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy: theoretical models for preimplantation genetic testing of a single nucleus using the fluorescence in situ hybridization technique. Hum Reprod.</a> Cytogenetics. 5, 394-400 (2010).</li>
<li>Coonen, E., Dumoulin, J. C., Ramaekers, F. C., Hopman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+preparation+of+preimplantation+embryo+interphase+nuclei+for+analysis+by+fluorescence+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Optimal preparation of preimplantation embryo interphase nuclei for analysis by fluorescence in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 9, 533-537 (1994).</li>
<li>Dozortsev, D. I., McGinnis, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fixation+technique+for+fluorescence+in+situ+hybridization+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">An improved fixation technique for fluorescence in situ hybridization for preimplantation genetic diagnosis.</a> Fertil. Steril. 76, 186-188 (2001).</li>
<li>Hsu, L. Y., Benn, P. A., Tannenbaum, H. L., Perlis, T., Carlson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+polymorphisms+of+1%2C+9%2C+16%2C+and+Y+in+4+major+ethnic+groups%3A+a+large+prenatal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal polymorphisms of 1, 9, 16, and Y in 4 major ethnic groups: a large prenatal study.</a> Am. J. Med. Genet. 26, 95-101 (1987).</li>
<li>Shim, S. H., Pan, A., Huang, X. L., Tonk, V. S., Varma, S. K., Milunsky, J. M., Wyandt, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+variants+with+D15Z1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Genet.+Technol%22%5BJournal%5D)">FISH variants with D15Z1.</a> J. Assoc. Genet. Technol. 29, 146-151 (2003).</li>
<li>Knight, S. J., Flint, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfect+endings%3A+a+review+of+subtelomeric+probes+and+their+use+in+clinical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis.</a> J. Med. Genet. 37, 401-409 (2000).</li>
<li>Thornhill, A. R., de Die-Smulders, C. E., Geraedts, J. P., Harper, J. C., Harton, G. L., Lavery, S. A., Moutou, C., Robinson, M. D., Schmutzler, A. G., Scriven, P. N., Sermon, K. D., Wilton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium+%28PGS%29+ESHRE+PGD+Consortium+%27Best+practice+guidelines+for+clinical+preimplantation+genetic+diagnosis+%28PGD%29+and+preimplantation+genetic+screening+%28PGS%29%27%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium (PGS) ESHRE PGD Consortium 'Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening (PGS)'.</a> Hum. Reprod. 20, 35-48 (2005).</li>
<li>Munné, S., Wells, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+requirements+for+preimplantation+genetic+diagnosis+to+improve+assisted+reproduction+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes.</a> Fertil. Steril. 94, 408-430 (2010).</li>
