In vivo Assay שרירים כלב פונקציה
5 באפריל 2011
אנו מתארים שיטה מינימלית פולשנית וללא כאבים למדוד hindlimb כלבים שריר וכוח התגובה התכווצויות שריר אקסצנטרי חוזרות ונשנות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד ולאפיין תכונות מכניות של שרירי הגפה האחורית בכלב חי באמצעות שיטות לא פולשניות. מטרה זו מושגת תחילה על ידי מיקום נכון של הכלב במתקן הפיזיולוגי. השלב השני של הפרוצדורה הוא מדידה ותיעוד של מומנט התכווצות איזומטרי (isometric twitch torque) ומומנט כיפוף טיביאלי-טרסלי טניטי (Titanic tibial tarsal flexion torque).
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע התכווצויות אקסצנטריות. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא מדידה ותיעוד של twitch איזומטרי, מומנט (torque) ומומנט טיטני במהלך פשיטה של ה-tibial tarsal. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות את חוזק שרירי הגפיים האחוריות ואת התגובה להתכווצויות אקסצנטריות חוזרות באמצעות שיטה פיזיולוגית לא פולשנית.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות שריר מבודדות ex vivo, המהוות מחקרים טרמינליים, הוא שניתן לחזור על השיטה המשמשת כאן לאורך זמן מאחר שהיא אינה פולשנית והיא נסבלת היטב. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום פיזיולוגיה השריר, כגון תגובת השרירים לפגיעה מושרית התכווצות או לעייפות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול או אבחון של דיסטרופיות שריריות, מכיוון שהשיטות מודדות תפקוד שרירים בכלבים או ביונקים גדולים אחרים.
חיות גדולות שכאלו נדרשות במחקרים פרה-קליניים של טיפולים חדשים רבים לפני מעבר לניסויים קליניים בבני אדם. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מודלים של כלבים, ניתן להחיל אותה גם על מערכות מודל של חיות אחרות, כגון פרימטים שאינם בני אדם. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה בשל הזהירות הנדרשת בהנחת אלקטרודות הגירוי, והידע הנדרש כדי להבין מה לצפות לו מגרפי המומנט. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי מיקום האלקטרודות קשים ללמידה בגלל הדיוק הנדרש כדי לעורר את תגובת המומנט המקסימלית מהשרירים.
במסגרת המחקר, נעשה שימוש בשני פרוטוקולים שנכתבו בתוכנת ה-dynamic muscle control (DMC) כדי להגדיר את פרמטרי הגירוי ורישום הנתונים. הפרוטוקול הראשון, פרוטוקול הכיווץ האיזומטרי, משמש הן עבור כיווצי ה-twitch והן עבור כיווצי ה-tetanus. הפרוטוקול השני, הנקרא פרוטוקול פגיעת מתיחה אקסצנטרית, משמש עבור הכיווצים האקסצנטריים. הגדרות הגירוי ורצפי התוכנה המשמשים לכל פרוטוקול מפורטים בטבלה המוצגת כאן; כיווצי twitch מופקים באמצעות גירוי בתדר של one hertz.
התכווצויות טטניות ואקסצנטריות מעוררות באמצעות גירוי בתדר של 50 hertz. במקרה של התכווצות אקסצנטרית, מתווסף מתיחה לשריר המתכווץ. ניסויים אלו כוללים עירור של מספר סוגי התכווצויות שריר, גירוי של העצב הפרונילעמי (peroneal nerve) לעירור התכווצויות מסוג twitch, טטנית או אקסצנטרית של שריר כפוף, וגירוי של העצב השוקי (tibial nerve) לעירור התכווצויות מסוג twitch או טטנית של שריר פושט.
לאחר הרדמת הכלב, בדקו את רפלקס הממאי (blink reflex) כדי לוודא שהבעל חיים נמצא תחת הרדמה עמוקה. עקבו מקרוב אחר רמות הפחמן הדו-חמצני, מדידת סטורציה של חמצן בדם (pulse oximetry) והטמפרטורה. במהלך הפרוצדורה, גלחו את הפרווה באזור הברך הלטראלית (lateral stifle) שבה ימוקמו אלקטרודות הגירוי.
בשלב הבא, מקם את הכלב על שולחן הפיזיולוגיה. במצב שכיבה גבית, מקם את הגפה האגבית כך שהפמור והטיביה יצרו זווית ישרה, והטיביה תהיה מקבילה לראש השולחן; ודא שדושן הכוח יכול להסתובב בבטחה. הוא אמור להרגיש קשיח כאשר הוא מונע ידנית.
