דחיית רקע הקרינה תהודה ו microspectroscopy ראמאן ספונטנית

מטרת הליך זה היא להקים שער אופטי מלא המעביר אור מפזור רמאן תוך חסימת אותים פלואורסצנטיים. דבר זה מושג תחילה על ידי עירור וקיטוב של פיזור הרמאן. השלב השני של ההליך הוא הכנת קרן המשא (pump beam) להפעלת השער.

שלישית, יש לכוון את המשאבה, את הבוכנה ואת הפולסים כך שיהיו חופפים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא רכישת ספקטרומים עם שער זמן (time gated spectra). בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות כימות וסיווג ביוכימיים באמצעות ניתוח אותות רמנאך עם יחסי אות לרעש גבוהים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הסרה תוכנתית של רקע הפלואורסצנציה, הוא שרעש הירי (shot noise) הנוצר מהפלואורסצנציה מופחת באופן משמעותי. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומים ביולוגיים וביו-רפואיים, כגון אפיון לא פולשני של ההרכב הכימי של פלואורורים אנדוגניים בתאי חיידקים ורקמות, והבנת תהליכים תאיים ומחלות כגון סרטן, מחלות וסקולריות או מחלות ניו روندגנרטיביות באמצעות שימוש בסמנים פנימיים. שיטה זו עשויה לסייע גם בפיתוח גשושים חדשים שיכולים לשמש הן כתוויות פלואורסצנציה והן כתוויות RAM, וכן עבור חיישנים רפואיים לא פולשניים לניתוח דם.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מערכות ביולוגיות עבור הנדסה ביו-במדיסית, ניתן ליישמה גם בתחומים אחרים כגון דלקים ביולוגיים, מחקר או תעשיית התקשורת. דגימות ביולוגיות מונחות בדרך כלל על כיסוי זכוכית (cover slip) בעובי מספר 1 המותקן בתא ATO Fluor.

דגימות נוזליות, ובמיוחד אלו הרעילות לבני אדם, מונחות בבקבוק זכוכית קטן עם כיסוי זכוכית (cover slip) המודבק לפתח באמצעות אפוקסי סיליקון, ולאחר מכן הופכות לצורך המדידה. מניחים את הדגימות על הבמה המשנית המותקנת מעל במת המיקרוסקופ, לה יש בקרת פוקוס עצמאית, על מנת לקבל ספקטרומי רמן עם שער זמן (time gated). ראשית, יש להכין כראוי את קרן העירור. מתחילים עם אור היוצא מלייזר ספיר sapphire פולסטי כיוון באופן הדינמי בהספק של 2.4 watt. לכל פולס ברכבת הפולסים בתדר 80 megahertz צריכה להיות אנרגיה של 30 nano joules, רוחב זמני של 140 femtosecond וספקטרום המרכזו ב-808 nanometers עם רוחב פס ספקטרלי של כ-6 nanometers. כדי למנוע מהחזרים אחוריים להיכנס מחדש לחלל הלייזר, יש להעביר את האור דרך מבודד פאראדיי (Faraday isolator). מניחים לוח חצאי גל (half wave plate) לפני מבודד הפאראדיי כדי לאפשר כיוון רציף של הספק הכולל הנשלח למערכת.

מכיוון שרוחב פס של ששה ננומטרים הוא רחב מדי כדי להבחין ברוב מצבי הרמן, הקרינה נשלחת דרך מסנן פס-מעבר צר מאוד. שלחו אותה באורך גל של 808 ננומטרים. לאחר מכן, השתמשו בדובלט אכרומטי כדי למקד את האור על גבי גביש בטא בריליום בוראת ברוחב חמישה מילימטרים.

השתמשו בגביש להכפלת תדר כדי להקטין את אורך הגל מחצי מ-808 ננומטרים ל-404 ננומטרים. מקמו את גביש ה-beta barium borate במחזיק עם בקרת הטיה וכיוון (tip and tilt), המותקן על במה להזזה (translation stage). כדי למקסם את יעילות המרת אורך הגל, יש למקם את הגביש באופן סימטרי ומדויק סביב המוקד של הדוֹבּלט, כאשר ציר הגביש מיושר לפי הקיטוב של הקרן הנכנסת.