<li>Wilton, L., Williamson, R., McBain, J., Edgar, D., Voullaire, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+healthy+infant+after+preimplantation+confirmation+of+euploidy+by+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Birth of a healthy infant after preimplantation confirmation of euploidy by comparative genomic hybridization.</a> N. Engl. J. Med. 345, 1537-1541 (2001).</li>
<li>Wells, D., Alfarawati, S., Fragouli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+comprehensive+chromosomal+screening+for+embryo+assessment%3A+microarrays+and+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Use of comprehensive chromosomal screening for embryo assessment: microarrays and CGH.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 703-710 (2008).</li>
<li>Handyside, A. H., Harton, G. L., Mariani, B., Thornhill, A. R., Affara, N., Shaw, M. A., Griffin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyomapping%2C+a+universal+method+for+genome+wide+analysis+of+genetic+disease+based+on+mapping+crossovers+between+parental+haplotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Karyomapping, a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes.</a> J. Med. Genet. 47, 651-658 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היישום של הקרינה הכלאה באתרו (FISH) לתא עובר יחיד (blastomere) מציב אתגרים מיוחדים הן המעשיים והן הפרשנות של תבנית האות. התא ביופסיה צריך להתפשט בתוך השטח שהוגדרו מראש על השקופית כדי להקל FISH לוקליזציה הבאה שלה; זהירות קיצוניים צריך לנקוט כדי להבטיח התא lysed, כי הציטופלסמה כבר התפזרו, וכי גרעין גלוי שלם;, וכפי האבחון תלוי בתוצאות מתא בודד זה, הבקיע מחמירים פרשנות ההנחיות צריך להיות מיושם. עם זאת, בידיים מנוסות, דגים היא טכניקה חזקה לאבחון גנטי טרום השרשה (PGD) בפרקטיקה הקלינית. העיקרון של PGD על ידי FISH היא יעד ספציפי DNA בדיקות שכותרתו עם fluorochromes או haptens שונים שניתן להשתמש בהם כדי לזהות את המספר עותק של לוקוסים ספציפי, ובכך לזהות חוסר איזון כרומוזום קשור הפרדה meiotic של rearrangements כרומוזום (1), כולל Robertsonian טרנסלוקציות, טרנסלוקציות הדדיות, תנוחות הפוכות, ו rearrangements מורכב (2). דגים יכולים לשמש גם כדי לבחור בעוברים נקבה במשפחות עם מחלה X-linked, אשר לא קיימת בדיקה מוטציה ספציפית (3, 4). עוד שנוי במחלוקת, דגים שימש גם למסך עבור aneuploidy כרומוזום סדיר על מנת לנסות לשפר את היעילות של הרבייה סייעה (5, 6), עם זאת, ערך מנבא של מבחן זה באמצעות FSIH צפוי להיות נמוך בלתי מתקבל על הדעת אצל רוב האנשים של ידיים זה לא מומלץ לשימוש קליני שגרתי (7). מאמר זה מתמקד בהיבטים הטכניים ואת המגבלות של FISH להחיל אבחנה תא בודד קליניים. שיטות להפצת ותיקון בלסטומרים יחיד כוללים מתנול / חומצה אצטית (5, 8), Tween / HCl (9), וכן שילוב של Tween / HCl, מתנול / חומצה אצטית (10). וריאציות כוללות טיפול hypotonic של תאים לפני הפצת ו / או עכלן וטיפול paraformaldehyde לאחר קיבוע. השיטה צריכה להיות מאומת כראוי עבור במעבדה (14). השיטה Tween / HCl מתואר בפירוט במאמר זה. השיטה Tween / HCl היא פשוטה מבחינה טכנית לשעתקו מאוד במעבדות שונות. