FISH לאבחון גנטי טרום השרשה

מאמר זה מתאר את הבחירה של בדיקות מתאים FISH מתא בודד, טכניקות הפצת עבור גרעינים blastomere, וב הכלאה באתרו ניקוד האות, להחיל אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) בסביבה קלינית.

מטרת הליך זה היא להשתמש בטכניקת הכלאה פלואורסצנטית באתרה כדי לקבוע את כרומוזום המין או מצב הטרנסלוקציה של עוברים אנושיים במבחנה הנמצאים בסיכון לחריגה גנטית. זה מושג על ידי ליזינג, ביופסיה של תא בודד מעובר ביום השלישי על מגלשת זכוכית וייבוש האוויר של הגרעין. השלב השני הוא לקודד את טבע D ולהכליא את ה-DNA של גרעין המטרה עם בדיקות DNA המסומנות בפלואורוכרומים בצבעים שונים.

לאחר מכן מסירים את הבדיקה העודפת באמצעות שטיפה קפדנית והגרעין מוכתם בכתם פלואורסצנטי ספציפי ל-DNA. השלב האחרון הוא לראות את הגרעין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וללכוד תמונות דיגיטליות. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המציגות את מספר ההעתקים של אזורי הכרומוזומים הממוקדים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו מכיוון שהיא נמצאת ממש בגבול טכניקת הקרינה באתרה הכלאה. 24 שעות מראש, הכינו את מאגר הליזיס של התאים להפצת תאים. סנן את התמיסה והוציא 1 מיליליטר אליקוט לתוך 10 עד 15, 1.7 מיליליטר צינורות מיקרו צנטריפוגה סטריליים סגור וסמן את הצינורות לפני ההקפאה במינוס 20 מעלות צלזיוס ממש לפני הליך הביופסיה.

הפשירו את מאגר הליזיס בטמפרטורת החדר. קלעו עיגול קטן בקוטר של כחמישה מילימטרים בצד התחתון של שקופית מצופה אמין באמצעות עט יהלום, ולאחר מכן בעזרת עיפרון קשיח של ארבעה H תייג מראש את השקופית BLO עם כפפת לטקס. כדי להסיר אבק גרפיט, השתמש בשקופית נפרדת עבור כל מראה פיצוץ בסדר מספרי.

כעת הניחו נפח קטן של מאגר ליזה בתוך המעגל. העבר את פיצוץ הביופסיה למאגר הליזיס. הוסף מאגר ליזה לפי הצורך כדי ליז את התא.

התבונן בגרעין כדי לוודא שהוא נשאר בתוך המעגל ולא הולך לאיבוד. אם לתא אין גרעין או שיש לו גרעינים מרובים, יש לבצע ביופסיה של תא אחר. השאירו את המגלשה לייבוש באוויר בטמפרטורת החדר.

ראשית, שטפו מראש את הדגימות בצנצנות קופלן באמצעות מי מלח עם פוספט למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשטוף פעמיים במים מזוקקים סטריליים, לייבש בסדרת אתנול למשך שתי דקות כל אחת בטמפרטורת החדר ולייבש באוויר. ודא שהמגלשות שקועות במלואן ואם אבק גרפיט צף על פני השטח, ספוג עם רקמה נקייה.

רשום את מיקום הגרעין בתוך המעגל על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. לאחר מכן יש לייבש את הדגימות עם 100% אתנול למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר ולייבש באוויר. כעת מרחו שני מיקרוליטר של תערובת בדיקה וכסו בהחלקת כיסוי של תשעה על תשעה מילימטרים.

אטום את שולי החלקת הכיסוי במלט גומי. בצע את הנאטורינג המקודד. דורכים על גוש חום בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואז הכלאה למשך הלילה בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לכל צנצנת צימוד.

יש לאזן 50 מיליליטר של 0.4 פעמים תמיסת כביסה מחמירה של SSC באמבט מים של 71 מעלות צלזיוס. הנח את בקבוק הכביסה המחמיר ואת צנצנת הצימוד הריקה באמבט המים בטמפרטורת החדר בחום ל-71 מעלות צלזיוס pH השטיפה המחמירה והשפוך לצנצנות קוצ'ין. המשך להסיר בזהירות את מלט הגומי מכל שקופית ולשטוף את החלקת הכיסוי באמצעות ארבע פעמים SSC 0.05% בין 20 pH שבע בטמפרטורת החדר.

שטפו את הדגימות בכביסה מחמירה של 0.4 פעמים SSC ב-71 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואחריה ארבע פעמים SSC 0.05%Tween 20 בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. עבור בדיקות המסומנות בעקיפין, רוקנו את שקופיות הנוזל העודף ומרחו 20 מיקרוליטר של נוגדן מצומד פלואורסצנטי מתחת לריבוע של 20 על 20 מילימטר של פרפורם. דגירה בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

הסר את סרט הפרה ובצע את השטיפות הבאות בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. פעם בארבע פעמים SSC 0.05% בין 20 ופעמיים למשך שתי דקות ב-PBS. לאחר ניקוז השקופיות, יש למרוח שישה מיקרוליטר של מדיום הרכבה של מגן וקטורי המכיל DPI על 22 על 22 מילימטר.

כיסוי מספר אפס להחליק ולהפוך את השקופית מעל המכסה. החלק כתם ואטום את שולי החלקת הכיסוי בלכה שקופה. לבסוף, נתח את הדגימות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ציין כל גרעין על ידי שני אנליסטים בלתי תלויים. השתמש גם בתוכנת הדמיה כדי ללכוד תמונה של הגרעין לאישור האבחנה החזותית ולארכיון תמונות כחלק מהבטחת איכות המעבדה. כאן התפשטות מטפאזה וגרעין בין-פאזי שהוכן מלימפוציטים בדם היקפי מצביעים על נשא של טרנסלוקציה הדדית בין הזרועות הקצרות של כרומוזומים 5 ו-9 עם נקודות שבירה בחמש P 14.3 ותשע P שתיים, 4.1.

בדיקות דגים מאירות הן את המקטעים הממוקמים בטרנס והן את המקטע המרכזי של אותות כרומוזום תשע. בממשק פיצוץ גרעינים בלבד מהיום השלישי, ניתן ללכוד עוברים ואז למזג אותם ליצירת תמונה מורכבת. שני אותות לכל בדיקה מצביעים על שני עותקים של כל לוקוס, מה שעולה בקנה אחד עם משלים רגיל או מאוזן.

עבור כרומוזומי הטרנסלוקציה, אותות צבעוניים מצביעים על עותק אחד של המקטע הטרנס הממוקם של כרומוזום חמש, שלושה עותקים של המקטע הטרנס של כרומוזום תשע ושני עותקים של המקטע המרכזי של כרומוזום CH תשע. נתונים אלה עולים בקנה אחד עם תוצר לא מאוזן של סומי גבר עבור חמש P 14.3 עד חמש PT וטריזומיה עבור תשע P שתיים, 4.1 עד תשע נקודות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח תא בודד שנלקח ביופסיה מעובר אנושי ולהכין גרעין יחיד באמצעות טכניקת הכלאה פלואורסצנטית באתר.

זה חשוב כדי להשיג תוצאות בדיקה ניתנות לשחזור ואופטימליות לקביעת השלמת כרומוזומי המין, או מצב טרנסלוקציה של עובר.