מכיוון שהיעילות של המרת האור תלויה בקיטוב, ניתן להשיג שליטה על כמות האור הנשלחת לדגימה על ידי הצבת לוחית חצי-גל שנייה לאחר המבודד של פאראדיי. באמצעות סיבוב לוחית גל זו, ניתן לכוונן את עוצמת האור הנשלחת לדגימה באופן בלתי תלוי בעוצמה הנשלחת בקרן המשאבה. האור שהומר באורכו גל מוקרן מחדש על ידי דובלט אכרומטי שני, שנבחר כך שקרן העירור תהיה גדולה מספיק כדי למלא את המפתח האחורי של עדשת המיקרוסקופ, ומופנית לתוך מיקרוסקופ הפוך באמצעות שתי מראות היגוי.

עדשת המיקרוסקופ מגדירה את הציר האופטי על מנת ליישר את קרן העירור לציר זה. מקמו מראה במישור הדגימה של המיקרוסקופ. לאחר מכן, כוונות את שתי מראות ההיגוי באופן איטרטיבי תוך צפייה בקרן הלייזר המוחזרת במצלמת CCD המחוברת לפתח ההדמיה של המיקרוסקופ.

בהנחה שהתמונה במצלמה ממורכזת לשדה הראייה של המיקרוסקופ, קרן האור נמצאת על הציר. כאשר נקודת המיקוד ממורכזת על השבב של המיקרוסקופ והזזה של העדשה לאורך ציר Z אינה משנה את התוצאה. נקודת המרכז של פיזור רמן (Raman scattering) של קרן מפוזרת (defocused beam) מתרחשת כאשר הדגימה ממוקמת במישור הדגימה ומוקרנת באור לייזר.

מסנן דיכרואי המוצב מתחת לעדשת המיקרוסקופ מפריד בין קרן העירור לבין האור המפוזר בבביית רמנאך, ומכוון את האור המפוזר בבביית רמנאך אל יציאת הצד של המיקרוסקופ. המיקרוסקופ עבר התאמה להסרת כל העדשות בנתיב זה, כך שאור האות יוצא מהמיקרוסקופ ללא עיכוב, מאחר שקרן האות היוצאת מהמיקרוסקופ גדולה יותר מהמפתח הצלול של הבלנדה.

מקבלי תומפסון (Thompson polarizers), טלסקופ בהקטבה של 0.47 המורכב משני דובלטים ארומטיים, משמשים לצמצום האלומה. אור האות מוקטב לאחר מכן על ידי מקטב תומפסון בעל אטם (gland), המכוון לאפס מעלות ביחס לאנך במסגרת המעבדה, ומופנה למראה דיכרואי שבו הוא מאחד מחדש עם אלומת השאוב. אלומת השאוב נשלחת לקו השהיה המורכב משתי מראות בניצב זו לזו, שתיהן מונחות על במה העברה ליניארית שניתן לכוון כדי להבטיח חפיפה זמנית של פולסי השאוב והאות.

לאחר קו השהיה (delay line), הקרן נשלחת דרך לוחית חצי-גל (half-way plate) ומקטב המכוון ל-45 מעלות ביחס לאנך במערכת הייחוס של המעבדה. פעולה זו מבטיחה את מצב הקיטוב המתאים של קרן השאיבה (pump beam) כאשר היא מגיעה למדיום הלא-ליניארי. לאחר מכן, האור מוחזר משתי מראות היגוי, אחת מהן עם בקרים פ piezoelectric, אשר יש להשתמש בהם כדי לכוון סופית את מיקומה של קרן השאיבה כך שתחפיף מרחבית עם קרן האות (signal beam).