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להכין גרעינים יחיד לאבחון FISH להגדרה סקס rearrangements כרומוזום עם דיוק האבחון המקובל (7). תערובות Probe ניתן לשלב שכותרתו ישירות שכותרתו בעקיפין בדיקות, ועל בדיקות של יצרנים שונים. בדיקות עבור אזורים ידוע כרומוזום צורות (11, 12), או אלה ידועים צולבות להכליא באופן משמעותי עם כרומוזומים אחרים (13) יש להימנע, אם כי ניתן להשתמש בו אם הוכח להיות ספציפיים מתאים PGD על ידי בדיקה מוקדמת על שני בני הזוג הרבייה . Fluorochromes זמין / haptens ואסטרטגיות בדיקות להפלות כוללים: טקסס אדום (TR), isothiocyanate והעמסת (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, בדיקות biotinylated מזוהה עם TR-avidin, FITC-avidin, או סי-5 streptavidin (דמיינו באמצעות מסנן FarRed), שילוב של בדיקות אדום וירוק כדי לייצר אות צהוב, סיבוב שני של הכלאה וצבע third שנוצר על ידי לכידת רציפים של SpectrumOrange באמצעות TexasRed ומסנן SpectrumGold). מערכת בדיקה המכיל שלושה בדיקות, ספציפית עבור האזורים centromere של הכרומוזומים X ו-Y ואחד autosome, מומלץ קביעת הזוויג (14), בדיקה אוטוזומלית משמש להקים ploidy ובכך להבדיל בין טריזומיה X (2n, 47 , XXX) ו triploidy (3N, 69, XXX), ובין tetrasomy X (48, XXXX) ו tetraploidy (4n, 92, XXXX). בדיקה טיפוסי להגדיר להחיל הגדרה זו תמהיל AneuVysion אבוט המכיל אלפא לווין X, Y, ו - 18 וקבוצה זו בדיקה הוכח פולימורפיזם יש שיעור נמוך מאוד, ולכן טיפול טרום לעבוד למעלה השותפים הרבייה לא נדרש (14). תמהיל בדיקה עבור סידור מסוים צריך: באופן אידיאלי לכלול בדיקות לפחות מספיק כדי לזהות את כל המוצרים הצפויה של ארגון מחדש עם חוסר האיזון כרומוזום. אם זה לא אפשרי, בדיקה מתערבב בו את המוצרים מאוזן מבלי שיבחינו כבר העריכו להיות בלתי קיימא הריון מוכרות יש סבירות נמוכה מאוד שכיחות עשוי להיות מקובל (14). להיבדק על metaphases לימפוציטים בתרבית משני השותפים הרבייה. לפחות עשרה מתפשט metaphase יש לבחון על סגוליות הבדיקה, פולימורפיזמים ו צולבות הכלאה, ועבור המוביל התארגנות כרומוזום, על מנת להבטיח כי בדיקות להכליא כצפוי על פלחים שונים של התארגנות. בנוסף, לפחות 100 גרעינים שלבי הביניים של ההכנות האלה צריך להיות הבקיע להעריך סגוליות האות, בהירות, ו discreteness (14). קוםrcial PGS ערכות בדיקה זמינים (למשל אבוט MultiVysion PB או PGT), מיקוד הכרומוזומים נמצא לרוב להיות aneuploid במוצרים ההתעברות, ו הכולל בדיקה אחת לכל כרומוזום ממוקדות. בדרך כלל הגרעין עשוי להיות הכלאה שנייה עם בדיקות נוספות עבור כרומוזומים מתן assay עבור 13 כרומוזומים, 15, 16, 18, 21, 22, ו - XY (14). ערך החיזוי של הבדיקה באמצעות הפצת הטכניקה FISH המתואר כאן צפוי להיות נמוך בלתי מתקבל על הדעת בידיים של רוב האנשים וזה לא מומלץ לשימוש קליני שגרתי (7, 15). טכניקות כגון הכלאה גנומית השוואתי (CGH) להחיל תאים בודדים מסוגלים לבדוק את מספר עותק של כל כרומוזום (ווילטון et al. 2001), ושימוש פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNP) מערכים ניתוח כמותי (וולס ואח&#39; . 2008) או genotyping &quot;karyomapping&quot; (Handyside et al. 2009) מבטיחות טכניקות חלופיות כדי לזהות aneuploidy כרומוזום. עם זאת, מגבלת הרזולוציה והדיוק של חוסר איזון קטע להישאר ברור וסביר להניח כי דגים תמשיך להיות הטכניקה של בחירה עבור rearrangements כרומוזום מקטעים קטנים מעורבים.