בשלב הבא, הפעילו את מערכת הפיזיולוגיה והפעילו את הדוושה. תנועת הדוושה נשלטת על ידי מנוע סרוו, הנשלט על ידי המחשב. כעת, הניחו בעדינות את כף רגלו של הכלב על הדוושה, מדדו ורשמו את אורך כף רגלו של הכלב מציר הסיבוב המרכזי ועד לקצה האצבע הלטרלית.
לאחר מכן, קבעו את כף רגלו של הכלב בדוושה באמצעות רצועת עטיפה אלסטית בעלת דבק עצמי. המתמר שבדוושה מתעד את הכוח של התכווצויות שרירי הרגליים. הגדירו את אלקטרודות הגירוי על ידי חיבור אלקטרודות מונופולריות ממוגנות בכיליי 24 (24 gauge) ליחידת בידוד הגירוי.
בעזרת ידיים עם כפפות, נקה את עורו של הכלב באלכוהול ובצע מישש של העצב הפרונאלי המשותף (common peroneal nerve) ממש דיסטלית לפרוקסיםלית הלטרלית של השוקה (fibula) בעזרת אצבע כדי לסמן את אזור העצב; הכנס בזהירות את האלקטרודה הקתודית השחורה מתחת לעור, וממש חיצונית לפריאוסטאום (periosteum) מקם את האלקטרודה האנודית האדומה מתחת לעור, במקביל ומעט דיסטלית לאלקטרודה הקתודית. שתי האלקטרודות צריכות להימצא כעת פנימית לעצב הפרונאלי המשותף, ממש דיסטלית לראש השוקה. לאחר מכן, הפעל את הגירוי בתדר של one hertz ועקוב אחר תגובת העקירה (twitch response) במסך.
בצעו התאמות קטנות במיקומי האלקטרודות לפי הצורך כדי להשיג את אמפליטודת הפעירוד הגדולה ביותר האפשרית. לאחר שהאלקטרודות ממוקמות כראוי, הפעילו את תוכנת ה-DMC כדי לאסוף תגובת פעירוד. השלב הבא הוא להשריג התכווצות טטאנית (Titanic contraction) מבלי להזיז את האלקטרודות.
כווננו את המעורר כפי שמפורט בטבלה עבור התכווצות טטנית. לאחר מכן, הפעילו בתוכנה את פרוטוקול ההתכווצות האיזומטרית כדי לייצר התכווצות טטנית איזומטרית של השריר. הניסוי הבא, פרוטוקול פגיעת מתיחה אקסצנטרית, מבוצע גם הוא ללא הזזת האלקטרודות.
הגדירו את המעורר להתכווצות אקסצנטרית והתחילו את העירור. בפרוטוקול זה, העצב מעורר 10 פעמים בתדר של 50 hertz למשך שנייה אחת. במהלך אותה שנייה, שרירי הכפיפה מתכווצים בצורה איזומטרית במהלך 800 המילי-שניות הראשונות, ולאחר מכן השריר נמתח במהלך 200 המילי-שניות האחרונות.
לאחר סט אחד של 10 כיווצים אקסצנטריים, יש להניח לשריר לנוח במשך ארבע דקות. לאחר מכן, חזור על פרוטוקול פגיעת המתיחה האקסצנטרית פעמיים נוספות, עם מנוחה של ארבע דקות בין סט לסט. כדי לגרות את שריר הפושט, העבר את האלקטרודות אל העצב הטיביאלי על ידי החדרת האלקטרודות בניצב לעור ובמיקום פרוקסימלי ביחס למיקום האלקטרודות המקורי ששימש לכפיפה. נקודת ההנחה המשוערת היא לאורך קו שחוצה את הזווית של 90 מעלות שנוצרת על ידי הברך.
העצב השוקיי (tibial nerve) נמצא עמוק יותר ולצד העצב הפרוניאלי המשותף (common peroneal nerve). הזז את האלקטרודות כנדרש כדי להפיק את פוטנציאלי העווית (twitch potentials) האופטימליים. לאחר מיקום האלקטרודות, הפק עווית מקסימלית באמצעות הפרוטוקול האיזומטרי מבלי להזיז את האלקטרודות.
שנו את הגדרות הגירוי כפי שצוין עבור התכווצויות טיטניות (titanic contractions). לאחר מכן, הפעילו והקליטו התכווצות טיטנית של שריר ה-tibial tarsal extensor. תוכנת ניתוח השריר הדינמי, או DMA, משמשת לניתוח המומנט והמידע הזמני מההתכווצויות של השריר.
