נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם
10 בפברואר 2011
פרוטוקול מהירה לצורך זיהוי ישיר של אנטרוקוקוס faecalis ומינים אחרים אנטרוקוקוס מתרבות דם חיובית באמצעות חומצות גרעין פפטיד ניאון assay הכלאה באתרו (FISH PNA).
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות במהירות מיני enterococcus מבקבוקי תרבית דם חיוביים באמצעות הכלאה של חומצות גרעין פפטידיות פלואורסצנטיות (PNA-FISH). לאחר שהוכנו תרביות דם ונבצעו בדיקות גרם לאישור נוכחותן של תרביות Enterococci, מקבעים את הדגימות על שקופיות מיקרוסקופ PNA-FISH. לאחר מכן מדגגות את השקופיות עם גששים של PNA הספציפיים לאורגניזמים המדוברים.
לאחר שהגששים עברו היברידיזציה, מבוצעים שטיפות מחמירות כדי להסיר עודפי גששים שאינם היברידיים. מוסיפים תוךית קיבוע לשקופיות, אשר נסגרות לאחר מכן עם זכוכית כיסוי. ניתן לזהות את מיני ה-Enterococcus הנוכחים בדגימה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
פרוטוקול זיהוי זה באמצעות PNA Fish הוא ייחודי בכך שהוא מספק שיטה מהירה וספציפית לזיהוי enterococcus משבלי שיתוק. דגימות תרבית דם של חולה: דגרו שני בקבוקי תרבית דם, אחד אירובי ואחד אנאירובי, המכילים דם ורידי מחולה בחשד לספסיס, במכשיר אוטומטי לתרבית דם בטמפרטורה של 35 °C. ברגע שהמכשיר מצביע על כך שזוהה גדילה מיקרוביאלית, הוציאו את הבקבוק וסובבו בעדינות את בקבוקי תרבית הדם כדי להחזיר את החיידקים לסספנזיה אחידה.
לאחר מכן, העבירו באופן אספטי, באמצעות מזרק ומחט סטריליים, כ-5 milliliters של דם מכל בקבוק לשפופרת נפרדת בעלת מכסה הברגה. לאחר שכל הדגימות חולקו, השתמשו בפיפטה סטרילית כדי להעביר טיפה של דם מכל שפופרת לעל זכוכית מיקרוסקופ נפרדת. הניחו לזכוכית להתייבש באוויר למשך כ-15 דקות.
לאחר שהשקף התייבש לחלוטין, טבול אותו במתנול כדי לקבע את הדגימה. לאחר קיבוע השקפים, שטוף אותם ובצע צביעת גרם סטנדרטית כדי לקבוע את המורפולוגיה של האורגניזמים הנוכחים בכל תרבית דם. בחן את השקפים הצבועים באמצעות מיקרוסקופ עם עדשת שמן (oil immersion objective).
מין של קוקים יופיע כקוקים גרם-חיוביים המורכבים בדרך כלל מזוגות או משרשראות קצרות. הניחו טיפה אחת של תמיסת קיבוע בתוך באר של שקופית מיקרוסקופ.
לאחר מכן, העבירו 10 µL מהתרבית אל טיפת תמיסת הקיבוע ובצעו שאיבה והזרקה חוזרת (pipetting) כדי להמיס את הדגימה. הניחו את העששיות על פלטה מחממת בטמפרטורה של 55 °C למשך 20 דקות כדי לקבע את המריחות בכל בדיקה. ודאו כי נכללו עששיות ביקורת חיוביות ושליליות לצורך הערכת איכות הבדיקה.
ניתן לרכוש שקופיות ביקורת למשטיח (callous) מ-Van DX או להכינן באמצעות תרביות ייחוס. כאשר המשחה מוכנה, טפטפו טיפה אחת של EFI callous O-E-P-N-A על הבאר המכילה את דגימת תרבית הדם, וכן על בארי ביקורת החיובית והשלילית. כדי למנוע זיהום של תמיסת המקור של הגשש, הקפידו שלא לאפשר לקצה בקבוק הטפטוף לגעת במשחת הדם.