<table><tbody><tr><td>חומצה הידרוכלורית, 2.5L</td><td>VWR international</td><td>101254H</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד, 5 ק"ג</td><td>VWR international</td><td>443827W</td><td></td></tr><tr><td>פוטסיום כלוריד, 250 גרם</td><td>VWR international</td><td>26764.232</td><td></td></tr><tr><td>די-נתרשן מימן אורתופוספטי, ללא מים, 500 גרם</td><td>VWR international</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>פוטסיום דיהידרוגן אורתופוספאט, 500 גרם</td><td>VWR international</td><td>10203 4B</td><td></td></tr><tr><td>גרגרי נתרן הידרוקסיד, 500 גרם</td><td>VWR international</td><td>28245.265</td><td></td></tr><tr><td>Tween20, 500 מ"ל</td><td>VWR international</td><td>663684B</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, 2.5L</td><td>VWR international</td><td>8.18760.2500</td><td>מסPaid מכס</td></tr><tr><td>טרי-נתרן ציטראט, 5 ק"ג</td><td>VWR international</td><td>27833.363</td><td></td></tr><tr><td>גומי בקר, 250 מ"ל</td><td>Cow Proofings Ltd.</td><td>אינו זמין יותר</td><td>ניתן עדיין למצוא מלאים ישנים בחנויות לאמנות</td></tr><tr><td>DAPI/Antifade ES, 0.125&amp;mu;ג'/מ"ל, 500ul</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>DES500L</td><td>150&amp;#x03BC;בקבוקון לשחזור&amp;rsquo;מסופק עם כל גשושית Cytocell TEL</td></tr><tr><td>לק לציפורניים, 12 מ"ל</td><td>מגפיים</td><td>10088316001</td><td></td></tr><tr><td>שקפים מצופים באמין, 25</td><td>Genetix</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 0.1 מ"ל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, 10 מ"ל</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas-Red-avidin, ‏0.001 מ"ל</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>FITC-avidin, 0.001 מ"ל</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 Streptavidin, 0.001mL</td><td>GE Healthcare</td><td>PA45001</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות מיקרוצנטריפוגה, 1.75 מ"ל, קופסה של 500</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות מיקרוצנטריפוגה, 0.6 מ"ל, מאre של 1000</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-060-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>מכלי אחסון אוניברסליים בנפח 30 מ"ל, מאre של 400</td><td>סטרילין</td><td>128B</td><td>זמין מרשת האספקה של ה-NHS, מספר קטלוג KCP053</td></tr><tr><td>בלוק חימום</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבער ספיריט, תושבת למבער ספיריט, פתיל למבער ספיריט</td><td>VWR international</td><td>451-0107 451-3112 451-3111</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות זכוכית עם פקק</td><td>Fisher Scientific</td><td>PMK-300-052R</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאוסקופי</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טישיו, 100 קופסאות</td><td>שרשרת האספקה של ה-NHS</td><td>MJT058</td><td></td></tr><tr><td>מגשי תרבית ממתכת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגשי מלמין מפלסטיק</td><td>VWR international</td><td>682-009</td><td></td></tr><tr><td>תנור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיה של פיפטה לפיה</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>HAE3700</td><td></td></tr><tr><td>צינוריות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק, 0.2&amp;mu;גודל נקבים m, קוטר 25 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>FDM-340-010U</td><td></td></tr><tr><td>עט יהלום</td><td>VWR international</td><td>818-0021</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חימום לשקפים</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBOSBB</td><td></td></tr><tr><td>תא היברידיזציה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליל רקמה</td><td>שרשרת האספקה של ה-NHS</td><td>MJT004</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת שייפרדקר (Schieferdecker)</td><td>VWR international</td><td>631-9313</td><td></td></tr><tr><td>צנצנת קופלין</td><td>VWR international</td><td>631-9331</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה עדינה</td><td>VWR international</td><td>232-2123</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה, קהה</td><td>VWR international</td><td>232-2113</td><td></td></tr><tr><td>ביקר 1000 מ"ל</td><td>VWR international</td><td>213-1642</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניגודיות פאזה</td><td>Nikon Instruments</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>כרטיסי ספיגה (Blotting) נקיים מסיבים, קופסה של 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDE1</td><td></td></tr><tr><td>שקפי מיקרוסקופ עם קצה כחול מט, קופסה של 100</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3022</td><td></td></tr><tr><td>לוחיות כיסוי, 18x18 מ"מ, מספר 1, מארז של 200</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3110</td><td></td></tr><tr><td> כיסויות, 22x22 מ"מ, מס' 0, קופסה של 200</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3104</td><td></td></tr><tr><td>כיסויות זכוכית (Coverslips), 22x50 מ"מ, מספר 0, מאreז של 100</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3206</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל, מאreה של 100</td><td>שרשרת האספקה של ה-NHS</td><td>FWC045</td><td></td></tr><tr><td>טיפ לפיפט של 1 מ"ל, 10 מגשים של 1000</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-T-1000-C-L-R</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td>LEEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מקלחון מים</td><td>ציוד ממענק</td><td>W22</td><td></td></tr><tr><td>מדחום אלכוהול</td><td></td><td></td><td>מקורים שונים זמינים</td></tr><tr><td>מד-pH</td><td>Jenway</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודת pH</td><td>VWR international</td><td>662-1759</td><td>תקע BNC המתאים למד pH מדגם Jenway 3305</td></tr><tr><td>ערבב מחומם</td><td>ביבי</td><td>HC502</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטור 1 מ"ל, מאreז של 500</td><td>ספק ציוד למעבדות מדעיות בע"מ</td><td>PIP4202</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm, 50mm x 75m</td><td>VWR international</td><td>291-1214</td><td></td></tr></tbody></table>