באיור זה, גירוי של העצב הטיביאלי בתדר של one hertz הפעיל התכווצויות בודדות של שרירי הפותחן של הטיביה והטרסוס; לצורך ניתוח נתונים, מיקומי שלושת הסמנים נקבעו באופן הבא: הסמן הכחול ממוקם בנקודה שבה המומנט עולה מהמומנט במצב מנוחה. הסמן הצהוב ממוקם בנקודה שבה המומנט חוזר למומנט במצב מנוחה.
לאחר שלב ההרפיה, הסמן הלבן אינו נחוץ ולכן הוא ממוקם מימין לסמן הצהוב. דמות זו מראה כי גירוי טטינוס איזומטרי של עצב הטיביאלי, באמצעות רצף של פולסים בתדר של 50 hertz למשך 1.5 שניות, הוביל לכיווץ טטיני של שריר ה-tibial tarsal extensor. לצורך ניתוח הנתונים, ממוקמים הסמנים הכחול והצהוב.
בנוגע לניתוח העירור (twitch) באיור זה, הושרו כיווצים אקסצנטריים בשרירי הכופפות של ה-tibial tarsal. גרייה של עצב הפרינאום דרך העור הפעילה כיווץ איזומטרי ראשוני למשך 800 milliseconds, ובנקודה זו הופעל מתיחה כפויה על הרגל. לצורך ניתוח נתונים זה, הסמן הכחול ממוקם בנקודה שבה המומנט האיזומטרי מתחיל לעלות מהמומנט במצב מנוחה.
הסמן הצהוב ממוקם בנקודה שבה מומנט המתיחה האקסצנטרי מתחיל לעלות מהרמה האיזומטרית. הסמן הלבן ממוקם בנקודה שבה המומנט חוזר למומנט המנוחה. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בערך בשעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בפרוטוקול מודפס עם נקודות ביקורת שלב-אחרי-שלב בעקבות הליך זה.
ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון ביופסיות של השריר, על מנת להשיב על שאלות נוספות, כגון סוג סיב השריר או ביטוי של טרנסגן לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום פיזיולוגיית השרירים לבחון את התגובות לפעילות גופנית בכלבים עם דיסטרופיה שרירית. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע בדיקה פיזיולוגית לא פולשנית של השרירים בכלבים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה זעיר-פולשנית וללא כאב למדידת חוזק שרירי הגפיים האחוריות בכלבים ותגובתם להתכווצויות אקסצנטריות חוזרות. הטכניקה מאפשרת את אפיון התכונות המכניות של שרירי הגפיים האחוריות בכלבים חיים באמצעות שיטות לא פולשניות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פיזיולוגיה של השריר
- רפואה וטרינרית
- טכניקות מדידה לא פולשניות
רקע
- שיטות קיימות להערכת שרירים כרוכות לעיתים קרובות במחקרים המסתיימים במוות (terminal studies).
- ניתן לחזור על טכניקה זו לאורך זמן, והיא נסבלת היטב על ידי בעלי החיים.
- היא מספקת תובנות לגבי תגובת השריר לפגיעה או לעייפות הנגרמות מהתכווצות.
- ניתנת ליישום הן במודלים של כלבים והן ביונקים גדולים אחרים.
מטרת המחקר
- למדידה ואפיון של תכונות מכניות של שרירי הגפיים האחוריות.
- להערכת כוח השריר והתגובה להתכווצויות אקסצנטריות.
- לספק שיטה לא פולשנית לחקר פיזיולוגיה של השריר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקום הכלב במערך פיזיולוגי לצורך מדידה.
- הקלטה של מומנט תזוזה (twitch torque) איזומטרי ומומנט טטני (titanic torque).
- ביצוע כיווצים אקסצנטריים באמצעות פרוטוקולי גירוי.
- שימוש בתוכנת DMC לרישום וניתוח נתונים.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של כוח השרירים ותגובה להתכווצויות אקסצנטריות.
- הדגמה של היכולת לחזור על המדידות לאורך זמן.
- מתן תובנות לגבי תפקוד השרירים הרלוונטי לטיפול ולאבחון.
- הדגשת החשיבות של מיקום האלקטרודות לקבלת תוצאות מדויקות.
מסקנות
- שיטה זו מציעה התקדמות משמעותית בהערכה לא פולשנית של השרירים.
- היא יכולה לסייע במחקרים פרה-קליניים עבור טיפולים חדשים המכוונים לדיסטרופיות שרירים.
