Name: אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: למד הכנת רקמת מוח לצילום סדרתי תלת-ממדי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם אלומת יונים ממוקדת. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של אזורים ספציפיים במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. לדוגמה קיבוע והטבעה שרף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות של רקמות ותאים טרי קבועים לפחות 2 שעות paraformaldehyde 2% ו -2.5% glutaraldehyde במאגר M 0.1 פוספט ב-pH של 7.4. גודל המדגם לא יעלה על 0.150 מ"מ עובי על מנת לאפשר חדירה מקבע נאותה או, ולא צריך להשאיר לתקן את יותר מ 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דגימות צלוחיות זכוכית scintillation 20ml ולשטוף אותם שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, במאגר cacodylate 0.1M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם 1.5% (w / v) אוסמיום אשלגן tetroxide פרוציאני ו 1% (w / v) במאגר cacodylate 0.1 M (0.1 מ ', pH 7.4) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם tetroxide אוסמיום 1.0% (w / v) במאגר cacodylate 0.1M 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף מיד עם מים מזוקקים כפול 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם 1% (w / v) אצטט uranyl במים מזוקקים כפול במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלקים במשך 5 דקות במים מזוקקים כפול, ולאחר מכן מייבשים בסדרה אלכוהול ציון, 2 דקות כל שינוי (1 x 50%, 1 x 70%, 1% 90 x, 1% 95 x, 2 x 100%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמע בריכוזים הגוברת של שרף Durcupan מעורבב עם אתנול, 30 דקות כל שינוי, החל Durcupan 50% אתנול, לאחר מכן על ידי: 70%, 90%, 95%, ולאחר מכן 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף Durcupan טריים להתסיס לאט במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים מקום, באמצעות מקלות עץ קוקטייל, על מיקרוסקופים שקופיות הזכוכית מצופה סוכן עובש הפרדה, ומכניסים לתנור 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li></ol> 2. הכנת המדגם עבור FIB / SEM <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את שכבת שרף, המכיל את הדגימות, החל בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית ולשטוף ביסודיות כדי להסיר עובש הפרדת סוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ האור המועבר עם מטרות צריכת חשמל נמוכה, או לנתח מיקרוסקופ עם תאורה לשדר, כדי לזהות את האזור של עניין בתוך פרוסה של שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור קטן (3 מ"מ x 3 מ"מ) מרובע סביב האזור של עניין באמצעות סכין גילוח מקל זו לראש לחסום שרף ריק עם דבק אקרילי (איור 1). המתן 5 דקות הדבק להתקשות ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הבלוק לתוך בעל ulramicrotome ו, באמצעות stereomicroscope המצורפת, מטופח סביב האזור של עניין עם סכין גילוח עד פירמידה קטנה בלבד של חומר נשאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לקצץ את הבלוק, בעזרת סכין זכוכית קבוע לתוך ultramicrotome, כך האזור של עניין יכול להיות ממוקם בדיוק ביחס ממדים של פני השטח של בלוק (איור 1). חותכים קצה אחד של הרחוב, קרוב לאזור של עניין, כך צעד בניצב היא לחתוך המדגם (איור 1 ו - 2). צעד זה מהווה את הפנים הדמיה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבלוק מן ultramicrotome ולצלם את האזור של עניין בתוך הבלוק, באמצעות מיקרוסקופ האור המועבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את גוש גזוז הרחק בדל שרף הנותרים. הדבר נעשה באמצעות ראתה של צורף ומבטיח כי רק גוש קטן ממוקם בתוך FIB / SEM. הגובה הכולל של גוש זה לא צריך להיות יותר מ 5 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק לחסום את בדל אלומיניום עם הדבק פחמן להבטיח שהצד להיות צילמו נמצא בקצה החיצוני (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדבק התייבש, המעיל לחסום בשכבה דקה של זהב (&gt; 20 ננומטר, אידוי Cressington שואב אבק). </li></ol> 3. הדמיה של FIB / SEM <ol start="20" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגדלה נמוכה, ושימוש משני אלקטרונים הדמיה (5 kV, 0.5 nAmp), המזרח לחסום כך את האזור שנבחר עניין הצד של הבלוק להיות צילמו עומדת בפני המפעיל (איור 2 ג, ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המזרח לחסום כך את פני להיות צילמו שקרים במקביל הקורה כרסום. זאת אומרת כי אלומת אלקטרונים מכוונת על 54 ° להתמודד עם זה (2 ב איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אלומת יונים הנוכחי של 13-27 nAmps ב kV 30 להסיר רצועה צרה של שרף מהחזית האזור להיות צילמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב הדמיה backscattered להציג את הפנים הסתובבו כי overlies האזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ אור התייחסות תמונה (נלקחה ב שלב 16) ואת התמונה של הפנים הסתובבו לאתר את האזור המדויק ברחוב להיות הסתובבו וצילמו (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקדה שכבת מגן (כ 1 מיקרון עבה) של פחמן (או מתכת), באמצעות מערכת הזרקת דלק של המיקרוסקופ, על פני השטח של הבלוק, מעל האזור של עניין (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש הנוכחי של 700 picoAmps, טחנה עד דק את האזור של גוש שבתוכו תמונות הסופי יילקחו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את קרן כרסום לטחנת לחלוטין את הפנים בתמונה עד אין ממצאים כרסום ניתן לראות על הפנים. מפעל שלם של הפנים נבדק על ידי התבוננות שינויים כל תמונה שלאחר מכן על פני השדה כולו מבט. כרסום לקוי ניתן לראות גם פסים לבנים או "וילונות" המופיע vertically בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את המיקרוסקופ במשך 2 שעות לפחות עבור כל שינוי תרמית להתפוגג. פעולה זו מפחיתה את הסיכון כי הפנים לחסום ייסחף במהלך הדמיה, וכתוצאה מכך תמונות misaligned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרמטרים מיקרוסקופ הדמיה פני סדרתי. ודא כי אלומת אלקטרונים יש מתח כי היא נמוכה מספיק כדי תמונה רק בעומק רדוד מאוד של חומר מול לחסום. זה צריך להיות גם הרבה יותר רדוד יותר בעובי של הפנים כדי להסירו. פרמטרים אופייניים הדמיה הם מתח של בין 1.2-2.0 kV עם גודל פיקסל של בין 4-20 ננומטר. פיקסל לשכון זקוק לזמן כדי להיות כל הזמן סביב 10 μsecs כך את סך כל הזמן אל טחנת הקמח פנים לרכוש תמונה אחת נשמרת מתחת ל -2 דקות (איור 3). </li></ol> 4. סודות להצלחה שלב 1) ודא דוגמאות אינן יותר עבה 150 מיקרון. זה יאפשר חדירה נאותה של כתמים שונים שרף לתוך החומר. זו יכולה להיות מושגת על ידי חתך את דגימות עם vibratome מיד לאחר קיבעון. עובי זה מתאים ברקמת המוח. רקמות אחרות צריכים להיבדק על מנת להבטיח קיבוע מכתים נאותים. שלב 3) דגימות חייב להיות