Name: קשירת עורקים כלילית לבין הזרקת Intramyocardial ב מודל Murine של אוטם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: למד טכניקות מיקרוכירורגיות לקשירת עורקים כלילית והזרקה תוך-שרירית בלב עכבר. שיטות אלו מאפשרות חקר פציעת איסכמיה/רפרפוזיה והערכת שיקום לבבי בדגם ממושי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

הייתי רוצה להכיר מחלקת מחקר ללימודים מתקדמים על מתן כספים כדי לתמוך במחקר שלי ואת המחלקה לרפואה השוואתי על ערנותם וסיוע. אני רוצה גם להכיר את המחלקה לפיזיולוגיה על תמיכתם הדרכה כמו גם סטודנטים וטכנאים במעבדה שלי עזרתם. לבסוף, אני רוצה להודות הרוחני הפוסט דוקטורט שלי, ד&quot;ר צ&#39;רלס א &#39;מורי, על ההזדמנות הכשרה במהלכן למדתי את microsurgery העכבר.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירי ניתוח סטרילי (טבלה 1) ו - 3 "applicators כותנה היטה ממוקמות על underpad סטרילית. מעקר חרוז (Germinator 500) מופעלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים (גיל:&gt; 6 שבועות; wt:&gt; 18g) מורדמים עם זריקה ip של 20μl / g BW של tribromoethanol (250mg/kg, משך כ - 40 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העכברים אינם מגיבים לצבוט-הבוהן, חומר סיכה סטרילי (דמעות מחודשת) על העיניים כדי להגן עליהם מפני יובש וגם את הצד השמאלי של החזה מצופה מקריח (למשל Nair) כדי להסיר את הפרווה מן העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקריח הוא נשטף עם מים זורמים חמים בבטאדין / אלכוהול בניקוי משמש כדי לחטא את אזור הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכבר מונח על משטח חם מקורר באופן איזוטרמי deltaphase אשר קבוע לטבלה פרספקס. כל איבר משותק באמצעות קלטת חוט עבה ממוקם בצורה אופקית מתחת לשיניים העליונות להחזיק את הלסת העליונה במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטבלה במאונך אור סיב אופטי הוא זרח ישירות על גבי באזור הצוואר לתאורה הושט. זה דורש המיקום המדויק כזה הפתיחה של הגרון נתפסת פתח מואר היטב, ובכך לאפשר קנה הנשימה כדי להיות דמיינו כדי להקל על החדרת צינורות PE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות מחוברת למכונת הנשמה לאחר מכן (מחוברת של 95% O 2 / 5% CO 2) לנהל את לחץ מתמיד אוורור חיובי (Topo ההנשמה; שיעור 125 נשימות / דקה; שיא inspiratory 10-12 לחץ CMH 2 O; לב * : הגדרות להשתנות עם זן ומין 1-3). לאחר אוורור הוא אושר על ידי תנועות החזה סינכרוני, החיבור הוא קבוע כרית עם קלטת כדי למנוע האקסטובציה במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים שיניים למשוך העור למעלה מן החזה, להב אזמל סטרילי # 10 מחוברת ידית # 3 האזמל משמש לביצוע חתך 1.5cm במקביל את העור עצם החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Curved microscissors Vanna משמשים לחתוך את השרירים הפקטוראלי ולעשות חור קטן בשריר צלעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרייט, microscissors בוטה משמשים לחתוך 3 צלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספקולום 9mm עיניים ילדים משמש לחזור בו כלוב הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים מעוקל, למשוך את קרום הלב מן הלב להשתמש במלקחיים שיניים בעדינות כדי לקרוע אותו פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בעל מחט Castroviejo, נקודת קוני 6 מ"מ 3 / 8 האשכולות המחט תפר 8-0 פוליאתילן מתחת הקדמי השמאלי היורד לב כלילית (לאורך ציר זמן של הלב) בניצב אליו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ליגטורה