fish לאבחון גנטי טרום השרשה

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

טרום השרשה אבחון גנטי (PGD) מהווה חלופה הוקמה לאבחון טרום לידתי, והיא כרוכה בחירת ההשתלה טרום עוברים מקבוצה שנוצר על ידי טכנולוגיה רבייה סייעה (ART). בחירה זו עשויה להידרש בגלל המחלה monogenic משפחתית (סיסטיק פיברוזיס למשל), או כי אחד מבני הזוג נושא התארגנות כרומוזום (למשל טרנסלוקציה דו סטרי הדדי). PGD ​​זמין לזוגות שעברו ילדים מושפעים הקודם, ו / או במקרה של rearrangements כרומוזום, הפלות חוזרות או חוסר פוריות. גירוי השחלות ביציות aspirated הבאים מופרית על ידי טבילה ב בזרע במבחנה (IVF) או על ידי הזרקת תא זרע intracytoplasmic של הפרט (ICSI). טרום השרשה מחשוף בשלב עוברי הם ביופסיה, בדרך כלל על ידי הסרת תא בודד ביום 3 לאחר ההפריה, והתא ביופסיה נבדק כדי לקבוע את מצב גנטי של העובר. הקרינה הכלאה באתרו (FISH) על הגרעינים קבוע של תאים ביופסיה עם יעד ספציפי בדיקות ה-DNA היא הטכניקה של בחירה כדי לזהות חוסר איזון כרומוזום קשור rearrangements כרומוזום, וכדי לבחור עוברי נקבה במשפחות עם מחלה X-linked שבהם לא קיימת אין מוטציה ספציפית הבדיקה. FISH שימש גם כדי עוברים מסך aneuploidy כרומוזום ספונטנית (הידוע גם בשם PGS או PGD-AS) על מנת לנסות לשפר את היעילות של הרבייה סייעה, עם זאת, ערך מנבא של מבחן זה באמצעות הפצת הטכניקה FISH המתואר כאן צפוי להיות נמוך בלתי מתקבל על הדעת בידיו של רוב האנשים, והוא אינו מומלץ לשימוש קליני שגרתי. אנו מתארים את הבחירה של בדיקות מתאים FISH מתא בודד, טכניקות הפצת עבור גרעינים blastomere, וב הכלאה באתרו ניקוד האות, להחיל PGD בסביבה קלינית.

מאמר זה מתאר את הבחירה של בדיקות מתאים FISH מתא בודד, טכניקות הפצת עבור גרעינים blastomere, וב הכלאה באתרו ניקוד האות, להחיל אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) בסביבה קלינית.

FISH לאבחון גנטי טרום השרשה

אבחון גנטי טרום-השתלה (PGD) הוא חלופה מבוססת לאבחון טרום-לידתי, והוא כולל בחירה של עוברי טרום-השתלה מתוך...

