אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח
6 ביולי 2011
פרוטוקול זה מתאר כיצד מוטבע שרף רקמת המוח יכול להיות מוכן צילמו בשלושת המימדים אלומת יונים ממוקדת, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.
מטרתו של הליך זה היא לאסוף תמונות סדרתיות דרך אזור ספציפי של רקמת מוח באמצעות קרן יונים ממוקדת (focused ion beam) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק. דבר זה מושג תחילה על ידי חיתוך המוח לפרוסות הצבועות ולאחר מכן מוטמעות בשרף. השלב השני הוא חיתוך אזור העניין מתוך פרוס המוח המוטמע והצמדתו לבלוק שרף ריק.
השלב השלישי הוא קיצוץ של בלוק השרף באמצעות מיקרוטום אולטרה (ultra microtome) ושימוש בקרן הייונים של המיקרוסקופ כדי לבודד רק את האזור המיועד לדימוי. השלב הסופי הוא דימוי סדרתי של פני בלוק השרף, תוך שימוש בקרן הייונים להסרה חוזרת של שכבות דקות לפני כל תמונה הנלקחת. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המציגות תמונות סדרתיות דרך אזור העניין.
סדרת התמונות נאספת באופן אוטומטי ומערך הנתונים כולל בדרך כלל ווקסלים איזוטרופיים, כך שניתן לצפות במבני התמונה מכל זווית בערימה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית בשידור של חתכים סדרתיים, הוא היכולת להשיג רזולוציית Z גבוהה בהרבה. ובהשוואה לטומוגרפיה אלקטרונית, היא מאפשרת לדגום נפחים גדולים בהרבה ברזולוציה אופטימלית עבור דגימות הטמעות בשרף.
ההליך מתחיל בהוצאה של המוח המקובע מחולדה שהורדמה ועברה פרפוזיה. טמיעו את המוח ב-5% aeros חמים בתוך תבנית פלסטיק, כווןו את המוח לזווית הנכונה לפני שה-aeros התקשה, והרכיבו את בלוק ה-aeros עם המוח בתוכו על מחזיק דגימות באמצעות vibrato slice. חתכו נתחים קורונליים בעובי 80 micron, במספר הנתחים הדרוש כדי לכלול את אזור העניין.
בשלב הבא, העבירו את הדגימות לבקבוקי בידוד מזכוכית בנפח 20 milliliter. הניחו עד 10 חתכים בכל בקבוק. שטפו את הדגימות שלוש פעמים, למשך חמש דקות בכל פעם, בבופר K coate בריכוז 0.1 molar.
לאחר מכן, צבע את הדגימות עם 1.5% potassium cyanide ו-1% osmium tetroxide בבופר K coate בריכוז 0.1 molar למשך 30 דקות. המשך לצבוע את הדגימות עם 1% osmium tetroxide בבופר K coate בריכוז 0.1 molar למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטוף פעם אחת במים מזוקקים פעמיים למשך שלוש דקות, ולאחר מכן צבע עם 1% al acetate במים מזוקקים פעמיים למשך 30 דקות.
בשלב הבא, שטפו את הפרוסות במשך חמש דקות במים מזוקקים פעמיים, ולאחר מכן בצעו להם דהידרציה בסדרה מדורגת של אלכוהול, עם המתןה של שתי דקות לכל החלפה. השלב הבא הוא הטמעה של הפרוסות בריכוזים עולים של שרף Duran המעורבב עם אלכוהול, עם המתןה של 30 דקות בין ההחלפות. התחילו ביחס של 50 ל-50 אתנול לשרף, לאחר מכן 30 ל-70, לאחר מכן 10 ל-90, ולבסוף העבירו את הפרוסות ל-100% שרף למשך 30 דקות.
לאחר מכן, החליפו את המצע ב-100% fresh duran resin. ערבבו באיטיות במשך שעה במיקסר גלילי (roller mixer). לאחר ההטמעה, השתמשו בקיסם עץ כדי להניח את החתכים על זכוכיות מיקרוסקופ שנמחו מראש בחומרי הפרדה עבור התבנית.
הניחו כמה שיותר חתכים על השקופיות, אך היזהרו לא להעמיס עליהן יותר מדי. ודאו שמונח תווית זיהוי גם בין השקופיות. הכניסו את השקופיות לתנור בטמפרטורה של 65 °C למשך 24 שעות.
למחרת, הוצא את הדגימות מהתנור. דחוף בעדינות להב תער בין זכוכית השקופיות והסר את שכבת השרף המכילה את הדגימות מבין השקופיות תוך כדי החזקת שכבת השרף באצבעותיך. שטוף בעדינות את הדגימה תחת מי ברז.
כדי להסיר חומרי הפרדה של התבנית, מקמו את הדגימה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי עם תאורה חולפת באמצעות עדשה בעלת הגדלה נמוכה. סמנו את האזור הרלוונטי באמצעות מחט עדינה. השתמשו בלהב תער כדי לחתוך ריבוע קטן של 3 millimeter על 3 millimeter מסביב לאזור הרלוונטי.