זמני כי ניתן להסיר את reperfusion מתוזמן, פיסת סטרילי 0.5-1cm של PE90 מושם על הלב במקביל העורק הכלילי. תפר, שבה יש היכרות קודמת כרך תחת העורק הכלילי, קשורה מכן בצינור. באותו זמן היא להשתחרר, ליגטורה הוא רופף. זה יכול להיות חזר כרצונכם ואת הזמן של חסימה / reocclusion יכול להיות שונה 4. בהתאם לאורך הפרוטוקול ואת סוג של הרדמה המשמשים, תוספי עשוי להיות נחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגבי חסימה קבועה, המיתר שילב תחת העורק הכלילי הוא קשור פשוט. לחלוט dyskinesia ניכרים ואת הקצה הארוך של תפר הוא חתך 5-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זריקה intramyocardial (ים), מזרק סטרילי המילטון עם מחט סטרילית 30 מד משופעים מוחדר בבסיס הלב מעל אזור הפגיעה בצד ימין של המיתר. המחט היא מתקדמת אז לאזור הפציעה ומסוגר מעט כך שפוע ניתן לראות כ בבית באזור הגבול. חלק מהפתרון של המזרק (2-3μl) מוזרק לתוך הלב מחט מוחזק במקום. מזרק היא נסוגה עוד 1-3mm ושאר הפתרון הוא מוזרק. מזרק נערכת במקום עד בועה כי הוא נוצר על ידי הפתרון מתפוגג. המחט מוסרת אז. אם יש דימום כלשהו, ​​המוליך כותנה שקצהו נלחץ בעדינות על גבי אתר הכניסה מחט עד שהדימום ייפסק 5-7. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מניפולציות שריר הלב הושלמו, retractors הצלעות יוסרו את חלל בית החזה סגור עם 2-3 תפרים מזרן באמצעות 6-0 תפר surgipro. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתיים ושלוש התפרים המזרן עשויים אז כדי לסגור את השרירים הפקטוראלי, 1-3 טיפות של 1:10 marcaine 0.25% בשנת מלוחים סטרילית (עכבר 0.1ml/25g) על השריר ואז 2-3 תפרים מזרן נעשים לסגור את העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכבר הוא להסיר את מכונת ההנשמה. הנשימות הקצובות פעם, מהירה, רדודה מאומת, העכבר יכול להיות extubated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5ml מלוחים חמים סטרילי מוזרק אל תוך החלל התת עורית הגב ואת העכבר מונח על כרית חימום בכלוב עד שהוא חוזר הניידות (1 מינימום שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הניסויים הישרדות, עכברים ממוקמים בחזרה לתוך כלובים וחזרו ביבר עד הזמן של הקרבה. 2 במהלך הימים הראשונים, לחלח המזוןשהונחו על רצפת הכלוב, כדי להקל על האכלה (ולכן הם לא חייבים להגיע עד אשר עלולים לגרום כאב) ואת עצירות צריכה להינתן כל 6-12hr. הטיפול שלאחר הניתוח כולל גם ניטור יומיומי בשבוע הראשון כדי לוודא ניידות נאותה, טיפוח, והרגלי אכילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכשירים הם כירורגית נמחק עם אתנול ונוסף מעקר את החרוז לפני הניתוח הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמנו של הקרבה, עכברים מורדמים עם נתרן pentobarbital (65mg/ml: 55-65 מ"ג / ק"ג). כאשר מטוס נאותה הרדמה מושגת, חלל בית החזה נפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הלב עדיין פועם, מזרק עם מחט 23 מד המכיל אשלגן כלורי קר (KCl, 30mm) או 2,3-butanedione monoxime (^ נם; 10mm) משמש כדי לנקב את אזור הבסיס האחורי של החדר ואת הפתרון מוזרק באיטיות אל תוך החדר עד הלב הוא נעצר תרויח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לב מוסר, מזרק המכיל PBS משמש retrogradely perfuse לשטוף את הלב כדי להסיר כל הדם שנשאר. עבור מחקרים חריפה, בסוף התקופה reperfusion, הנער מחדש ligated בנקודה המקורית של חסימה. פתרון המכיל כחול 1% של אוון מוזרק לתוך האאורטה. לאחר לב מופק, הוא חתך רוחבי לתוך 3 חלקים של עובי שווה, מודגרות