מטרת הליך זה היא להשתמש בטכניקת היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (FISH) כדי לקבוע את מצב כרומוזומי המין או את מצב התעברות הגènes (translocation) של עוברים אנושיים במבחנה הנמצאים בסיכון להפרעה גנטית. פעולה זו מבוצעת על ידי ליזיס של תא בודד שנלקח בביופסיה מעובר ביום השלישי על גבי למסחת זכוכית וייבוש הגרעין באוויר. השלב השני הוא דנטורציה והיברידיזציה של ה-DNA בגרעין המטרה עם פרובים של DNA המסומנים בפלואורוכרומים בצבעים שונים.בשלב הבא מסירים את עודפי הגששים באמצעות שטיפה מחמירה, ואת הגרעין צובעים בצבע פלואורסצנטי ספציפי ל-DNA. השלב הסופי הוא צפייה בגרעין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה ולכידת תמונות דיגיטליות. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את מספר העותקים של אזורי הכרומוזום המיועדים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בטכניקה זו יתקשו בביצועה, מכיוון שהיא נמצאת בקצה הגבולה של טכניקת ההיברידיזציה פלואורסצנטית באתר (fluorescence in situ hybridization). 24 שעות מראש, הכינו את תמיסת הליזיס של התאים עבור פריסת התאים. סננו את התמיסה וחלקו אותה לאליקוטים של 1 ml לתוך 10 עד 15 מבחנות מיקרו-צנטריפוגה סטריליות בנפח 1.7 ml; סגרו וסמנו את המבחנות לפני הקפאה בטמפרטורה של 20°C- רגע לפני הליך הביופסיה.הפשיתו את בופר הליזיס בטמפרטורת החדר. חרצו עיגול קטן בקוטר של כחמישה מילימטרים בצדו התחתון של סלייד מצופה אמין באמצעות עט יהלום, ולאחר מכן סמנו את הסלייד כ-BLO בעזרת עיפרון קשיח מסוג 4H תוך שימוש בכפפת לטקס. כדי להסיר שאריות גרפיט, השתמשו בסלייד נפרד עבור כל מראת בלאסטר לפי הסדר המספרי.כעת יש להניח נפח קטן של תמיסת ליזיס בתוך המעגל. העבירו את ה-biopsy blaster אל תוך תמיסת הליזיס. הוסיפו תמיסת ליזיס לפי הצורך כדי לבצע ליזיס לתא.יש להשגיח על הגרעין כדי לוודא שהוא נשאר בתוך המעגל ולא אובד. אם לתא אין גרעין או שיש לו מספר גרעינים, יש לבצע ביופסיה לתא אחר. השאר את הפלטה לייבוש באוויר בטמפרטורת החדר.ראשית, בצעו שטיפה מקדימה לדגימות בצנכני Coplan באמצעות פוספט בסליין (phosphate buffered saline) למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו פעמיים במים מזוקקים סטריליים, בצעו דהידרטציה באמצעות סדרת אתנול למשך שתי דקות בכל שלב בטמפרטורת החדר, והניחו לייבש באוויר. ודאו שהשקופיות טבולות לחלוטין, ובמידה ואבקת גרפיט צפה על פני השטח, ספגו אותה בעזרת טישיו נקי.יש לתעד את מיקום הגרעין בתוך המעגל באמצעות הדמיה במיקרוסקופ ניגודיות פאזה. לאחר מכן, יש לבצע דהידרטציה לדגימות באמצעות 100% ethanol למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולייבש באוויר. כעת, יש להוסיף 2 µL מתערובת הגשש ולכסות באמצעות זכוכית כיסוי של 9x9 מילימטר.אטמו את קצוות זכוכית הכיסוי באמצעות דבק גומי. בצעו את הדנטורציה המקודדת. שלב בבלוק חימום ב-75 degrees Celsius למשך חמש דקות, ולאחר מכן בצעו היברידיזציה למשך לילה בתא לח במעמקים של 37 degrees Celsius עבור כל צנצנת צימוד.