Name: נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-10T20:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: למדו פרוטוקול זיהוי מהיר של Enterococcus faecalis ומינים נוספים מתרבויות דם חיוביות באמצעות שיטת PNA FISH. השיטה מאפשרת זיהוי ספציפי ומהיר לסיוע בטיפול בספיסה ובהחלטות טיפוליות מיידיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקרים היו בחסות AdvanDx.

1. הדגימה איסוף הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם ורידי מחולים החשודים אלח דם ולשים לשתי BACTEC (BD, ניצוצות, MD) בתרבות בקבוקי דם, אחד ואחד אנאירובי אירובי, יחד תרבות אחת הכוללת מערכת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום בקבוקים לתוך המכשיר 9240 BACTEC ב 35 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור עד מכשיר האזעקה מופעלת לתוך בשל הצמיחה של אורגניזמים בבקבוק תרבות דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוק מהמכשיר תרבות דם. </li></ol> 2. הכנה של ריאגנטים לפני מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון לרחוץ על ידי הוספת 4 מ"ל של פתרון לשטוף 60x ואחריו 240 מ"ל מים מזוקקים או deionized טריים ישירות המנה מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת מכתים את האמבטיה C ° 55 מים חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות להתרכז הנותרים בבית 2-8 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרכבה בינונית מהמקרר ולחמם לטמפרטורת החדר. </li></ol> 3. גראם מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות את הבקבוק תרבות דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט מזרק או מנגנון subculturing, להסיר דם (כ 5 מ"ל) מהבקבוק ומכניסים צינורית בורג סטרילי כתרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה סטרילית, במקום טיפה אחת גדולה של דם לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש השקופית ולתקן ב מתנול למשך 10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להחליק לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע גראם כתם על הסרט דם כדי לקבוע את המורפולוגיה של האורגניזם גדל בבקבוק תרבות דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש העדשה טבילה שמן, להציג שקופיות. Cocci גראם חיובי בזוגות ורשתות קצר נצפה על הכתם גראם עולה בקנה אחד עם רוב המינים אנטרוקוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זו תוצאה כתם גראם אז כוננים הבחירה של ערכת בדיקה נאותה PNA FISH להשתמש לצורך זיהוי חיידקים. תרבות זו תהיה מוכתמת בדם באמצעות E. faecalis / OE FISH PNA הכתם. </li></ol> 4. FISH PNA כתמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שפופרת המכילה את הדם בעדינות על ידי מתערבל לפני הכנה למרוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפה אחת של פתרון קיבעון היטב של שקופיות מיקרוסקופ FISH PNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 10 μL או טיפה אחת קטנה מהצינור עם התרבות דם חיובית הפתרון קיבוע ומערבבים בעדינות emulsify. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הכתמים על ידי חימום אותם 20 דקות. בשעה 55 ° C על צלחת החימום. </li></ol> 5. בקרת איכות חומר אחת חיובית ואחת שלילית שקופיות בקרת איכות חייבים להיבדק עם כל אצווה של שקופיות עבור מכתים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש E. faecalis / OE בקרה שקופיות שנרכשו AdvanDx למטרה זו או להכין מריחות מתרבויות נוזלי של זנים התייחסות של E. faecalis וא פאציום כמו בקרה חיובית או בשקופיות נפרדות או מעורבות בשקופית אחת Staphylococcus spp או סטרפטוקוקוס spp כחומר בקרה שלילית. </li></ol> תוצאות QC צריכים להיות מסוגלים לפקח על התנאים הבדיקות המתאימות, במיוחד אלו המשפיעים על חומרא הכלאה קיר חדירה לתא, מאז מתודולוגיה הרשות הפלסטינית נועד לייעל את הקיר חדירה לתא 6. הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של E. faecalis / OE PNA לבאר בשקופית מיקרוסקופ עם הכתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף coverslip. הימנע בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 30 ± 5 דקות. ב 55 ± 1 ° C בצלחת חימום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מקום דגירה השקופיות במנשא שקופית </li></ol> 7. מחמירים שטפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספק שקופיות לטבול הפתרון לשטוף שחומם מראש ב 55 ° C ו בזהירות להסיר את coverslip. לעתים קרובות, coverslip השקופיות את ידי בעדינות להסעיר את השקופית בפתרון לשטוף. מדי פעם, coverslip יש דחף בעדינות את עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בפתרון