הניחו זכוכית כיסוי מעל הדגימה, תוך הקפדה לא ליצור בועות אוויר. לאחר מכן, דגרו את השקף בבלוק חימום בטמפרטורה של 55 °C למשך 30 דקות. כדי לאפשר ל-PNA להתרחבר (hybridize) לאחר הדגירה, העבירו את השקפים למחזיק שקפים.
טבול את נשאי השקופיות הטעון בתוך כלי צביעה המכיל Wash Solution שחומם מראש ל-55 degrees Celsius. כדי להסיר את שאריות ה-PNA מהדגימה, הסר בעדינות את זכוכית הכיסוי על ידי ניעור השקופית בתוך התמיס או באמצעות פינצטה. הדגר את השקופית ב-Wash Solution בטמפרטורה של 55 degrees Celsius למשך 30 דקות.
לאחר מכן, הוציאו את השקופית מכלי הצביעה והניחו לה להתייבש באוויר. ברגע שהשקופית יבשה, הוסיפו טיפה אחת של חומר ריכוך (mounting medium) בטמפרטורת החדר לשקופית והניחו בזהירות זכוכית כיסוי על הדגימה. בחנו את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מסנן רב-פס (dual band filter) בתוך שעתיים מההכנה.
באמצעות שיטה זו, ניתן להבחין בין iffy, callous, המוצגים בירוק משמאל, לבין eum באדום. בלוח האמצעי בצד ימין מופיעה תוצאה שלילית. שלושה דברים שיש לזכור כדי להשיג תוצאות מוצלחות הם כי טמפרטורות המכשיר חייבות להישמר בטמפרטורות המוגדרות.
עליך לעקוב מקרוב אחר הליך הצביעה כפי שמוגדר בעלון לצרכן. ולסיום, נדרש קורא מנוסה שיבצע קריאה יסודית של השקף. פרוטוקול זה מועיל בקבלת החלטות טיפוליות לריפוי ספסיס הנגרם על ידי enterococcus.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מהיר לזיהוי של Enterococcus faecalis וממנים אחרים של Enterococcus מתרביות דם חיוביות, באמצעות בדיקת היברידיזציה של חומצות גרעיניות פפטידיות פלואורסצנטיות באתר (PNA FISH). שיטה זו מאפשרת זיהוי מהיר וספציפי, המסייע בטיפול באספסיס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- דיאגנוסטיקה קלינית
- מחלות זיהומיות
רקע
- מינים של Enterococcus הם פתוגנים משמעותיים בזיהומים של זרם הדם.
- זיהוי מהיר מתרביות דם הוא קריטי לטיפול יעיל.
- שיטת PNA FISH מציעה שיטה ספציפית לזיהוי אורגניזמים אלו.
- הפרוטוקול תוכנן להיות יעיל ואמין.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לזיהוי מהיר של מיני Enterococcus.
- שיפור מהירות האבחון במסגרות קליניות.
- סיוע בקבלת החלטות טיפוליות בזמן לטיפול באלח kondisi (sepsis).
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת תרביות דם וצביעת גרם לאישור נוכחות של Enterococcus.
- שימוש בגששים מסוג PNA הספציפיים למ种种 של Enterococcus.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להדמיה של דגימות שעברו היברידיזציה.
- הכללת שקופיות בקרה לצורך הערכת איכות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של מיני Enterococcus באמצעות PNA FISH.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבדילה ביעילות בין המינים.
- תוצאות מהירות מסייעות לקבלת החלטות קליניות בזמן.
- הפרוטוקול מדגים ספציפיות ואמינות גבוהות.
מסקנות
- פרוטוקול PNA FISH הוא כלי בעל ערך לאבחון מיקרוביולוגי.
- הוא משפר את מהירות הזיהוי של פתוגנים בתרביות דם.