ב -1% 2,3,5-triphenyltetrazolium כלוריד, הדמיה עבור ניתוחים morphometric 11. עבור מחקרים כרונית, הלב הוא שקוע אז מקבע, מעובד אז מוטבע על פי נהלים שגרתיים. שקופיות אז יכול להיות מוכתם בהיסטולוגיה הדמיה עבור ניתוחים morphometric (באמצעות Scion, NIH תמונה J, או Image Pro Plus) 9,10,12. </li></ol> נציג תוצאות: כאשר נעשה בצורה נכונה, שיעורי ההישרדות של עכברים (זכרים: גיל 8-10 שבועות, 22-28g, נקבה: גיל 10-12 שבועות, 20-26g) הם: מעל 90% ב איסכמיה חריפה / reperfusion וניסויים נפשית מראש איסכמי, על 85% במחקרים קשירת עורק קבוע, וכ -80% עבור זריקות intramyocardial. מאז הפציעה מוקדם יותר בקלות גלוי על ידי שינויים מטבוליים מאשר קביעה המבנית, גודל האוטם ב איסכמיה / reperfusion וניסויים נפשית מראש איסכמי מבוצע על ידי החדרת צבע 1% של אוון כחול אל אבי העורקים אשר perfuse הלב שאינו מסופק על ידי הנער ( איור 1 א). פעם מסירים את הלב וחותכים רוחבי במחצית, הרקמה מודגרות בתמיסה של 1% כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium למדידת גודל האוטם (איור 1B). האזורים נמדדים באמצעות Scion או NIH תוכנת הדמיה אשר יכולים להיות מכויל באמצעות מיקרומטר הדמיה בהגדלה זהה. מספרים אלה משמשים לחישוב שטח בסיכון / האוטם החדר השמאלי גודל / שטח בסיכון 11. ההבדלים מסננים יכול לגרום לשינויים במשקל הגוף ואת גודל הלב ולכן יש להיזהר לנרמל אמצעים אלה משקל לב, משקל גוף, או אורך השוקה לצורך השוואתי. קבע קשירת העורק גורמת לשינויים מבניים ברוטו כגון נמק, קיר דליל, והתרחבות קאמרית. השוואה של השפעות של טיפול ו / או זמן על גודל האוטם ו נמק יחסית החדר השמאלי, באזור תא, קיר במחיצה בין החדר השמאלי ואת חינם עובי דופן במודל חסימה קבועה (איור 2 א) ניתן גם למדוד באמצעות Scion או NIH הדמיה התוכנה. מכתים קולגן עם ירוק picrosirius אדום / מהיר (תרשים 2B) ניתן להשתמש כדי למדוד סיסטיק insterstitial אשר וקושרת את המדדים תפקודית של 8-10 קיר התקשות. התמונה באיור 3 מייצג את ההפצה של פתרון 6ul (כחול של אוון) המוזרק לאזור הגבול של הלב בעקבות קשירת עורק קבע. שימו לב כי זה ממשיך בכיוון של הפגיעה, כמו גם לעבר בסיס וגם transmurally. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. א 'אוון' s כחול מוזרק האאורטה לפני כריתה. תמונה זו מראה את האזורים perfused של הלב (מוכתמים) ואזור occluded (בלא כתם). אוון ב 's כחול מכתים TTC בעקבות פציעה איסכמיה / reperfusion חריפה. זוהי תמונה מייצגת (20x) מראה את התפלגות צבע כחול אשר מוכתם האזורים unoccluded וכן מכתים TTC של רקמת קיימא מבחינה מטבולית (אדום). אזורים נקרוטי לא ללכלך ולכן הם נשארים חיוורים (המפורטים). <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. א Hematoxylin ו eosin הכתם. זוהי תמונה מייצגת (20x) של H &amp; E מכתים לב העכבר לחתוך רוחבי ב 4 ימים דרך באזור האוטם לאחר MI (20x). * מציין נמק רקמות, החצים מצביעים על רקמת פרור, RV = זכות החדר ואת LV = החדר השמאלי. B. Picrosirius אדום וירוק מהיר הכתם. זהונציג תמונה (20x) של picrosirius אדום / ירוק מכתים מהיר של חתך של הלב העכבר 4 שבועות לאחר אוטם לבבי. הכתמים הציטופלסמה ירוק סיבי קולגן אדומות. <img src="/files/ftp_upload/2581/2581fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. ההפצה כתם כחול אוואן לצבוע הבאים הזרקה intramyocardial 6ul. זוהי תמונת מראה נציג ההפצה הגלובלית transmural של צבע כחול של אוון בכל לב את הדברים הבאים הזרקה intramyocardial 6ul על אזור הגבול מיד לאחר קשירת עורקים כליליים (12x).