לשטוף במשך 30 ± 5 דקות. ב 55 ± 1 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מפתרון לשטוף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להחליק לייבוש באוויר </li></ol> 8. הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה אחת של הרכבה בינונית עד שקופית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף coverslip. הימנע בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את השקופית מיקרוסקופ פלואורסצנטי תוך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תחשוף את השקפים לכוון אור השמש או אחר מקורות אור חזק כמו זה עלול להוביל מרווה פלואורסצנציה. </li></ol> 9. פרשנות של תוצאות מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש לבדיקה שקופיות חייב להיות מצויד במסנן בנד AdvanDx כפולה מטרה או שמן 60x 100x. השקופיות QC יש לבחון תחילה לאשר הכלאה כי עלה. E. faecalis אמור להופיע כפי בהיר cocci פלואורסצנטי ירוק בתחומים מרובים של נוף ואת פאציום E. יופיעו אדום בוהק cocci. Non-enterococci שקופית מלאה אמור להופיע nonfluorescent. לאחר אישור המערכת שולטת, מגלשות החולה יכול להיבדק. בתחילה דם filמ 'יופיעו אדמדם אבל אדום בהיר וירוק cocci יהיה ברור למדי. <img src="/files/ftp_upload/2616/2616fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. נציג דוגמאות של ירוק חיובי E. faecalis (משמאל), אדום חיובי E. פאציום (באמצע), ושלילי (מימין) תוצאות הבדיקה. 10. נציג תוצאות שלושה מוסדות נכללו במחקר רב מרכזי קליני להערכת זה דג PNA כתם ומשווה פרוטוקול 2.5 שעה לפרוטוקול 1.5 מקוצר שעה שזה עתה הנסקרת. סך של 152 cocci שגרתי גראם חיובי בזוגות ורשתות (GPC) חיובי תרבות בקבוקי דם נכללו במחקרים. היה 100% (152/152) הסכם בין התוצאות של שינוי ושל הליך assay המקורי E. faecalis / OE FISH הרשות הפלסטינית: א '41/41 faecalis; enterococci אחרים 33/33 ו 78/78 GPC אחרים (טבלה 1). שיטה זו מכתים את רגישות וספציפיות מעולה במהלך המשפט הזה קליני (טבלה 2). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> שיטות שגרתיות </td><td> א faecalis / OE רגיל PNA FISH נוהל </td><td> א faecalis / OE PNA נוהל FISH קצר </td></tr><tr><td> א faecalis </td><td> 41 </td><td> 41 (גרין חיובי) </td><td> 41 (גרין חיובי) </td></tr><tr><td> א פאציום </td><td> 27 </td><td> 27 (האדום חיובית) </td><td> 27 (האדום חיובית) </td></tr><tr><td> א casseliflavus </td><td> 2 </td><td> 2 (האדום חיובית) </td><td> 2 (האדום חיובית) </td></tr><tr><td> א gallinarum </td><td> 2 </td><td> 2 (האדום חיובית) </td><td> 2 (האדום חיובית) </td></tr><tr><td> אחרים אנטרוקוקוס spp. </td><td> 2 </td><td> 2 (האדום חיובית) </td><td> 2 (האדום חיובית) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td> 17 </td><td> 17 (שלילי) </td><td> 17 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס viridans </td><td> 33 </td><td> 33 (שלילי) </td><td> 33 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס mitis </td><td> 1 </td><td> 1 (שלילי) </td><td> 1 (שלילי) </td></tr><tr><td> S. pyogenes </td><td> 3 </td><td> 3 (שלילי) </td><td> 3 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס בוביס </td><td> 2 </td><td> 2 (שלילי) </td><td> 2 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס salivarius </td><td> 1 </td><td> 1 (שלילי) </td><td> 1 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס sanguinis </td><td> 2 </td><td> 2 (שלילי) </td><td> 2 (שלילי) </td></tr><tr><td> ס agalagtae </td><td> 7 </td><td> 7 (שלילי) </td><td> 7 (שלילי) </td></tr><tr><td> אחרים סטרפטוקוקוס spp. </td><td> 7 </td><td> 7 (שלילי) </td><td> 7 (שלילי) </td></tr><tr><td> Abiotrophia spp. </td><td> 3 </td><td> 3 (שלילי) </td><td> 3 (שלילי) </td></tr><tr><td> Peptostrepococcus spp. </td><td> 2 </td><td> 2 (שלילי) </td><td> 2 (שלילי) </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 152 </td><td> 152/152 100% הסכם </td><td> 152/152 100% הסכם </td></tr></tbody></table> טבלה 1. Listing של חיידקים נבדק הן באמצעות תקן (2.5hr) ומהיר (1.5 שעות) פרוטוקול. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רגישות E.faecalis </td><td> אחרים רגישות אנטרוקוקוס spp. </td><td> סגוליות </td></tr><tr><td> 100% (41/41) 95% CI (93.0-100) </td><td> 100% (33/33) 33/33 95% CI (91.3-100) </td><td> 100% (78/78) 95% CI (96.2-100) </td></tr></tbody></table> טבלה 2. רגישות וספציפיות של פרוטוקול PNA 1.5 שעה FISH.