- הטכניקה ניתנת להתאמה למודלים שונים של בעלי חיים מעבר לכלבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקת תפקוד שריר לא פולשנית בכלבים זו מאפשרת הערכה אורכית חוזרת של כוח שרירי הגפיים האחוריות ותגובת עייפות ביונקים גדולים, ובכך היא נותנת מענה לפער קריטי במודלים פרה-קליניים של מחלות של השלד והשרירים. באמצעות אספקת מדידות מומנט כמותיות מהתכווצויות איזומטריות, טיטניות ואקסנטריות ללא נקודות סיום טרמינליות, השיטה תומכת בהסרת סיכונים מכניסטית של מועמדים טיפוליים המכוונים לדיסטרופיות שרירים ומצבים נוירומוסקולריים אחרים לפני מעבר לשלב הקליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה תפקודית של היפותזות טיפוליות in vivo על ידי מדידת תגובת השריר לפגיעה או לעייפות המושרות על ידי התכווצות.
- ערך תפעולי: מספק מדדים הדירים שאינם טרמינליים לצורך הבהרת מסלולים ובחינת מעורבות מטרה (target engagement) במודלים של בעלי חיים גדולים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר פלטים כמותיים סטנדרטיים (twitch torque, titanic torque, eccentric stretch torque) לצורך מוכנות הבדיקה וסריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה לאורך מחקרים השונים בשל פולשנות מינימלית וסובלנות למדידות חוזרות לאורך זמן.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מגשר בין שלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית באמצעות הערכת תפקוד שרירים הרלוונטי למחלה במודלים של כלבים, הישימים למחקר על דיסטרופיה שרירית בבני אדם.
- ערך תפעולי: מספק בסיס לקבלת החלטות על קידום הפיתוח בהתאם לסיכונים, באמצעות ניטור ארוך-טווח של יעילות טיפולית ועמידות לעייפות השרירים.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, במיוחד עבור טיפולים נוירו-מוסקולריים הדורשים תיקוף של נקודות סיום תפקודיות בבעלי חיים גדולים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של יעדים ספציפיים לשריר על ידי מדידת תגובות פיזיולוגיות לגירוי עצבי ועומס מכני.
- סריקה: מספק מדידות מומנט (torque) הניתנות לשחזור וכמותיות, המאפשרות השוואה אמינה של תנאים ניסיוניים לאורך נקודות זמן שונות.
- אנליטיקה: מספק נתוני זמן ואמפליטודה מהתכווצויות twitch, titanic והתכווצויות אקסצנטריות (eccentric) לצורך ניתוח השוואתי של תכונות התכווצות השריר.
- מחקר תרגומי: מבטיח רציפות ממודלים של כלבים ליישום בבני אדם על ידי מדידת פרמטרים פיזיולוגיים שמורים של השריר הרלוונטיים לתוצאות קליניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת לשימוש חוזר לצורך פנוטיפינג של מערכת השלד והשרירים לאורך זמן במגוון תוכניות טיפוליות ומערכות מודל.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במנגנונים טיפוליים המכוונים לשרירים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות פרוטוקולי גירוי מוגדרים ופרוטוקולי הארכה בבקרה סרוו-מנועית.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשרות למדידות חוזרות באותה חיה, ובכך מפחית את הצורך בגודל קוהורט גדול.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות go/no-go באמצעות נקודות סיום אובייקטיביות וניתנות לתרגום של חוזק שרירים ועמידות לעייפות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בזיהוי עצבים פריפריים ובהחדרת אלקטרודות דרך העור להשגה של סטימולציה אופטימלית.
- תלוי במערכות מנועי סרוו ובתוכנת DMC/DMA למדידה מדויקת של מומנט (torque) ולביצוע הפרוטוקול.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים של הרדמה וניטור פיזיולוגי כדי להבטיח את רווחת בעלי החיים ועקביות הנתונים.
- כולל עקומת למידה להשגת תגובות מומנט מקסימליות בשל מיקום האלקטרודות התלוי בדיוק.
- מוגבל לעצבים שטחיים נגישים (למשל, peroneal, tibial) ביונקים גדולים, דבר המגביל את היישום הישיר לקבוצות שרירים עמוקות.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:03
Experimental Protocols
3:07
Positioning the Dog in the Physiology Rig
4:14
Isometric Twitch Torque and Tetanic Torque (Tibiotarsal Flexion)
5:34
Eccentric Protocol
6:14
Isometric Twitch Torque and Tetanic Torque (Tibiotarsal Extension)
7:14
Data Analysis and Results
8:44
Conclusion