הביאו לטמפרטורת שיווי משקל 50 milliliters של תמיסת שטיפה מחמירה 0.4 times SSC במקלח מים בטמפרטורה של 71 degree Celsius. הניחו את בקבוק השטיפה המחמירה ואת צנצנת הצימוד הריקה במקלח המים בטמפרטורת החדר, חממו ל-71 degree Celsius, בצעו כוונון pH של השטיפה המחמירה ומזגו אותה לצנצנות קוצ'ין (cochin jars). המשיכו בהסרה זהירה של דבק הגומי מכל סלייד ושטפו את כיסוי הזכוכית באמצעות 4 times SSC 0.05%tween 20 ב-pH שבע בטמפרטורת החדר.שטפו את הדגימות בשטיפה מחמירה של 0.4 times SSC בטמפרטורה של 71 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן ב-four times SSC 0.05%Tween 20 בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. עבור גששים המסומנים באופן עקיף, נקו מהשקופיות נוזלים עודפים ומרחו 20 µL של נוגדן מצומד לפלואורופור תחת ריבוע פאראפורם של 20 על 20 מילימטרים. הדגירו בתא לח או במיכל לח במטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות.הסיר את ה-para film ובצע את השטיפות הבאות בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות: פעם אחת ב-SSC בריכוז four times עם 0.05% tween 20, ופעמיים למשך שתי דקות ב-PBS. לאחר ניקוז השקופיות, מרח שש µL של תמיסת קיבוע vector shield המכילה DPI על זכוכית כיסוי בגודל 22 על 22 מילימטר.השתמשו בזכוכית כיסוי מספר 0 והפכו את הפסית מעליה. ספגו עודפי נוזלים ואטמו את קצוות זכוכית הכיסוי בעזרת לכה שקופה לציפורניים. לבסוף, נתחו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.בצעו דירוג לכל גרעין על ידי שני אנליסטים עצמאיים. השתמשו בנוסף בתוכנה לעיבוד תמונות כדי ללכוד תמונה של הגרעין לצורך אישור האבחנה הוויזואלית ולצורך ארכוב תמונות כחלק מבקרת האיכות של המעבדה. כאן, פריסת מטאפאזה וגרעין באינטרפאזה שהוכנו מלימפוציטים של דם פריפרי, מעידים על נשא של טרנסלוקציה הדדית בין הזרועות הקצרות של כרומוזומים five ו-nine עם נקודות שבירה ב-five P 14.3 וב-nine P two, 4.1.בדיקות FISH מאירות הן את המקטעים שעברו טרנסלוקציה והן את המקטע הצנטרי של אותות כרומוזום 9. ניתן ללכוד גרעיני בלוסטומרה בשלב האינטרפאזה מעוברים ביום השלישי, ולאחר מכן למזגם ליצירת תמונה מורכבת. שני אותות עבור כל גלאי מעידים על שני עותקים של כל לוקוס, דבר העולה בקנה אחד עם ת complementary נורמלי או מאוזן.עבור כרומוזומי התעתיקה, האותות הצבעוניים מצביעים על עותק אחד של המקטע שהועתק מכרומוזום 5, שלושה עותקים של המקטע שהועתק מכרומוזום 9, ושני עותקים של המקטע הצנטרי של כרומוזום 9. נתונים אלו עולים בקנה אחד עם תוצר לא מאוזן של מונוסומיה עבור 5p14.3 עד 5pt וטריסומיה עבור 9p24.1 עד 9pt. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ניתוח תא בודד שנלקח בביופסיה מעובר אנושי והכנת גרעין בודד באמצעות טכניקת ה-fluorescence in situ hybridization.דבר זה חשוב להשגת תוצאות בדיקה אופטימליות הניתנות לשחזור, לצורך קביעת הרכב כרומוזומי המין או מצב טרנסלוקציה של עובר.