<ol><li>Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, , (2002).</li>
<li>Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, , (2003).</li>
<li>Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, , (2005).</li>
<li>Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
<li>Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).</li>
</ol>

ההפקה של המאמר וידאו זה היה בחסות AdvanDx. בנימין גביש הינו עובד AdvanDx, שעושה את הכלים ריאגנטים שימוש במאמר זה.

E. faecalis / OE assay PNA דגים אנטרוקוקוס יכול לספק זיהוי 2-3 ימים מוקדם יותר מאשר בשיטות תרבות סטנדרטי. הליך מקוצר עבור assay (1.5 כזאת?) מספק זיהוי מהיר שיכול לשמש עבור גישה טובה יותר לטיפול מיקרוביאלית והתוצאה המטופל. מחקר אחד כדי לתמוך זה בוצע על ידי פורסט, et al. (6). במשך שנתיים רצופות החל משנת 2005 את המעבדה למיקרוביולוגיה מזוהה cocci גראם חיובי בזוגות ורשתות צומח בבקבוקי תרבות דם בשיטות מיקרוביולוגיות קונבנציונאלי בשנת 2006 הוספת E. faecalis / OE PNA FISH. בנוסף אלגוריתם טיפול שפותחה על ידי צוות המוסדות מיקרוביאלית (AMT) להשתמש ביעילות את הנתונים שנוצר על ידי הרשות הפלסטינית FISH במעבדה באופן ובמועד. התוצאה העיקרית הייתה להעריך את הזמן מתרבות דם לצייר ליישום טיפול יעיל מיקרוביאלית לפני ואחרי FISH הרשות הפלסטינית הונהגה לתוך העבודה במעבדות. חומרת מיקום המחלה, החולה טיפול אמפירי מיקרוביאלית נמדדו. סך של 224 חולים עם בית החולים רכשה enterococcal בקטרמיה הוערכו עם 129 בתקופה טרום ההתערבות 95 בתקופה FISH PNA. FISH PNA מזוהה E. faecalis 3 ימים מוקדם יותר מאשר תרבויות קונבנציונאלי (1.1 לעומת 4.1 ימים, p &lt;0.001). FISH PNA מזוהה E. פאציום חציון 2.3 ימים קודם לכן (1.1 לעומת 3.4 ימים, p &lt;0.001) הייתה קשורה עם ירידה משמעותית מבחינה סטטיסטית הזמן ליזום טיפול יעיל (1.3 לעומת 3.1 ימים, p &lt;0.001) וירידה 30 יום התמותה (26% לעומת 45%, p = 0.04). קבוצה זו הגיע למסקנה כי א faecalis / OE assay PNA דגים בשילוב עם אלגוריתם טיפול AMT הביא חניכה קודמות של טיפול אמפירי המתאים מיקרוביאלית עבור חולים עם בית החולים רכשה א &#39;בקטרמיה פאציום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים אסור להשתמש אחרי תאריכי התפוגה מודפס על גבי התוויות ריאגנטים לא צריך להיות שונה בכל דרך שהיא. הם צריכים להישאר במקרר כאשר אינו בשימוש או שהם יכולים לאבד עוצמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בקבוקי דם צריך להיות מעורב לפני הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לא לאפשר את קצה בקבוק טפטפת לגעת כתם דם כי זה עלול לגרום זיהום לחצות של חומר בין שקופיות, או לגרום לזיהום של מגיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא אמבט מים לחסום חימום מתוחזקים על 55 ° C. קבוע </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין להשתמש במסננים אחר מאשר מסנן או צבעים Dual Band לא יהיה להבחין בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין להשתמש שקופיות מיקרוסקופ אחר מאשר שקופיות מיקרוסקופ או הכלאה לא תתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב המיקרוסקופ פועל כהלכה. ודא את הנורה מיקרוסקופ בתוך מספר שעות של אושר לשימוש. </li></ol><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נדירים המתרחשים מינים אחדים אנטרוקוקוס לא מזוהים על ידי בדיקה PNA והכלאה אנטרוקוקוס למינים אחרים, כגון E. asinii, E.dispar, א haemoperoxidus, א cecorum, א columbae, saccharolyticus א, א solitarius ו-E . גופריתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Moraviensis E. מזוהה E. בשל הדמיון רצף faecalis. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה זנים של Streptococcus anginosus לייצר פלואורסצנטי ירוק חיובי כוזב בשל הדמיון ברצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות VersaTREK בקבוקי דם לא הוערכו במהלך המחקרים הקליניים. המופע כדי לזהות E. faecalis ו אנטרוקוקוס אחרים spp. עם תרבות בקבוקי VersaTREK דם אינה ידועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> False autofluorescence ירוק חיובית עשויה להתרחש אם תקן FITC לסנן משמש במקום מסנן Dual Band. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות שליליות שקר עשוי לעתים רחוקות להתרחש עקב צמיחה מעורבת או בשל טעות בטכניקה assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג ומצבו של מכשור המשמש תשפיע על המראה החזותי של התמונה המתקבל. הקרינה עשויה varydue לסוג של מיקרוסקופ מועסקים, את מקור האור ואת רמת rRNA בתאים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד על התקשורת מוצק יש צורך להבדיל צמיחה מעורבת עם אורגניזמים אחרים כדי לזהות תרביות דם חיוביות מניב תוצאה שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוצר לא קיבל תוקף עם דגימות אחר מאשר תרבויות דם. </li></ul>

ריאגנטים א faecalis / דגים OE PNA מורכב מרכיבי הערכה הבאה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון פתרון קיבוע קיבוע 3 מ&quot;ל בופר פוספט עם חומר ניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א faecalis / OE PNA E. faecalis / OE PNA 1.5 מ&quot;ל בדיקות הרשות הפלסטינית ב הכלאה. הפתרון. מכיל לפוראמיד 30%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון 60x לשטוף לשטוף 60x פתרון 50 מ&quot;ל טריס שנאגרו מלוחים עם חומר ניקוי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני הרכבה הרכבה בינונית 3 מ&quot;ל מעכב photobleaching ב גליצרול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת איכות שקופיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> <a href="http://www.advandx.com">AdvanDX</a> </li></ul>

נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci הם גורם שכיח של בקטרמיה עם E. faecalis להיות המין השולט ואחריו E. פאציום. בגלל התנגדות אמפיצילין ו vancomycin ב E. faecalis עדיין בהשוואה נדיר ההתנגדות E. פאציום, פיתוח של בדיקות מהיר המאפשר הבחנה בין מינים enterococcal חשוב עבור טיפול מתאים ומעקב התנגדות. E. faecalis OE assay PNA דגים (AdvanDx, Woburn, MA) משתמשת מינים ספציפיים גרעין פפטיד חומצה (PNA) בדיקות הקרינה ב בפורמט הכלאה באתרו ומציע זמן התוצאות של 1.5 שעות פוטנציאל לספק מידע חשוב עבור מינים ספציפיים הטיפול. מחקרים Multicenter בוצעו כדי להעריך את הביצועים של ה 1.5 שעות faecalis / OE הליך PNA FISH לעומת הליך assay המקורי 2.5 שעה לשיטות בקטריולוגיה תקן לזיהוי enterococci ישירות מתוך בקבוק דם חיובית לתרבות.

פרוטוקול מהירה לצורך זיהוי ישיר של אנטרוקוקוס faecalis ומינים אחרים אנטרוקוקוס מתרבות דם חיובית באמצעות חומצות גרעין פפטיד ניאון assay הכלאה באתרו (FISH PNA).