השתמשו בדבק אקרילי כדי להצמיד את בלוק השרף הקטן לחלקו העליון של בלוק שרף ריק. לאחר מכן, קבעו את הבלוק בעזרת תפסן למחזיק של המיקרוטום העילי (ultra microtome). הביטו דרך מיקרוסקופ הסטריאו המחובר, והשתמשו בלהב תער כדי לגזום את האזור מסביב לאזור העניין עד שיישאר רק פירמידה קטנה של חומר.
חתכו את קצה הבלוק קרוב לאזור העניין בזווית למשטח העליון של הבלוק באמצעות סכין זכוכית המקובעת לאולטרה-מיקרוטום. טרמו את הבלוק עוד יותר כך שניתן יהיה למקם את אזור העניין בדיוק ביחס לממדי משטח הבלוק. הסירו את הבלוק מהאולטרה-מיקרוטום והניחו אותו תחת מיקרוסקופ אור תבנית.
צלמו את אזור העניין. השתמשו במסור צורפים כדי לחתוך את הבלוק המגולח מהשארית של השרף באמצעות צבע פחמן. הצמידו את הבלוק המופרד למחזיק דגימות של SEM וכוונו אותו כך שהצד המיועד לדימות יפנה אל הקצה החיצוני ביותר.
לאחר שהדבק התייבש, העבירו את הדגימה למערכת של אידוי בוואקום בשיטת crescent וצפו את הבלוק בשכבת זהב דקה העולה על 20 nanometers. בלוק הרקמה הטמיע ברזין מוכן כעת לצילום במיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם קרן יונים ממוקדת (focused ion beam scanning electron microscope). הכניסו את הדגימה בתוך התושבת למסמך בהגדלה נמוכה, ובעזרת דימוי אלקטרונים משניים, כווןו את הבלוק כך שהאזור המבוקש והצד של הבלוק המיועד לצילום יפנו כלפי המכשיר.
המפעיל מכוון את הבלוק כך שהפנים המיועדת לדימוי תהיה מקבילה לאלומה השוחקת. כתוצאה מכך, אלומה האלקטרונים תיותנה בזווית של 54 מעלות לפני זה, תוך שימוש בזרם אלומה יונית של 13 עד 27 nano amps, במתח של 30 kilovolts.
הסיר פס צר של שרף מהחלק הקדמי של האזור המיועד לדימות. לאחר מכן, עבור למצב דימות של פליטה אחורית (back scattered imaging) כדי לצפות בפנים השחון המכסה את אזור העניין. באמצעות תמונת הייחוס מהמיקרוסקופיה האופטית שצולמה קודם לכן ותמונת הפנים השחון, אתר את האזור המדויק בבלוק שישוחן וידומת באמצעות מערכת הזרקת הגז של המיקרוסקופ.
השקיעו שכבת הגנה בעובי של מיקרון אחד של פחמן או מתכת על פני השטח של הבלוק מעל האזור המדובר, תוך שימוש בזרם של 700 picoamps. לבסוף, בצעו כרסום (milling) של אזור הבלוק ממנו ילקחו התמונות הסופיות. אפשרו לקרן הכרסום לכרסם לחלוטין את פני התמונה עד שלא ייראו יותר ארטיפקטים של כרסום על פני השטח.
בחר את פרמטרי המיקרוסקופ לצילום סדרתי של הפנים. הפרמטרים הטיפוסיים הם מתחים שבין 1.2 ל-2 kV עם גדלי פיקסלים שבין 4 ל-20 nm. זמן השהייה של הפיקסל (pixel dwell time) צריך להיות סביב 10 µs כדי שסך הזמן להכרסום של הפנים ולהשגת תמונה אחת יהיה פחות משתי דקות.
הניחו למיקרוסקופ לנוח למשך שעתיים לפחות כדי לאפשר התKבצעות של שינויים תרמיים. לאחר מכן, התחילו בתהליך השחייה (milling) והדמיה כדי לרכוש סדרת תמונות של אזור העניין. איור זה מציג תמונת פיזור לאחור (back scattered image) בניגוד הפוך של פני השבב, המראה את העל-מבנה בתוך אזור במוח העטוף.
כל הממברנות נראות, כמו גם מבנים מקרו-מולקולריים גדולים. איור זה מורכב מסך כולל של 1,600 תמונות שנאספו במרווח של חמישה ננומטר, מה שיוצר מחסנית תמונות עם ווקסלים איזוטרופיים. ניתן לדגום מחסנית זו בכל מישור באותה רזולוציה.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הכנת רקמת מוח עבור הדמיה סדרתית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם קרן ממוקדת.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את ההכנה והדימות של רקמת מוח מוטמעת בשרף בתלת-ממד באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בעל אלומת יונים ממוקדת. שיטה זו מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה של אזורי מוח ספציפיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- טכניקות דימות
- היסטולוגיה
רקע
- מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת עם קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) מציעה יתרונות על פני שיטות דימוי מסורתיות.
- היא מספקת רזולוציית Z גבוהה יותר ויכולת לדמיין נפחים גדולים יותר של דגימות הטמעות בשרף.