כדי להשיג חפיפה זו, יש להשקיף על קרני המשאבה והאות בשתי נקודות, אחת קרובה ואחת רחוקה מהמראה הדיכרואית שבה הקרניים משולבות; השתמשו במראה ההכוון הראשונה כדי להחפִיף את שתי הקרניים בנקודה הקרובה, ובמראת הפיזו כדי להחפִיף את הקרניים בנקודה הרחוקה, כך שניתן יהיה להפוך את קרן המשאבה לקולינארית בדיוק עם קרני האות. לאחר מכן, יש להגדיר את מערכת התיחור והאיסוף כדי למקסם את אות השער הזמני (time gated signal) שנאסף. לשם כך, קרני המשאבה והאות מועברות תחילה דרך מסנן דיכרואי בעל OD של שש ב-404 nanometers, כדי למנוע מאור עירור שירי לעורר ולהתפזר בתוך המדיום הלא-לינארי.

קרני העירור והאות ממוקדות לאחר מכן על ידי דובלט אכרומטי אל תוך תא קוורץ באורך נתיב של סנטימטר אחד המכיל חומר לא-ליניארי; ניתן להשתמש בכל חומר לא-ליניארי בעל מקדם שבירה לא-ליניארי גבוה מספיק ותגובה זמנית קצרה מספיק. בניסויים אלו, השתמשנו ב-carbon di sulfide. האור מקולמט לאחר מכן על ידי דובלט שני בעל אורך מוקד זהה לראשון.

לאחר מכן, הקרניים עוברות דרך מנתח Glan-Thompson המותקן על תושבת מסתובבת, ואז דרך סט של מסנני בליעה והתאבכות אשר יחד הם בעלי OD של 10 באורך גל של 808 ננומטר. לבסוף, אור האות ממוקד על ידי עדשת דובלט אכרומטית לתוך סיב אופטי רב-חלקו (multimode) בקוטר 50 מיקרון, כאשר הסיב מותקן על במה המאפשרת הזזה בצירי X, Y ו-Z. לאחר מכן, הסיב מחובר לספקטרוגרף דימוי מסחרי עם מצלמת CCD מצומדת כדי ליישם כיול של מערכת האיסוף למקסום האות הנאסף, להגדיר את המנתח ל-0 מעלות ולהניח דגימת בדיקה של toluene במישור הדגימה, ולבצע אופטימיזציה של אות ה-Raman הנאסף על ידי כיוונון בקרים X, Y ו-Z של תושבת הסיב כדי להבטיח חפיפה מרחבית וזמנית נכונה של קרני המשאב (pump) והאות. הנח מראה במישור הדגימה של המיקרוסקופ.

לאחר מכן, הסירו מהמערכת את המסנן של 404 nanometer. סובבו את המנתח (analyzer) ל-90 מעלות, כך שקרן ה-404 nanometer המוחזרת תועבר לספקטרוגרף בעוצמה מותאמת שאינה גורמת לרוויה של המצלמה. כעת, כאשר קרן המשאבה (pump beam) כבויה, סובבו את המנתח כדי למזער את אות ה-404 nanometer המועבר.

כעת הדליקו שוב את קרן המשאבה וכוונו לאט את שלב ההשהיה עד שהטרנסמיסיה של האור באורך גל של 404 nanometer תתחיל לעלות. לאחר מכן, בצעו כוונון איטרטיבי של שלב ההשהיה, המראה הפ piezoelectric ובקרים X, y ו-Z של הסיב כדי למקסם את האות, מכיוון שקרן ה-404 nanometer המוחזרת (retro reflected) והאור המפוזר ברמן עשויים לעבור נתיבים שונים מעט במערכת. בצעו כוונונים סופיים על ידי הנחת מפזר רמן חזק, כגון toluene, על במת הדגימה, החלפת מסנן הרמן ודיוק קל של היישור על ידי שינוי שלב ההשהיה, המראה ה-pizo electric ובקרי X, Y ו-Z של הסיב כדי לאופטימיזציה של אות הרמן.