אנטרוקוקים (Enterococci) הם גורם שכיח לבקטרימיה, כאשר *E. faecalis* הוא המין השכיח ביותר, ואחריו *E. faecium*. מכיוון שעמידות לאמפיצילין ו...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות במהירות מיני enterococcus מבקבוקי תרבית דם חיוביים באמצעות הכלאה של חומצות גרעין פפטידיות פלואורסצנטיות (PNA-FISH). לאחר שהוכנו תרביות דם ונבצעו בדיקות גרם לאישור נוכחותן של תרביות Enterococci, מקבעים את הדגימות על שקופיות מיקרוסקופ PNA-FISH. לאחר מכן מדגגות את השקופיות עם גששים של PNA הספציפיים לאורגניזמים המדוברים.לאחר שהגששים עברו היברידיזציה, מבוצעים שטיפות מחמירות כדי להסיר עודפי גששים שאינם היברידיים. מוסיפים תוךית קיבוע לשקופיות, אשר נסגרות לאחר מכן עם זכוכית כיסוי. ניתן לזהות את מיני ה-Enterococcus הנוכחים בדגימה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.פרוטוקול זיהוי זה באמצעות PNA Fish הוא ייחודי בכך שהוא מספק שיטה מהירה וספציפית לזיהוי enterococcus משבלי שיתוק. דגימות תרבית דם של חולה: דגרו שני בקבוקי תרבית דם, אחד אירובי ואחד אנאירובי, המכילים דם ורידי מחולה בחשד לספסיס, במכשיר אוטומטי לתרבית דם בטמפרטורה של 35 °C. ברגע שהמכשיר מצביע על כך שזוהה גדילה מיקרוביאלית, הוציאו את הבקבוק וסובבו בעדינות את בקבוקי תרבית הדם כדי להחזיר את החיידקים לסספנזיה אחידה.לאחר מכן, העבירו באופן אספטי, באמצעות מזרק ומחט סטריליים, כ-5 milliliters של דם מכל בקבוק לשפופרת נפרדת בעלת מכסה הברגה. לאחר שכל הדגימות חולקו, השתמשו בפיפטה סטרילית כדי להעביר טיפה של דם מכל שפופרת לעל זכוכית מיקרוסקופ נפרדת. הניחו לזכוכית להתייבש באוויר למשך כ-15 דקות.לאחר שהשקף התייבש לחלוטין, טבול אותו במתנול כדי לקבע את הדגימה. לאחר קיבוע השקפים, שטוף אותם ובצע צביעת גרם סטנדרטית כדי לקבוע את המורפולוגיה של האורגניזמים הנוכחים בכל תרבית דם. בחן את השקפים הצבועים באמצעות מיקרוסקופ עם עדשת שמן (oil immersion objective).מין של קוקים יופיע כקוקים גרם-חיוביים המורכבים בדרך כלל מזוגות או משרשראות קצרות. הניחו טיפה אחת של תמיסת קיבוע בתוך באר של שקופית מיקרוסקופ.לאחר מכן, העבירו 10 µL מהתרבית אל טיפת תמיסת הקיבוע ובצעו שאיבה והזרקה חוזרת (pipetting) כדי להמיס את הדגימה. הניחו את העששיות על פלטה מחממת בטמפרטורה של 55 °C למשך 20 דקות כדי לקבע את המריחות בכל בדיקה. ודאו כי נכללו עששיות ביקורת חיוביות ושליליות לצורך הערכת איכות הבדיקה.