מופץ בחופשיות ברחבי פתרון, ולא בכבדות יחד בחלק אחד של הבקבוקון בעוד זה מקבע המשני הוא הציג. פעולה זו תבטיח חדירה מקסימלית של המדגם ולהפחית את המדגם נעשה מעוות במהלך תהליך זה קיבעון. זו מושגת על ידי בעדינות מתערבל דגימות בתוך הבקבוקון מיד אחרי הפתרון הוא הוסיף. שלב 15) ודא כי האזור של עניין נמצא מיד מתחת (&lt;30 מיקרון) את פני השטח של הבלוק. זה יקטין את כמות הטחינה על ידי יון הקורה בשלב רכישת התמונה. שלב 22) בפעם סריקה של יון הקורה צריך להיות adequte כדי להבטיח את פני הדמיה כולו מחורץ לגמרי. כרסום לקוי יוצגו כמו פסים לבנים, או "וילונות" המופיע אנכית כלפי מטה מול הדמיה. שלב 26) הפנים הסתובבו הסופי חייב להיות גדול יותר מאשר הפנים כי הוא הדמיה. הסיבה לכך היא שרף הסתובבו הוא נפלט מן הבלוק redeposits על פני השטח לחסום בסביבה הקרובה. Redeposition זה יכול לפלוש למגרש הדמיה של נוף, והוא להימנע על ידי כרסום שטח גדול הרבה יותר מאשר היא הדמיה. עבור חלון הדמיה כי הוא 20 מיקרון רחב, הפנים לחסום הסתובבו גדול מ 30 מיקרון רחב. שלב 29) זה קריטי, כי הפרמטרים אלומת אלקטרונים הן כאלה התמונה נוצרת על ידי אלקטרונים העולות רק את ננומטר הראשונים של פני השטח של בלוק. זה acheved ידי מזעור מתח kV להלן 2 ולהבטיח כי האלקטרונים לא לחדור עמוק מדי. זה עזר גם באמצעות מתח רשת על הגלאי כך שרק אלקטרונים עם האנרגיות הגבוהות ביותר לתרום התמונה הסופית. בדרך כלל, מתח רשת של kV 1.3 משמש מתח הדמיה של 1.5 kV. 5. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הכנת לחסום שרף. שרף) מוטבע סעיף העטרה (80 מיקרון עבה) דרך המוח עכברוש מבוגר שנצפו ב steromicroscope. התמונה מראה בבירור את אזורי מוח שונים שניתן לחתוך מהחלק (ב) באמצעות להב סכין המנתחים. כאן, בכיכר 1 מ"מ מהקורטקס מוסר (ג) תקוע לחסום שרף ריק. ד) לחסום שרף חיתוך אז עם סכין זכוכית רכוב ultramicrotome, וברגע לחסום צומצמה רק להשאיר את האזור של עניין (ה), צעד הוא חתך בניצב לפני השטח הקדמי של החומר מוטבע. ו) זה האזור מטופח כולו ואז לחתוך מיתר שרף ועלה על בדל אלומיניום מוכן ציפוי מתכת הדמיה ב סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. הכנת הפנים לחסום עבור FIB / SEM הדמיה. א) ו ב) להראות איורים של הגוש ואת קצה מחורץ כדי ליצור את הפנים הדמיה (מסומן עם החץ בעל שני ראשים שחורים). העמדה של אלומת יונים (לבן) מוצג במקביל מול הדמיה, לבין אלומת אלקטרונים (אפור) מוצג להכות את הפנים על 54 ° עד יון הקורה. ג) מראה תצוגה של גוש שצולמו עם אלומת אלקטרונים הדמיה עם אלקטרונים משניים. יחד בצד הזה של לחסום את אזור כהה יותר (מסומן עם תיבת לבן מנוקד) מראה חלק של הפנים כי כבר הסתובבו בערך (מוצג פעמיים עם ראשעורך חץ שחור) כדי לחשוף את מדגם הבסיס. ד) כאשר אזור זה הוא צילמו רק באמצעות האלקטרונים backscattered רקמת מוטבע ניתן לראות. כאן, רוחב המלא של הסעיף רקמות מוטבע מסומן בחץ כפול לבן בראשותו. בר סולם ב ג) הוא 100 מיקרון. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. הדמיה נפח של רקמת המוח עם voxels איזוטרופיים.) הפוך לעומת backscattered תמונה של הפנים לחסום מראה את ultrastructure בתוך אזור במוח חולדה. ממברנות כל נראים כמו גם מבנים macromolecular גדול. ב) סך של 1600 תמונות שנאספו על המרווח 5 ננומטר וכתוצאה מכך מחסנית תמונה עם voxels איזוטרופיים. ג) מערך זה ניתן הדמיה במישור כלשהו עם רזולוציה זהה. תמונה זו מראה קשר סינפטי יחיד הדמיה במישור xy לבין מטוס YZ.