fish-for-pre-implantation-genetic-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

פונקציה ג'ין יכול להיות מוסתר על הפסד של פונקציה ניסויים אם קיים פיצוי על ידי גן אחר. המודל של דג הזברה מספק תפוקה גבוהה יחסית אמצעי לחשוף יתירות פונקציונלית כאלה עוברים חיים.

גישה גנטית הפוך כדי בדיקת יתירות פונקציונלית במהלך embryogenesis

פרוטוקול זה מתאר השיטה של ​​mutagenesis insertional מלכודת הגן באמצעות Gal4-VP16 ככתב הראשי וה-GFP / RFP ככתבים משניים בדג זברה. בערך אחד מעשרה צאצאי מלכודת גן תשואת דגי F0-להביע גבוה שיתוף להביע GFP וRFP. הליך המיון וניתן לשנות בקלות כדי להתאים לגודל של המעבדה מבצעת את מסך mutagenesis insertional.

גן השמנה באמצעות Gal4 בדג הזברה

דג הזברה הוא מערכת מודל רבת עוצמה לביולוגיה התפתחותית וחקר מחלות אנושיות בשל הדמיון הגנטי שלהם עם בעלי חוליות גבוהים יותר. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ליצירת עוברי דג זברה הפלואידים שניתן להשתמש בהם לאסטרטגיות מסך קדימה לזיהוי מוטציות רצסיביות בגנים החיוניים לאמבריוגנזה מוקדמת.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

מניפולציות מהונדסות ועריכה הגנום הן קריטיים עבור תפקודית בדיקות התפקידים של גנים ואלמנטים רגולטורית cis. הנה פרוטוקול microinjection מפורט עבור הדור של שינויים גנומיים (כולל מבנים transgene כתב ניאון בתיווך Tol2, TALENs, ו CRISPRs) מוצג לגבי דגים המודל המתהווה, עוקצן threespine.

Microinjection עבור עריכת Transgenesis ו הגנום ב הקוצנים Threespine

פרוטוקול microinjection פשוטה ויעילה לעריכה ג'ין ב ערוץ שפמנון עוברי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 מוצג. ב פרוטוקול זה, מדריך RNAs, חלבון Cas9 היו microinjected לתוך החלמון של תא אחד העוברים. פרוטוקול זה אומתה על ידי לדפוק שני גנים הקשורים החיסון ערוץ שפמנון.

Microinjection CRISPR/Cas9 החלבון לתוך ערוץ שפמנון, Ictalurus punctatus, העוברים עבור ג'ין עריכה

כאן, אנו מראים את התהליך של יצירת קו דג זברה כתב מתח חשמלי הסלולר להמחיש את התפתחות, תנועה, דגים גידול תאים ויוו.

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

דג זברה שימשו מודל גנטי אמין האורגניזמים במחקר ביו-רפואי, במיוחד עם כניסתו של טכנולוגיות לעריכת ג'ין. כאשר הזחל פנוטיפים צפויים, זיהוי ה-DNA החילוץ, גנוטיפ יכול להיות מאתגר. כאן, אנו מתארים הליך genotyping יעיל עבור הזחלים דג זברה, מאת הזנב מסיכה, מוקדם ככל 72-h שלאחר ההפריה.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

אנו מתארים גישות על המניפולציה של גנים במערכת המודל האבולוציוני Astyanax mexicanus. שלוש טכניקות שונות מתוארים: בתיווך Tol2 transgenesis, יישוב מניפולציה של הגנום באמצעות CRISPR/Cas9, ואת נוקאאוט של הביטוי תוך שימוש morpholinos. כלים אלה צריך לאפשר חקירה ישירה של גנים שבבסיס וריאציית בין פני השטח - ואת מערת המגורים טפסים.

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

כאן, אנו מציגים שיטה לקביעת רצף מוליכים למחצה עבור בדיקה גנטית מראש עבור השרשה (PGT-A) עם היתרונות של זמן טיפול קצר, עלות נמוכה, ותפוקה גבוהה.

רצפי מוליכים למחצה עבור השרשה בדיקה גנטית עבור אנאפלואידיה

הפרוטוקול מציג את ההליכים הכוללים במעבדה הנדרשים בבדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא. כאן אנו מציגים את השלבים המפורטים של הגברה גנומית שלמה, בחירת מקטעי DNA, בניית ספרייה, הכנת תבניות וזרימת עבודה של ריצוף עם תוצאות מייצגות.

בדיקות גנטיות טרום השרשה לאנופלואידיה על פלטפורמת ריצוף מבוססת מוליכים למחצה מהדור הבא

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

למד את טכניקת FISH לאבחון גנטי טרום השרשה בעוברי אדם. שיטה זו מאפשרת זיהוי מדויק של הפרעות כרומוזומליות וטרנסלוקציות בתאים בודדים לפני השתלת העובר.

FISH לאבחון גנטי טרום השרשה

גלה סרטונים נוספים