ניתן לרכוש שקופיות ביקורת למשטיח (callous) מ-Van DX או להכינן באמצעות תרביות ייחוס. כאשר המשחה מוכנה, טפטפו טיפה אחת של EFI callous O-E-P-N-A על הבאר המכילה את דגימת תרבית הדם, וכן על בארי ביקורת החיובית והשלילית. כדי למנוע זיהום של תמיסת המקור של הגשש, הקפידו שלא לאפשר לקצה בקבוק הטפטוף לגעת במשחת הדם.הניחו זכוכית כיסוי מעל הדגימה, תוך הקפדה לא ליצור בועות אוויר. לאחר מכן, דגרו את השקף בבלוק חימום בטמפרטורה של 55 °C למשך 30 דקות. כדי לאפשר ל-PNA להתרחבר (hybridize) לאחר הדגירה, העבירו את השקפים למחזיק שקפים.טבול את נשאי השקופיות הטעון בתוך כלי צביעה המכיל Wash Solution שחומם מראש ל-55 degrees Celsius. כדי להסיר את שאריות ה-PNA מהדגימה, הסר בעדינות את זכוכית הכיסוי על ידי ניעור השקופית בתוך התמיס או באמצעות פינצטה. הדגר את השקופית ב-Wash Solution בטמפרטורה של 55 degrees Celsius למשך 30 דקות.לאחר מכן, הוציאו את השקופית מכלי הצביעה והניחו לה להתייבש באוויר. ברגע שהשקופית יבשה, הוסיפו טיפה אחת של חומר ריכוך (mounting medium) בטמפרטורת החדר לשקופית והניחו בזהירות זכוכית כיסוי על הדגימה. בחנו את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מסנן רב-פס (dual band filter) בתוך שעתיים מההכנה.באמצעות שיטה זו, ניתן להבחין בין iffy, callous, המוצגים בירוק משמאל, לבין eum באדום. בלוח האמצעי בצד ימין מופיעה תוצאה שלילית. שלושה דברים שיש לזכור כדי להשיג תוצאות מוצלחות הם כי טמפרטורות המכשיר חייבות להישמר בטמפרטורות המוגדרות.עליך לעקוב מקרוב אחר הליך הצביעה כפי שמוגדר בעלון לצרכן. ולסיום, נדרש קורא מנוסה שיבצע קריאה יסודית של השקף. פרוטוקול זה מועיל בקבלת החלטות טיפוליות לריפוי ספסיס הנגרם על ידי enterococcus.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

a-15-hour-procedure-for-identification-enterococcus-species-directly

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

העיצוב של התוכנית של יום אחד פשוט העבודה עבור אבחון פתוגן חיידקי מאפשרת זיהוי מהיר של זיהומים בדם. הכללת שמונה מטרות חיידקים רלוונטיות קלינית ופרופילים אנטיביוטיות ההתנגדות שלהם מציע תובנה המטפל הראשוני באותו יום, מה שעלול להוביל טיפול הולם יותר.

יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

היישום של desorption זמן בסיוע מטריקס לייזר / יינון של טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסה (MS) ישירות למרק תרבות דם מזרז את זיהוי של חיידקים. השיטה שהוצגה היא שיטה מהירה ואמינה לזיהוי של חיידקים גראם שליליים ישירות ממרק תרבות דם.

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

הכנת גלולה חיידקים מהירה מתרבית דם חיובית יכולה לשמש כמדגם עבור יישומים כגון זיהוי על ידי MALDI-TOF, צביעת גראם, בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה ובדיקת PCR מבוססת. התוצאות ניתן להעביר במהירות לרופאים כדי לשפר את התוצאה של חולים הסובלים מזיהומים בדם.

הכנה של תרבות דם כדוריים לראפיד בקטריאלי זיהוי ואנטיביוטיקת רגישות בדיקה

EUCAST פיתחה פרוטוקול בדיקת רגישות מיקרוביאלית ישירה (AST) עבור תרביות דם אוטומטיות. עם זאת, ניתן לייתר את תלותו בזיהוי מיקרוביאלי מבוסס ספקטרומטריית מסות על ידי שימוש בפרוטוקול הכנת חיסון ישיר במערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית. גישה זו יכולה לספק דוחות AST תוך 24 שעות מאיסוף הדגימות.

זיהוי מיקרוביאלי ישיר באמצעות מערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית כדי להקל על שיטת EUCAST RAST ללא ספקטרומטריית מסות

בתהליך ההדבקה, צעד מפתח הוא הדבקה של פתוגנים עם תאים המארח. ברוב המקרים שלב זה הידבקות מתרחשת בנוכחות הלחץ המכני שנוצר על ידי זרימת נוזל. אנו מתארים טכניקה מציגה הלחץ גזירה כפרמטר חשוב במחקר של הידבקות חיידקים.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תת קבוצות של מבשר B-תאים מדם הטבורי. כמות ואיכות מספקת של חומצות גרעין עשויה להיות מופקים מהתאים והשתמשו במבחנים הבאים ניצול DNA או RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

חברים של סוג Burkholderia הם פתוגנים חשיבות קלינית. אנו מתארים שיטה לסך מיצוי חלבון חיידקים, תוך שימוש בהפרעה מכאנית, וג'ל אלקטרופורזה 2-D לניתוח proteomic שלאחר מכן.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

יש אוכלי נבלות פוטנציאל translocate פריונים ספגו מוח העברה זיהומיות בצואה שלהם לאזורים ללא מחלה. שלנו שיטות פירוט משמשות כדי לקבוע אם פריונים מרוסקים מותאמים עכבר יישארו זיהומיות לאחר מעבר למרות שמערכת העיכול של עורבים אמריקאים (brachyrhynchos Corvus), הצריכה נפוצה של בעלי חיים מתים.

נהלים לזיהוי פריוני זיהומיות לאחר המעבר דרך מערכת העיכול של מינים עופות

כאן אנו מתארים שיטה יעילה לבידוד, זיהוי, וטיהור של תאי אפיתל עכבר הרתי (Tecs). הפרוטוקול יכול להיות מנוצל ללימודים של פונקצית התימוס להתפתחות נורמלית T תא, תפקוד לקוי של בלוטת התימוס, וכינון מחדש של תאי T.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

למדו פרוטוקול זיהוי מהיר של Enterococcus faecalis ומינים נוספים מתרבויות דם חיוביות באמצעות שיטת PNA FISH. השיטה מאפשרת זיהוי ספציפי ומהיר לסיוע בטיפול בספיסה ובהחלטות טיפוליות מיידיות.

נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם

גלה סרטונים נוספים