כעת המערכת מוכנה לאיסוף ספקטרום. ראשית, הדבר דורש רכישה של מספר עקומות רקע כדי לתקן עבור עיוותים (artifacts) של המערכת. ראשית, כאשר האנלייזר מכוון לאפס מעלות, קרן העירור פועלת וקרן הפומפ כבויה.

השג ספקטרום ללא שער (ungated spectrum), ולאחר מכן כוון את המנתח (analyzer) ל-90 מעלות ואסוף ספקטרום רקע המייצג אור בודד (stray light) הדולף דרך המקטבים. לאחר מכן, כאשר המנתח נשאר ב-90 מעלות, כבה את קרן הרמן (ramen beam) והדלק את קרן המשאבה (pump beam). אסוף ספקטרום רקע שני המייצג את כמות אור המשאבה הדולף דרך המסננים הדיכרואיים.

לבסוף, כאשר כל הלייזרים כבויים, אספו ספקטרום רקע כהה (baseline dark spectrum) המייצג את רמת זרם הרקע של המצלמה והאלקטרוניקה. לאחר מכן, הפעילו את כל הקרניים ואספו ספקטום עם שער (gated spectrum). כדי לקבל את הספקטרום האמיתי של האור העובר דרך השער בלבד, יש להפחית מספקטרום זה את שני ספקטרומי הרקע ואת ספקטרום הרקע הכהה.

כאן אנו רואים תרשים סכמטי של מערכת הגליגול. נתיב קרן המשאבה מוצג כקו אדום רצוף, בעוד שנתיב ה-SHG מוצג כקו כחול כהה רצוף. הנתיב שבו רמן ופלואורסצנציה חופפים מוצג בירוק.

בעוד שהמסלול שבו הפלואורסצנציה סוננה באופן זמני מוצג בצהוב. כאן אנו רואים את הספקטרום הגולמי של coumarin המומס בשמן טבילה. העקומה האדומה מראה את הספקטרון שנלקח כאשר השער נשאר פתוח, והעקומה השחורה מראה את הספקטרום שנלקח כאשר המנתח מיושר להעברה מינימלית וקרן משאב מופעלת.

העקומה הכחולה מראה את הספקטרום שנמדד כאשר המנתח מכוון להעברה מינימלית וללא קרן משאבה, והעקומה הירוקה מראה את הספקטרון שנמדד כאשר קרן המשאבה בלבד מופעלת. כל הספקטרומים הוחלקו באמצעות מסנן KY gole מסדר שלישי של 11 נקודות. הקווים המקווקוים בצבע מגנטה מציינים את האזור הספקטרלי המוצג בגרף הבא.

כאן אנו רואים ספקטרום של קומרין המומס בשמן טבילה לאחר חיסור רקע פלואורסצנטי. העקומה האדומה היא הספקטרום כאשר השער נשאר פתוח, והעקומה הכחולה היא הספקטרום עם השער סגור (gated spectrum). הספקטרום עם השער הסגור מראה בבירור את השלב המסובך של מספר הגל הגבוה, המאפיין שמנים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי ללייזר חייבת להיות תחילה מספיק אנרגיית פעימה כדי להניע את ה-ga, וכי המערכת דורשת חפיפה מרחבית וזמנית מדויקת של שתי הפעימות. לאחר צפייה בסרטון זה וקריאת הפרוטוקול המצורף, תהיה בידיכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להפריד את קרן הלייזר לקרנת עירור וקרנת עיקום, וכיצד להשיג חפיפה בין שתי הקרניים הללו, הן מבחינה מרחבית והן מבחינה זמנית.

כיצד להקליט אות ראמן באמצעות ספקטרוגרף ו-C, c, D, וכן כיצד להציג ולנתח את אות הראמן. זכרו כי עבודה עם לייזרים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הרכבת משקפי מגן ללייזר, בעת ביצוע הליך זה. כללי בטיחות נוספים חלים על השימוש בחומר לא-ליניארי ועל השימוש בדגימה הספציפית שלכם.