<ol><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li>
<li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope%3A+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li>
<li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הטכניקה של FIB / SEM הפועלת בצורה אופטימלית כאשר אזור של אינטרס אינו גדול מדי. גבול עליון נפח צילמו תלוי יון הקורה ואת השטח שהוא יכול בעקביות טחנת שוב ושוב במשך שעות רבות. עד כה זה נעשה עם האזורים של סביב 60 x 60 מיקרון, עם זאת, הדמיה זו האזור כולו אינו אפשרי עם רזולוציה תמונה מתאימה, בעיקר בשל גורם הזמן באיסוף כגון תמונה גדולה. כדוגמה, תמונה 4 KX 4 k עם פיקסל להתעכב זמן 10 מיקרו ייקח 2 דקות ו 40 שניות כדי לרכוש, ועל שדה הראייה של 60 מיקרון זה היה רק ​​לתת גודל פיקסל של 15 ננומטר. עבור הדמיה ultrastructure של תאים ורקמות, גודל פיקסל קטן יותר הוא מתאים יותר, בדרך כלל בין 4 ל 10 ננומטר / פיקסל. עבור שטח של 60 x 60 מיקרון התמונה תהיה רכשה 10 שעות, גם אם המיקרוסקופ היה ביכולת זו. מסיבות אלה, המיקרוסקופ הוא כלי אידיאלי עבור כרכים התמונה בסדר גודל של 10 x 10 x 10 מיקרון, או אזורים משמעותי של תאים שלמים. זה יכול להיעשות בקלות בתוך פרק זמן 48 שעות ביממה על דגימות היטב בניגוד הליך זה. עד כה בפרוטוקול שימש בעיקר ברקמת המוח, כמו גם סוגים שונים של בתאי יונקים בתרבית דבקות coverslips. עם זאת, ההליך קיבעון והכתים ניתן להשתמש עם סוגים רבים אחרים של חומר ביולוגי, כולל חומר צמחי לייצר תמונה שווה ערימות היטב בניגוד. לכן היתרון העיקרי של טכניקה זו היא יכולתה כרכים תמונה עם voxels איזוטרופיים. ערימות תמונה מסוג זה לאפשר ניתוחים נפח 3D באמצעות תמונות שצולמו על כל מטוס בערימה. היתרון של זה היא לאפשר את הצופה תכונות תמונה בסדרה את התמונה מכל כיוון ומתן בפירוט תמונה גדולה יותר (איור 3).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Cyanoacrylate דבק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ הביתור: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, גרמניה </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan שרף </td><td> סיגמא אולדריץ Chemie GmbH, שוויץ </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM מיקרוסקופ (Zeiss, NVision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> זכוכית היסטולוגיה שקופיות </td><td> Menzel-גלזר, גרמניה </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> סכין יצרנית הזכוכית: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, גרמניה </td><td></td></tr><tr><td> צלוחיות זכוכית scintillation (20ml) </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyde </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> התכשיטן של ראה </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Mould הפרדת סוכן </td><td> Glorex, שוויץ </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> אוסמיום tetroxide </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> פוספט מלחי פוספט עבור חיץ </td><td> סיגמא אולדריץ Chemie GmbH, שוויץ </td><td> 71642 ו 71496 </td></tr><tr><td> נתרן cacodylate </td><td> סיגמא אולדריץ Chemie GmbH, שוויץ </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> גמגום Coater עם יעד זהב </td><td> Cressington, ארה&quot;ב </td><td></td></tr><tr><td> טריס הבסיס (TBS) </td><td> סיגמא אולדריץ Chemie GmbH, שוויץ </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotome: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, גרמניה </td><td></td></tr><tr><td> Uranyl אצטט </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