פרוטוקול זה אושר על ידי בעלי חיים והיא בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש ב מזרח קרוליינה האוניברסיטה.

מחלת לב כלילית ממשיך להיות בריאות epidemiologically ו כספית משמעותית בעיה ציבורית. מחקר בסיסי ניכרת עדיין יש צורך להבין את המנגנונים שבאמצעותם פציעה שיפוץ להתקדם ואיך הרפוי פוטנציאליים עשויה לווסת את התהליכים האלה, אם הם להיות מפותחים לשימוש קליני. המכרסמים הנפוץ ביותר ואת מגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטית זמין עושה את זה מין מודל אטרקטיבי יותר. אמנם יש הבדלים בין עכברים מינים אחרים, יש יתרונות רבים למודל Murine. שימוש בהיקף לנתח פשוט או זכוכית מגדלת ותנאי מואר היטב כדי לאפשר את vasculature בקלות לראות (ברוטו עבור האנטומיה מפורט של כלי הדם, ראה Salto-Tellez et al. 2004, 13). כדי להפחית את הסיכון לתמותה לאחר הניתוח, חשוב מאוד כדי למנוע ניתוק כלי גדול מאז נפח הדם הכולל של עכבר 25 גרם פחות מ 2ml 14. במקרה של דימום יתר מתרחשת, יישום עדין של לחץ או צריבה לאתר ניתן להשתמש כדי לעצור את הדימום. הליך זה יכול להיות גם שינוי במגוון של דרכים. למשל, בעכברים ניתן בהרדמה באמצעות isoflurane, קטמין / xylazine, או נתרן pentobarbital ובחירת המתאימה נקבעת על פי משך הזמן של פרוטוקול 15-18. רפלקס הבוהן קמצוץ הוא המדד הנפוץ ביותר של עומק ההרדמה. יתר על כן, כדי לשפר את הסיכוי להישרדות ארוכת טווח, חוקרים אחדים להשתמש בסמים antiarrhythmic כגון לידוקאין כדי להפחית את השכיחות של הפרעות קצב קטלניות 19,20 עם זאת, יש לקחת בחשבון כי זה לאחרונה הראו תכונות antiapoptotic ב חריפה מודל 21. כמו כן, כדי להפחית את הכאב שלאחר הניתוח, משככי כאבים כגון עצירות יכולה להינתן במשך 48 השעות הראשונות לאחר הניתוח 3,16,17,22,23. כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בזמן ניתוח (בעיקר בפרוטוקולים יותר), בדיקה רקטלית בסדרה עם כרית חימום משמש לעתים קרובות במקום כרית מקורר באופן איזוטרמי. עבור איסכמיה / reperfusion ו / או איסכמי מראש או postconditioning: את משך הזמן של חסימה (ים) ו reperfusion (ים) ניתן לשנות, כי חסימה קבועה, בגודל של האוטם עשוי להיות שונה על ידי התאמת המיקום של המיתר; עבור זריקות intramyocardial (תאים למשל, חלבונים), לא יכולה להיות במקומות 1-3 הזרקת ונפח לכל זריקה יכול להיות עד 15 24 μl. אם התאים להיות מוזרק, מד המחט בשימוש (בדרך כלל 26-30) 5,25,26 יש לבחור בהתבסס על גודל התאים כך את הקוטר הפנימי של המחט הוא גדול מספיק כדי למנוע את הסתייגותו. כדי למנוע בלבול עקב תהליכים דלקתיים מופעלות על ידי הניתוח, חוקרים אחדים דיווחו על שימוש מוקש כי היא מניפולציה vivo לשעבר כדי לחסום את ליבם ואת reperfuse בעכבר החזה סגור בשלב כלשהו לאחר הניתוח 27-29. לאחרונה, גאו et al. 30 הראו כי חסימה זמניים וקבועים יכול להתבצע ללא צורך אוורור במעבדות ספורות החלו להשתמש אולטרסאונד כדי לבצע סגור החזה intramyocardial זריקות 25,31. מאז המחקר הראשון הוכחת ההיתכנות של ligating לב כלילית אצל עכברים פורסם על ידי ג &#39;ונס ו אולסון בשנת 1954 32, ורבים אחרים אימצו את מודל שונה הוא ללמוד היבטים שונים של פגיעה בשריר הלב שיפוץ 3,33-45. טבעו של עכברים מבחינת גודל, יכולת הרבייה, והוצאות יחסית פחות לרכישה ותחזוקה להפוך את זה למין כלי מושך עבור מגוון רחב של מחקרים פיזיולוגי pathophysiologic. ככל המזעור של הטכנולוגיה עבור הדמיה ההתקדמות vivo 46-49, כמו גם האמצעים לבצע ולנתח הגנומיקה בקנה מידה גדול proteomics, הקרנת סמים, היעילות של טיפולים מבוססי תאים ו / או חלבון, כמו גם biomaterials 50-64, בשילוב עם מגוון רחב יותר ויותר של מניפולציות גנטיות המוענקת על ידי רקמה או בכל מקום העכברים הטרנסגניים או מוטציה / בנוקאאוט ספציפי, המודל Murine של אוטם שריר הלב ללא ספק להמשיך להיות כלי רב ערך בהערכת פגיעה לבבית חריפה שיפוץ לטווח ארוך. לכן, יש ערך מוטלת בספק להיות מסוגל לבצע ניסויים אלו אמין reproducibly.

<table><tbody><tr><td>מספרי ואנה ארוכים</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-159</td><td></td></tr><tr><td>מספרי מיקרו-דיסקציה</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-161</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה &amp;#8211; ישרה, 1x2 שיניים</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-205</td><td></td></tr><tr><td>ידית סקלפל #3</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-64</td><td>להב סטרילי #10</td></tr><tr><td>פינצטה &amp;#8211; חצי מעוקלת עם שיניים</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>160-19</td><td></td></tr><tr><td>מספרי רקמה</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co.</td><td>105-410</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחטים של קסטרוביחו</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-1828</td><td></td></tr><tr><td>מפריח עיניים של קוק</td><td>Miltex Inc.</td><td>18-63</td><td></td></tr><tr><td>Surgipro II 8-0</td><td>Suture Express</td><td>VP-900-X</td><td></td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Suture Express</td><td>8776</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר עיקור בחרוזיים Germinator 500</td><td>Cellpoint Scientific</td><td>65369-1</td><td></td></tr><tr><td>פד איזותרמי Deltaphase</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון - 25&amp;mu;l</td><td>Hamilton Co</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>מחט בעלת חתוך אלכסוני (beveled) מדד 30</td><td>Hamilton Co</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>מנשם</td><td>Kent Scientific</td><td>TOPO</td><td></td></tr></tbody></table>