- שיטה זו יכולה להשפיע משמעותית על הטיפול בספסיס.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מהיר ברמת המין של Enterococcus מתרביות דם תומך בניהול בזמן של טיפול אנטימיקרוביאלי ובמעקב אחר עמידות בטיפול בספסיס. הבחנה בין E. faecalis ל-E. faecium מסייעת בקבלת החלטות טיפוליות מוקדמות, בהינתן פרופילי עמידות שונים. בדיקת PNA FISH זו, הנמשכת 1.5 שעות, מאפשרת הפחתת סיכונים בבחירת טיפול אמפירי בתוכניות למחקר מחלות זיהומיות בשלבי הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקת היפותזות של מנגנוני virulent ספציפיים למין במודלים של בקטרמיה.
- ערך תפעולי: מספק זיהוי מיקרוביאלי סטנדרטי למחקרים פרה-קליניים של ספסיס הניתנים לשחזור.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון במטרה על ידי קישור זיהוי המין לפרופילים דיפרנציאליים של תגובה לתרופות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצרת פלטי פלואורסצנציה כמותיים לצורך תיקוף פגיעות (hit validation) ברצפי סריקה למולקולות אנטימיקרוביאליות.
- הדירות: כוללת בקרות חיוביות ושליליות מובנות המבטיחות את חסינות הבדיקה בין מפעילים שונים.
- יכולת הרחבה: תואמת לעיבוד שקפים בסריקה רחבה (high-throughput) לצורך פרופיל של ספריות תרכובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה את הפתופיזיולוגיה של בקטרימיה אנושית על ידי מתן אפשרות לאפיון מודל ספסיס מלווה בסטרטפיקציה של מינים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תיקוף מטרות in vitro למחקרי יעילות in vivo באמצעות שימוש בזני מיקרובים רלוונטיים מבחינה קלינית.
- הפחתת סיכונים: מפחיתה ייחוס שגוי של השפעות טיפוליות למטרות מיקרוביאליות לא נכונות במודלים של ספסיס.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
מגדיר את הזיהוי המיקרוביאל כשומר סף קריטי בין שלב תיקוף המטרה (target validation) לבין אופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization) בגילוי תרופות אנטי-אינפקטיביות.
- ביולוגיה של הגילוי: מאשרת פעילות על המטרה על ידי אימות המינים הגורמים למחלה במודלים של זיהום לפני הבהרת המנגנון.
- סריקה: מאפשרת קביעת MIC ספציפית למינים לצורך הערכה מדויקת של עוצמת התרכובת.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות בינאריות של מינים המדרגות תרכובות "hit" לפי ספקטרום הפעילות.
- מחקר תרגומי: מבטיח שמודלים פרה-קליניים משקפים את הגיוון של בידודים קליניים לצורך תקפות ניבויית.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לנפתוגנים אחרים גרם-חיוביים באמצעות עיצוב מחדש של הגשוש (probe) ליישום בכל הפלטפורמה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בפרשנות של מודל ספסיס באמצעות זיהוי מדויק של הפתוגן.
- ערך תפעולי: מייצב את תהליכי העבודה המיקרוביולוגיים בקרב צוותי המחקר והצוותים הפרה-קליניים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) על ידי ביטול זיהוי שגוי של מינים כגורם מתערב בנתוני יעילות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מודרגי סיכון של מועמדים בעלי ספקטרום צר לעומת מועמדים בעלי ספקטרום רחב, בהתבסס על אפידמיולוגיה של עמידות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובטכניקות היברידיזציה של חומצות גרעיניות.
- תלוי בציוד למחזורי תרמי השומר על 55°C לשלבי הקיבוע, ההיברידיזציה והשטיפה.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת שקופיות כדי להבטיח קיבוע דגימות עקבי ונגישות של הגששים.
- נדרשת תיקוף על פני זני Enterococcus מגוונים כדי לאשר את ספציפיות הגששים בפנלים של בידודים גלובליים.
- מוגבל למינים שניתן לזהותם עם גששני PNA זמינים; מינים חדשים או נדירים עשויים לדרוש שיטות משלימות.