פרוטוקול זה מתאר כיצד דגימות ביולוגיות, כמו רקמת המוח, ניתן הדמיה בשלושה ממדים באמצעות אלומת יונים ממוקדת / סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (FIB / SEM). הדגימות הם קבועים עם מוכתם, אלדהידים מתכות כבדות באמצעות tetroxide אוסמיום ו אצטט uranyl. הם מיובש אז עם אלכוהול הסתננו עם שרף, שהוא מוקשה אז. באמצעות מיקרוסקופ אור ultramicrotome בסכינים זכוכית, בלוק קטן המכיל את הריבית באזור קרוב לפני השטח הוא עשה. הבלוק ממוקם אז בתוך FIB / SEM, ואת אלומת יונים בעבר טחנת בערך פנים אנכי לאורך צד אחד של הרחוב, קרוב לאזור זה. שימוש אלקטרונים backscattered לתמונה מבנים הבסיסית, פנים קטנות מחורץ אז עם אלומת יונים עדינה השטח בחנו מקרוב יותר כדי לקבוע את האזור המדויק של פני להיות צילמו ו מחורץ. הפרמטרים של המיקרוסקופ נקבעים אז כך את פניו מחורץ שוב ושוב צילמו כך שהתמונות סדרתי נאספים דרך בהיקף של הבלוק. מחסנית התמונה תהיה בדרך כלל מכילים voxels איזוטרופיים עם ממדים קטנים כמו ננומטר 4 לכל כיוון. זו איכות התמונה במישור כלשהו הדמיה מאפשרת למשתמש לנתח ultrastructure תא בכל זווית צפייה בתוך ערימה של התמונה.