קשירת עורקים כלילית לבין הזרקת intramyocardial ב מודל murine של אוטם

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

מודלים של עכברים הם כלי בעל ערך לחקר של פגיעה חריפה ושיקום כרוני של השריר הלבבי in vivo. עם הופעתן של מודיפיקציות גנטיות לאורגניזם השלם או לשריר הלבבי, ומגוון של חומרים ביולוגיים ו/או סינתטיים, קיים פוטנציאל רב לכל שילוב של אלו כדי להפחית את היקף הפגיעה האיסכמית החריפה ולעכב את התחלת אי-ספיקת הלב בעקבות שיקום השריר הלבבי.
כאן אנו מציגים את השיטות והחומרים המשמשים לביצוע מהימן של מיקרו-ניתוח זה, ואת ההתאמות הנדרשות למחקרי חסימה זמנית (עם רפרפוזיה) או קבועה של העורקים הכליליים, וכן להזרקות תוך-שריר הלב. השפעות על הלב שניתן להבחין בהן במהלך הפרוצדורה ובסיום הניסוי, בנוסף להערכה היסטולוגית, יאששו את היעילות.
בקיצור, ההכנה הכירורגית כוללת הרדמה של העכברים, הסרת הפרווה מהבית וחיטוי של אזור הניתוח. אינטובציה תו-קנה (intratracheal intubation) מבוצעת באמצעות הארה טרנס-אוזופגיאלית באמצעות תאורה סיבית. לאחר מכן, הצינור מחובר למנשם. חתך המבוצע בחזה חושף את שרירי החזה, אשר ייחתכו כדי לחשוף את הצלעות. למחקרי איסכמיה/reperfusion, נעשה שימוש בפיסת צינור PE באורך 1 cm המונחת מעל הלב, אליה קושרים את הליגטורה כדי לאפשר התאמה אישית של ה-occlusion/reperfusion. להזרקות תוך-שריר הלב (intramyocardial injections), נעשה שימוש במזרק Hamilton עם מחט סטרילית בשיפוע (beveled) בכיול 30gauge. עם סיום המניפולציות בשריר הלב, כלוב הצלעות, שרירי החזה והעור נסגרים באופן רצפי. אלגזיה באמצעות חסימה קוית (Line block analgesia) מבוצעת על ידי 0.25% marcaine בסליין סטרילי, המיושם על שכבת השריר לפני סגירת העור. העכברים מקבלים הזרקה תת-עורית של סליין ומונחים בתא חימום עד שהם שוכבים על הגב (sternally recumbent). לאחר מכן הם מוחזרים לוויוואריום ומשוכנים בתנאים סטנדרטיים עד למועד איסוף הרקמות. במועד ההקרבה, העכברים מורדמים, הלב נעצר בשלב הדיאסטולה באמצעות KCl או BDM, נשטף בסליין וטובל במקבע. לאחר מכן, מבוצעים הליכים שגרתיים של עיבוד, טמינה, חיתוך וצביעה היסטולוגית.
אינטובציה לא כירורגית של עכבר והמניפולציות המיקרו-כירורגיות המתוארות הופכות מודל זה למאתגר מבחינה טכנית ללמידה ולהשגת הדירות (reproducibility). הליכים אלה, בשילוב עם הקושי בביצוע מניפולציות עקביות של הליגטורה לצורך חסימה(ים) מתוזמנת ופרפוזיה חוזרת או הזרקות תוך-שריריות של הלב (intramyocardial injections), עלולים להשפיע גם על שיעור ההישרדות, ולכן אופטימיזציה ועקביות הן קריטיות.

מניפולציות גנטיות רבות ו / או זריקות intramyocardial של גנים, חלבונים, תאים, ו / או biomaterials באים על גבי מימד הזמן במחקרים של פגיעה איסכמיה / reperfusion חריפה שיפוץ כרונית בעכברים. וידאו זה ממחיש את הליכי microsurgical עבור איסכמיה / reperfusion, קשירת עורק כלילי קבע, ומחקרים הזרקת intramyocardial.