- טכניקה זו שימושית במיוחד לחקר ארכיטקטורת רקמת המוח.
- דימוי סדרתי מאפשר ניתוח מקיף של אזור העניין.
מטרת המחקר
- לאסוף סדרות של תמונות מרקמת מוח לצורך ניתוח מבני מפורט.
- להדגים שיטה המשפרת את רזולוציית הדימוי ואת היכולת לסרוק נפחים.
- להקל על חקר אזורי מוח ספציפיים בהקשר תלת-ממדי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה והטמעה של רקמת מוח בשרף.
- חיתוך סדרתי וצביעה של פרוסות מוח.
- קיצוץ והרכבה של בלוק השרף לצורך דימות.
- דימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בעל אלומת יונים ממוקדת (FIB-SEM).
תוצאות עיקריות
- איסוף מוצלח של סדרת תמונות דרך אזור העניין.
- השגת דימות ברזולוציה גבוהה עם ווקסלים איזוטרופיים.
- הוכחת יכולת להדמיות של מבנים מזוויות מרובות.
- התוצאות מראות שיפור משמעותי לעומת שיטות דימות מסורתיות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לדימות של רקמת מוח הטמעה בשרף.
- מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת עם אלומת יונים ממוקדת (FIB-SEM) יעילה למחקרים מבניים מפורטים.
- טכניקה זו יכולה להעמיק את הבנתנו לגבי ארגון רקמת המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת עם אלומת יונים ממוקדת (FIB/SEM) מאפשרת דימוי תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של רקמת מוח עם ווקסלים איזוטרופיים קטנים עד כדי 4 nm, ובכך תומכת בניתוח אולטרה-מבני מפורט. יכולת זו משפרת את תיקוף המטרה בתהליכי גילוי תרופות למדעי המוח על ידי אספקת תובנות מכניסטיות לגבי הארכיטקטורה התאית והפתולוגיה. השיטה משפרת את רמת הביטחון החזויה במודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה של מבני רקמה מזוויות מרובות ללא ארטיפקטים של חיתוך.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה מפורטת של אולטרה-מבנה התא ומקבצים מקרו-מולקולריים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי חשיפת מטרות מבניות בהקשר הרקמתי הטבעי שלהן.
- ערך ניבוי: משפר את רמת הוודאות לגבי המטרה על ידי מתן אפשרות לניתוח רקמה מכל זווית צפייה בתוך ערימת התמונות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר מערכי נתונים של תמונות סטנדרטיים הניתנים לשחזור ומתאימים לניתוח מורפומטרי כמותי.
- מדרגיות: מאפשר הדמיה של נפחים גדולים יותר מאשר טומוגרפיה אלקטרונית ברזולוציה אופטימלית עבור דגימות המושרות בשרף.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מייצר ערימות תמונות סדרתיות שניתן לניתוח חוזר עבור יעדים או מסלולים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על נאמנות מבנית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות רזולוציית ווקסלים איזוטרופית.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהירה קשרי מבנה-תפקוד ברקמת מוח כדי להנחות את בחירת המטרה.
- קידום מותאם סיכונים: תומכת בהחלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים מבניים בנאמנות גבוהה על מערכות רלוונטיות למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
FIB/SEM משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד להדמיה פרה-קלינית, ומאפשר ניתוח מבני המנחה את זיהוי המולקולות המובילות ומחקרי מנגנונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות ויזואליזציה של מבנים תת-תאיים בנפחי רקמה שלמים.
- סריקה: מספקת מערכי נתונים תלת-ממדיים כמותיים ואיזוטרופיים המאפשרים השוואה מהימנה של פנוטיפים מבניים בין תנאים שונים.
- אנליטיקה: מספקת דימות סדרתי ברזולוציה של סדר גודל ננומטרי, המאפשרת מדידות מורפומטריות מדויקות וניתוח סטטיסטי של ארכיטקטורת הרקמה.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאים מבניים משלב הגילוי למודלים פרה-קליניים באמצעות דימות עקבי וברזולוציה גבוהה של רקמת מוח.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת יכולת דימות הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרים אורכיים של מעורבות מטרות טיפוליות ותגובת רקמה.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במחקרי רקמת מוח.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות וסטנדרטיזציה באמצעות זרימות עבודה אוטומטיות של חיתוך סדרתי והדמיה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור הדמיות בנפח גדול ברזולוציה גבוהה, ובכך מפחית את הצורך במספר טכניקות משלימות.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתונים מבניים מפורטים על מעורבות המטרה ופתולוגיה של הרקמה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיסטולוגיה, הטמעה בשרף וטכניקות של מיקרוסקופיה אלקטרונית.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים אלקטרוניים סורקים בעלי קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) עם מערכות הזרקת גז וציפוי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולי הכנת דגימות, צביעה והטמעה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה לאזורי מוח שונים או למודלים של מחלות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון זמני עיבוד ממושכים והצורך בציפוי מוליך לפני ההדמיה.