פרוטוקול זה מתאר כיצד מוטבע שרף רקמת המוח יכול להיות מוכן צילמו בשלושת המימדים אלומת יונים ממוקדת, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן לדמות דגימות ביולוגיות, כגון רקמת מוח, בתלת-ממד באמצעות קרן יונים ממוקדת/מיקרוסקופ אלקטרונים סורק...

מטרת פרוצדורה זו היא לאסוף סדרת תמונות מאזור ספציפי של רקמת מוח באמצעות קרן יונים ממוקדת (focused ion beam) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק. פעולה זו מתבצעת תחילה על ידי חיתוך המוח לפרוסות העוברות צביעה ולאחר מכן השקה בשרף. השלב השני הוא חיתוך אזור העניין מהפרוסה המושהית בשרף והרכבתו על גבי בלוק שרף ריק.השלב השלישי הוא קיצוץ של בלוק השרף באמצעות אולטרה-מיקרוטום ושימוש בקרן היונים של המיקרוסקופ כדי לבודד רק את האזור המיועד לדימוי. השלב הסופי הוא ביצוע דימוי סדרתי של פני השטח של בלוק השרף, תוך שימוש בקרן היונים להסרה חוזרת של שכבות דקות לפני כל צילום. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המציגות תמונות סדרתיות דרך אזור העניין.סדרת התמונות נאספת באופן אוטומטי ומערך הנתונים כולל בדרך כלל ווקסלים איזוטרופיים, כך שניתן לצפות במבני התמונה מכל זווית בערימה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה אלקטרונית בשידור של חתכים סדרתיים הוא היכולת להשיג רזולוציית Z גבוהה בהרבה. ובהשוון לטומוגרפיה אלקטרונית, היא מסוגלת לדגם נפחים גדולים בהרבה ברזולוציה אופטימלית עבור דגימות המושרות בשרף.הפרוצדורה מתחילה בהוצאת המוח המקובע מחולדה שהורדמה ועברה פרפוזיה. טמנו את המוח ב-5% aros חמים בתוך תבנית פלסטיק, כוונו את המוח לזווית הנכונה לפני שה-aros התקשה, והצמידו את בלוק ה-aros עם המוח בתוכו למחזיק דגימות באמצעות vibrato slice. בצעו חיתוכים קורונליים בעובי 80 micron, וחתכו מספר חתכים ככל שנדרש כדי לכלול את אזור העניין.לאחר מכן, העבירו את הדגימות למבחנות בידוד מזכוכית בנפח 20 milliliter. הניחו עד 10 חתכים בכל מבחנה. שטפו את הדגימות שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם בבופר K coate בריכוז 0.1 molar.לאחר מכן, צבע את הדגימות ב-1.5% potassium cyanide ו-1% osmium tetroxide בבופר K coate בריכוז 0.1 molar למשך 30 דקות. המשך בצביעת הדגימות ב-1% osmium Tetroxide בבופר K coate בריכוז 0.1 molar למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטוף פעם אחת במים מזוקקים פעמיים למשך שלוש דקות, ולאחר מכן צבע ב-1% al acetate במים מזוקקים פעמיים למשך 30 דקות.לאחר מכן, שטפו את החתכים במשך חמש דקות במים מזוקקים פעמיים, ואזבצעו להם דהידרטציה בסדרה מדורגת של אלכוהול, תוך המתנה של שתי דקות לכל החלפה. השלב הבא הוא הטמעת החתכים בריכוזים עולים של שרף Duran המעורב עם אלכוהול, תוך המתנה של 30 דקות בין ההחלפות. התחילו ביחס של 50 ל-50 של אתנול לשרף, לאחר מכן 30 ל-70, לאחר מכן 10 ל-90, ולבסוף העבירו את החתכים ל-100% שרף למשך 30 דקות.לאחר מכן, החליפו את המדיום ב-100% fresh duran resin. ערבבו באיטיות במשך שעה במיקסר גלגלי. לאחר ההטמעה, השתמשו במקל דереק דק כדי להניח את החתכים על תזרירי מיקרוסקופ מזכוכית שצופו מראש בחומרי הפרדה מהתבנית.הניחו כמה שיותר חתכים על הזכוכיות, אך הקפידו לא להעמיס עליהן יתר על המידה. ודאו שמוצמדת גם תווית זיהוי בין זכוכיות המיקרוסקופ. הכניסו את הזכוכיות לתנור בטמפרטורה של 65 degree Celsius למשך 24 שעות.ביום למחרת, הוציאו את הדגימות מהתנור. דחפו בעדינות להב תער בין זכוכיות המיקרוסקופ והסירו את שכבת השרף המכילה את הדגימות מבין הזכוכיות, תוך החזקת שכבת השרף באצבעותיכם. שטפו בעדינות את הדגימה תחת זרימת מים.