קשירת עורקים כלילית לבין הזרקת Intramyocardial ב מודל Murine של אוטם

מודלים של עכברים הם כלי בעל ערך לחקר פגיעה חריפה וremodeling כרוני של השריר הלבבי (myocardium) in vivo. עם הופעתן של מודיפיקציות גנטיות ל...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים שיטות מיקרו-כירורגיות לביצוע ליגציה זמנית או קבועה של העורקים הכליליים, וכן הזרקה תוך-שרירית לשריר הלב בעכבר. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנה וחיטוי של אזור הניתוח. לאחר מכן, העכבר עובר אינטובציה באמצעות צינור PE 90 כדי לספק הרפיה בלחץ חיובי במהלך התורקוטומיה.לאחר בידודה, ניתן לחסום את העליל הכלילי באופן זמני או קבוע. בנוסף, ניתן להזריק חומר אל תוך הלב. התוצאות המתקבלות מראות את מידת הפגיעה שנגרמה ללב, בהתבסס על נקודות קצה היסטולוגיות ומורפומטריות, סממנים של חלבונים ברקמות ובסרום, וכן מדדים תפקודיים.שמי TKA Rag ואני מהמחלקה לפיזיולוגיה בבית הספר לרפואה Brody באוניברסיטת East Carolina. מטרת סרטון זה היא להדגים את הפרוצדורות המיקרו-כירורגיות המשמשות לקשירה (ligation) זמנית וקבועה של העורקים הכליליים, וכן להזרקה תוך-שרירית של שריר הלב אל תוך לב של עכבר. כדי להתחיל, הניחו מכשירים כירורגיים סטריליים ומקלונים עם טיפ צמר בגודל שלושה אינץ' על גבי משטח ספיגה סטרילי.לאחר מכן, הפעילו מכשיר סטריליזציה בחרוזים כך שיהיה מוכן לעיקור המכשירים בין ניתוחים בודדים. כדי להכין את בעל החיים לניתוח, מרחו חומר סיכוך סטרילי על עיניו של עכבר תחת הרדמה. לאחר מכן, הסירו את הפרווה מהצד השמאלי של בית החזה באמצעות חומר להסרת שיער, כגון nare.נגבו היטב את קרם הדיפילציה כדי למנוע כוויות כימיות או דרמטיטיס. הניחו את העכבר על פד איזותרמי בשלב דלתא המקובע לשולחן פלקסיגלס. קבעו כל גפה באמצעות סרט הדבקה והניחו חוט עבה מתחת לשיניים העליונות כדי להחזיק את הלסת העליונה במקומה.נגב את אתר הניתוח ב-Betadine ולאחר מכן באלכוהול, שלוש פעמים בסך הכל. השתמש בתאורת סיב אופטי כדי להאיר את אזור הצוואר כדי לסייע בויזואליזציה של הקנה במהלך הכנסת צינור ה-PE. לאחר ההארה, הכנס בזהירות את הצינור דרך הפה.חברו את הצינור למנשם כדי להעניק הרפיה בלחץ חיובי. לאחר שההנשמה אושרה על ידי תנועות חזה סינכרוניות, קבעו את החיבור לפד באמצעות סרט הדבקה כדי לשמור עליו במקומו. במהלך הניתוח, השתמשו בפינצטה משוננת כדי למשוך את העור למעלה והרחק מהחזה ולבצע חתך של 1.5 סנטימטר בעור במקביל לעצם החזה.בשלב הבא, השתמשו במספרי מיקרו Vana מעוקלים כדי לחתוך את שרירי החזה (pectoralis muscles) וליצור חור קטן בשריר בין-צלעי. לאחר הנחת השריר, השתמשו במספרי מיקרו קהים וישרים כדי לחתוך דרך שלוש צלעות. השתמשו בספקולום להרחקה של כלוב הצלעות.פתח בעדינות את שק הפריקרד כדי לחשוף את הלב באמצעות מחזיק מחטים מסוג TRO Viejo וחוט תפר עם מחט בעלת חוד חודב, העבר תפר פוליאתילן מתחת לעליל כלי הדם הכלילי השמאלי היורד (left anterior descending coronary artery) ליצירת ליגטורה זמנית שניתן להסירה לצורך רפרפוזיה מתוזמנת; גזור חתיכה באורך 0.5 עד 1 סנטימטר של PE 90 והנח אותה על הלב. קשור את התפר, הלולאה שלו עוברת מתחת לעליל הכלילי, אל הצינורית במקביל לעליל הכלילי. לאחר פרק זמן שנקבע, שחרר את הליגטורה כדי לאפשר רפרפוזיה לביצוע חסימה קבועה.קשרו את התפר שהושחל תחת העורק הכלילי. הלבנה (Blanching) ודיסקינזיה צריכות להיות ניכרות. גזרו את הקצה הארוך של התפר עבור הזרקות תוך-שריריות של השריר הלבבי, והחדירו מחט סטרילית בכיליב 30 gauge לבסיס הלב מעל אזור הפגיעה, מימין לתפר.הנע את המחט אל אזור הפגיעה והבס אותה מעט, כך שהחלק האלכסוני (bevel) ייראה בקירוב באזור הגבול. הזרק כמות קטנה מהתמיסה והחזק את המחט במקומה. הבס את המזרק עוד מילימטר אחד עד שלושה, והזרק את שאר התמיסה.החזיקו את המזרק במקומו עד שיהיה ניתן לראות שהדם שנוצר על ידי התמיסה התפזר. לאחר שהדם התפזר, הוציאו את המחט. אם מתרחש דימום, לחצו בעדינות עם מקלוני צמרon (cotton tipped applicator) על האזור עד להפסקת הדימום.עם השלמת המניפולציות בשריר הלב, הסירו את מרחיבי הצלעות וסגרו את חלל בית החזה באמצעות שתיים עד שלוש תפרים מסוג mattress. לאחר מכן, סגרו את שרירי החזה (pectoralis) באמצעות שתיים עד שלוש תפרים מסוע mattress. טפטפו אחת עד שלוש טיפות של 0.25%marking בתמיסת סליין סטרילית על השריר, והשתמשו בשתיים עד שלוש תפרים מסוג mattress נוספים כדי לסגור את העור.הסיר את העכבר מהוונטילטור וודא כי קיימת נשימה רדודה, מהירה וקצבית. הזרק 0.5 milliliters של סליין סטרילי חם לחלל תת-עורי הגבי, והנח את העכבר בכלוב המכיל פלט heating pad עד שיחזור לו הניידות. עבור ניסויי הישרדות, העכברים מוחזרים לכלובים הביתיים שלהם ולביבליום עד למועד ההקרבה.נגב את המכשירים הכירורגיים עם אתנול והכנס אותם למכשיר עיקור בחרוש (bead sterilizer). כדי להתכונן לניתוח הבא לאיסוף דגימות לניתוח, בודד את הלב ודקור את האזור הבזאלי האחורי של הפרונטריקול (ventricle) באמצעות מחט המכילה תמיסת פוטסיום כלוריד קרה, או תמיסת בוטאן די-און מونوכסיד (butane Dion Monoxide). הזרק את התמיסה לאט אל תוך התא עד לעצירת הלב בשלב הדיאסטולה. הוצא את הלב ובצע פרפוזיה עם PBS כדי להסיר שאריות דם.לאחר הביצוע של הפרפוזיה, טבול את הלב במקבע; לאחר מכן, הלב יעבור עיבוד וטמיקה בהתאם לנהלים השגרתיים. ניתן להדגים את הפגיעה החריפה שנגרמה מהקשירה הזמנית באמצעות צביעה. בתמונה זו, הצבע הכחול מפוזר באזורים החסומים של הלב, וצביעת TTC מסמנת רקמה חיונית מטבוליט).בצבע אדום, אזורים נקרוטיים אינם נצבעים ולכן נותרים בהירים. ניתן להשתמש בתוכנה לדימות כדי לחשב את השטח הנמצא בסיכון כפונקציה של החדר השמאלי, ואת שטח האוטם כפונקציה של השטח הנמצא בסיכון. בדוגמה זו, לב פגוע נחתך לרוחב דרך אזור האוטם, ארבעה ימים לאחר אוטם שריר הלב (mi), ונצבע ב-hemat, hematin, ו-eoin.הכוכבית מציינת נמק של הרקמה בעוד שהחצים מצביעים על צביעת קולגן של רקמת גרנולומה באמצעות prose. ניתן להשתמש ב-Serious red ו-fast green למדידת פיברוזיס אינטרסטיציאלי, אשר נמצא במתאם עם מדדים תפקודיים של קשיחות הדופן. תמונה זו של לב עכבר ארבעה שבועות לאחר mi מראה את הציטופלזמה בירוק ואת סיבי הקולגן באדום.סדרת תמונות זו מייצגת את התהפצותם של שש microliters של תמיסת צבע Evan's blue שהוזרקו לאזור הגבול של הלב לאחר ליגציה קבועה של העורק. שימו לב כי הצבע מתקדם לכיוון הפגיעה וכן לעבר הבסיס, וכן באופן טרנסמוראלי. ויזואליזציה של העורק הכלילי וחסימתו באופן מהימן הן משימות מאתגרות מאוד הדורשות תרגול רב כדי להגיע למיומנות.חשוב מאוד לזכור במהלך הפרוצדורה להימנע מניקור הריאות, ובנוסף להימנע מניתוק צינור ההנשמה (extubation) של בעל החיים במהלך המניפולציות הכירורגיות.