כדי להסיר חומרי הפרדה מהתבנית, הנח את הדגימה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי עם תאורה חודרת תוך שימוש בעדישה בעלת הגדלה נמוכה. סמן את אזור העניין באמצעות מחט דקה. השתמש בלהב תער כדי לחתוך ריבוע קטן של 3 מילימטר על 3 מילימטר סביב אזור העניין.השתמשו בדבק אקרילי כדי להצמיד את בלוק הרזין הקטן לחלקו העליון של בלוק רזין ריק. לאחר מכן, הדקו את הבלוק במחזיק של המיקרוטום האולטרה (ultra microtome). התבוננו דרך מיקרוסקופ הסטריאו המחובר, והשתמשו בלהב תער כדי לגזום את האזור מסביב לאזור העניין עד שיישאר רק פירמידה קטנה של חומר.חתכו את קצה הבלוק קרוב לאזור העניין בזווית למשטח העליון של הבלוק באמצעות סכין זכוכית מקובעת לאולטרה-מיקרוטום. טרמו את הבלוק עוד יותר כך שניתן יהיה למקם את אזור העניין במדויק ביחס לממדי משטח הבלוק. הוציאו את הבלוק מהאולטרה-מיקרוטום והניחו אותו תחת מיקרוסקופ אור חודר.צלמו את אזור העניין. השתמשו במסור תכשיטנים כדי לחתוך את הבלוק המקוצץ מהבסיס שנותר של השרף באמצעות צבע פחמן. הדביקו את הבלוק המופרד על מחזיק דגימות ל-SEM וכוונו אותו כך שהצד המיועד לדימוי יפנה אל הקצה החיצוני ביותר.לאחר שהדבק התייבש, העבירו את הדגימה למערכת של וקואקום-אוואפורציה (vacuum evaporation) וצפו את הבלוק בשכבה דקה של זהב בעובי של יותר מ-20 nanometers. בלוק הרקמה הטמיע בשרף מוכן כעת לדימוי במיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם אלומת יונים ממוקדת (focused ion beam scanning electron microscope). הכניסו את הדגימה בתוך התושבת שלה למיקרוסקופ בהגדלה נמוכה, ובאמצעות דימוי אלקטרונים משניים, כווןו את הבלוק כך שהאזור המבוקש והצד של הבלוק המיועד לדימוי יהיו פונים כלפי מעלה.המפעיל מכוון את הבלוק כך שהפנים שיוצג בדמיון יהיה מקבילי לקרן הכרסום. כתוצאה מכך, קרן האלקטרונים תכוון בזווית של 54 מעלות לפנים זה, תוך שימוש בזרם קרן יונים של 13 עד 27 nano amps, במתח של 30 kilovolts.הסר פס צר של שרף מהחלק הקדמי של האזור המיועד לדימות. לאחר מכן, עבור למצב דימות של פליטה אחורית (back scattered imaging) כדי לצפות בפני השטח שנשחרו מעל אזור העניין. באמצעות תמונת הייחוס מהמיקרוסקופ האורי כך ותמונת הפנים שנשחרו, אתר את האזור המדויק בבלוק שישוחח וידומת באמצעות מערכת הזרקת הגז של המיקרוסקופ.השקיעו שכבת הגנה בעובי של מיקרון אחד של פחמן או מתכת על פני השטח של הבלוק מעל אזור העניין, תוך שימוש בזרם של 700 picoamps. לבסוף, בצעו כרסום (milling) לאזור בבלוק שבו יצולמו התמונות הסופיות. אפשרו לקרן הכרסום לכרסם לחלוטין את פני התמונה עד שלא ניתן יהיה לראות שרידי כרסום (milling artifacts) על פני השטח.בחרו את פרמטרי המיקרוסקופ לצילום סדרתי של הפנים. פרמטרים טיפוסיים הם מתחים בין 1.2 ל-2 kV עם גודל פיקסל שבין 4 ל-20 nm. זמן השהיית הפיקסל צריך להיות בסביבות 10 µs, כך שהזמן הכולל לשיוף הפנים ולהשגת תמונה אחת יהיה פחות משתי דקות.השאירו את המיקרוסקופ למנוחה למשך שעתיים לפחות כדי לאפשר התייצבות של שינויים תרמיים. כדי לפזרם, התחילו בתהליך הכרסום והדימוי לצורך רכישת סדרת תמונות דרך אזור העניין. איור זה מציג תמונת פיזור לאחור (back scattered) בניגודיות הפוכה של פני הבלוק, המראה את העל-מבנה בתוך אזור במוח העטוף.כל הממברנות נראות, כמו כן מבנים מקרו-מולקולריים גדולים. איור זה מורכב מסך של 1,600 תמונות שנאספו במרווחים של חמישה ננומטרים, מה שיוצר ערימת תמונות עם ווקסלים איזוטרופיים. ניתן לדגם ערימה זו בכל מישור באותה רזולוציה.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת רקמת מוח לצילום סדרתי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם אלומה ממוקדת (FIB-SEM).