coronary-artery-ligation-intramyocardial-injection-murine-model

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

וידאו זה מדגים כיצד להשתמש במודל מהיר ואמין ללמוד תהליכים pathobiological ו pathophysiological של שריר הלב.

LAD-קשירת: מודל Murine של אוטם שריר הלב

ההליך הניתוחי המשמש ללגרום לאוטם שריר לב בעכברי ניסוי מתחיל בבית חזה שמאלי בין השלישי ואת צלעות 4 כדי להמחיש את המשטח הקדמי של הלב והריאה שמאלית. העורק הכלל שמאלי גבעול, החזה סגור והעכבר מותר להתאושש באופן ספונטני.

טכניקה שונה לקשירת עורקים הכליליים בעכברים

בסרטון זה, אנו מתארים הליך כירורגי ליצירת מודל עכבר של אוטם שריר הלב על ידי קשירת העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי.

יצירת מודל מורין של אוטם שריר הלב: הליך כירורגי לקשירה קבועה של עורק כלילי יורד קדמי שמאלי במודל עכבר

אנחנו מציגים את שיטה כירורגית כדי לגרום לאיסכמיה / reperfusion הניסיוני (I / R) פציעה כדי לדמות אוטם שריר הלב (MI) בעכברי מודל, המאפשר ליותר בהירות במיצוב של קשירה בעורק השמאלי הקדמי יורד (LAD) כדי להגדיל את שחזור ניסויים MI בעכברים.

דגם של שריר הלב איסכמיה reperfusion הפגיעה Murine באמצעות קשירת של העורק השמאלי קדמי יורד

מתואר מודל בעל יכולת שחזור גבוהה לאוטם שריר הלב בעכברים עם מניפולציות פולשניות מינימליות. ניתן לבצע את המודל בקלות, וכתוצאה מכך יכולת שחזור ושיעור הישרדות גבוהים. לפיכך, המודל המתואר יפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים כמתבקש על ידי עקרון 3R (החלפה, עידון והפחתה).

נוהל כירורגי זעיר פולשנית של גרימת אוטם שריר הלב בעכברים

אי ספיקת לב היא הגורם המוביל לאשפוז וגורם עיקרי לתמותה. מודל של קשירה קבועה של העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי בעכברים מיושם כדי לחקור עיצוב מחדש של החדרים ותפקוד לקוי של הלב לאחר אוטם שריר הלב. מוצגת הטכניקה של מדידות המודינמיות פולשניות בעכברים.

קשירת קבע של העורק השמאלי קדמי יורד כלילית בעכברים: דגם של Remodelling אוטם שריר לב ופוסט-אי ספיקת לב

אנו מספקים שיטה אמינה לקשירת העורק היורד הקדמי השמאלי (LAD) במודל עכבר. שיטה זו פחות פולשנית יחסית משיטות אחרות, הכוללת אינטובציה אנדוטרכיאלית, גישת כריתת בית החזה בצד שמאל וניתוח בית החזה. שיטה זו יכולה לשמש כמודל לאוטם שריר הלב החריף והכרוני (MI).

Murine שמאל Anterior יורד (LAD) קשירת עורקים הכליליים: דגם משופר או פשוט עבור אוטם שריר לב

כאן אנו מתארים הליך כירורגי המראה כיצד להשיג הארכה קבועה של עורק שמאלי הקדמי כלילית בעכברים. מודל זה הוא בעל רלוונטיות גבוהה לחקור את הפתופסולוגיה של אוטם שריר הלב ואת התהליכים הביולוגיים המקביל.

מודל אוטם שריר הלב באמצעות הארכה קבועה של עורק שמאלי קדמי כלילי יורד

מוצג כאן הליך כירורגי לקשירה קבועה של העורק הכלילי השמאלי בעכברים. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה ואת התגובה הדלקתית הקשורים לאחר אוטם שריר הלב.

קשירת עורקים כליליים שמאליים: מודל מורין כירורגי של אוטם שריר הלב

משלוח תא intramyocardial במודלים עכבריים של מחלות לב וכלי דם, כגון יתר לחץ דם או אוטם שריר הלב, הוא בשימוש נרחב כדי לבדוק את הפוטנציאל הטיפולי סוגי תאים שונים במחקרי התחדשות של. לכן, תיאור מפורט ויזואליזציה ברורה של הליך כירורגים זה יעזרו להגדיר את הגבולות ואת היתרונות של ניתוחים טיפוליים תא לב וכלי דם במכרסמים קטנים.

משלוח הנייד intramyocardial: תוכן בלבבות Murine

למד טכניקות מיקרוכירורגיות לקשירת עורקים כלילית והזרקה תוך-שרירית בלב עכבר. שיטות אלו מאפשרות חקר פציעת איסכמיה/רפרפוזיה והערכת שיקום לבבי בדגם ממושי.

קשירת עורקים כלילית לבין הזרקת Intramyocardial ב מודל Murine של אוטם

גלה סרטונים נוספים