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

קח קטע קבוע של רקמת מוח קליפת המוח של עכבר המציג אקסונים עצביים ודנדריטים. לדנדריטים יש בליטות, הידועות כקוצים דנדריטיים, היוצרות סינפסות עם אקסונים. דגרו על הרקמה עם אוסמיום-פרוציאניד, הנקשר לשומנים, ואחריו מריחת אוסמיום נוספת, המשפרת את הניגודיות המבנית להדמיה. מכתים בתרכובת מתכת כבדה הנקשרת למקרומולקולות ומשפרת את הניגודיות. התייבש באמצעות הגדלת ריכוזי אלכוהול להטמעת שרף. הטמע את הרקמה בשרף, הרכיב אותה על מחזיק וצפה אותה בזהב כדי לייעל את איכות ההדמיה. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן...

מיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת קרן יונים ממוקדת לשחזור תלת מימד של נוירונים מקושרים סינפטית

סרטון זה מדגים שיטה לחקור פגיעה מוחית של זחלי זברה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים להעברת שידור בקנה מידה גדול (STEM), טכניקה המשלבת אלמנטים של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בהכנת דגימות וברכישת תמונות STEM ברזולוציה גבוהה לזיהוי פגיעה מוחית.

חקירת פגיעה מוחית של זחל זברה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בקנה מידה גדול

מיקרוסקופ אלקטרונים דו-ממדי בקנה מידה גדול (EM), או ננוטומיה, הוא יישום כלל-רקמתי של EM ברזולוציה ננומטרית. כאן אנו מתארים שיטה אוניברסלית לננו-טומיה המיושמת כדי לחקור את מוח זחל דג הזברה בבריאות ובפגיעה מוחית לא פולשנית.

סריקה הילוכים בקנה מידה גדול מיקרוסקופית אלקטרונים (Nanotomy) של בריאה ונפצעו דג הזברה המוח

הדמיה וניתוח מיטוכונדריאלי מרקמת מוח של יונקים היא משימה מאתגרת. כאן, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בניתוח שחזור תלת מימדי (תלת מימד) ממיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוק סדרתי (SBFSEM) כדי לקבל תובנות על הניתוח המורפולוגי והנפחי של אברון ייצור אנרגיה קריטי זה.

ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

מאמר זה מתאר שיטה פשוטה כדי להתכונן מוח בעל חיים קטן מיקרו-CT הדמיה, פצעים אשר ניתן לכמת, אלקטרודות הממוקם עם דיוק גבוהה בהקשר של המוח כולו.

שיטה המבוססות על מיקרו-CT אפיון נגעים ואיתור אלקטרודות במוח בעלי חיים קטנים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשילוב יעיל של פנים בלוקים סדרתיים וקרן יון ממוקדת סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני כדי למקד את אזור העניין. זה מאפשר חיפוש יעיל, בשלושה ממדים, ואיתור אירועים נדירים בתחום השקפה גדול.

לימודי ממוקדות באמצעות פנים בלוק טורי וקרן יון ממוקדת סריקה אלקטרון מיקרוסקופ

הצגנו כי תחריט של הננו-ארכיטקטורה לתוך התקנים מיקרו-אלקטרודה תאיים עשוי להפחית את התגובה הדלקתית ויש לו את הפוטנציאל לשפר הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. השיטות המתוארות כאן מתווה גישה לחרוט ננו-ארכיטקטורות לפני השטח של מיקרואלקטרודות שאינן תפקודי ופונקציונלי בודד.

ליתוגרפיה של קרן יון ממוקדת לחרוט ננו-ארכיטקטורות למיקרואלקטרודות

כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.

הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

זרימת עבודה זו מאפשרת ייצור למלה המכוון למבנים ביולוגיים בעלי תווית פלואורסצנטית שהם קטנים (&lt;1 מיקרומטר בהיקף צירי) ונדירים (עותק אחד לתא) באמצעות פלטפורמת הדמיה תלת-צירית קריוגנית. פלטפורמה זו משלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כרסום קרן יונים ממוקדת ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק במיקום מוקד יחיד ומאפשרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית בזמן הכרסום.

זרימת עבודה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אלקטרונים וקרן יונים קריוגני לכרסום ממוקד של תאים

הצגנו טכניקת הדמיה חדשנית בשם Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), המאפשרת הדמיה ללא הטיה של כל התאים בדגימות מוח בקנה מידה מדום וניתן לשלבה בצורה חלקה בזרימת הדמיה של מיקרוסקופ אלקטרונים סרטורי מבוסס סרט על אותה דגימה.

שיטת הדמיה אופטית התואמת למיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת למיפוי מוח תאי מזוסקופי

למד הכנת רקמת מוח לצילום סדרתי תלת-ממדי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם אלומת יונים ממוקדת. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של אזורים ספציפיים במוח.

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

גלה סרטונים נוספים