Name: הדגמת שימושים של ספקטרומטר הכבידה רומן כוח כדי למתוח מדוד חלבונים סיביים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-19T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: למד כיצד להשתמש בספקטרומטר כוח הכבידה למדידת כוחות מולקולריים ברמת מולקולה בודדת. שיטה זו משלבת מיקרוסקופ אור ומצלמה דיגיטלית לניתוח אינטראקציות מולקולריות בביופיזיקה ומדעי המוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

חומר זה מבוסס על עבודה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מס &#39;0842736.

<ol><li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li>
<li>Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled-coil+nanomechanics+and+uncoiling+and+unfolding+of+the+superhelix+and+alpha-helices+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin.</a> Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).</li>
<li>Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbinding+force+of+a+single+motor+molecule+of+muscle+measured+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers.</a> Nature. 377, 251-254 (1995).</li>
<li>Gawalapu, R. K., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+and+computational+analysis+of+the+strut+of+myosin%27s+50+kDa+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft.</a> Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).</li>
<li>Kellermayer, M. S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+manipulating+individual+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+Physiol.+Meas%22%5BJournal%5D)">Visualizing and manipulating individual protein.</a> Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).</li>
<li>Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+arrangement+of+the+myosin+rod+in+vertebrate+thick+filaments%3A+immunoelectron+microscopy+with+a+monoclonal+antibody+to+light+meromyosin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin.</a> J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).</li>
<li>Godfrey, J. E., Harrington, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-association+in+the+myosin+system+at+high+ionic+strength.+I.+Sensitivity+of+the+interaction+to+pH+and+ionic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment.</a> Biochemistry. 9, 886-893 (1970).</li>
<li>Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+docking+of+myosin+and+actin+observed+with+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer.</a> Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).</li>
<li>Xu, J., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Selection+during+Weak+Binding+at+the+Actin+and+Myosin+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface.</a> Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).</li>
<li>Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+base+pair+resolution+by+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בעת המרת סרט ייצוג thresholded דיגיטלית, זה קריטי עבור התמונה thresholded לשמור על אותו אזור בכל מסגרת של וידאו. מכיוון חרוזים בזוג חרוז לנוע באופן עצמאי זה מזה, כל להיסחף בתחומים thresholded יכול גם לגרום המרחקים היחסית בין centroids של החרוזים להיסחף ולהציג טעות משמעותית. שליטה על אזור סף הפחית את השגיאה פי חמישה את המדידות במרחק 26 ננומטר עד 5 ננומטר. היא גם חיונית כדי להשיג מדידה מדויקת של רדיוס חרוזים הן כיחס בין החרוזים חשוב החישוב הסופי כי התשואות הן מרחק וערכים כוח. <p...

<table><tbody><tr><td>3-אמינופרופילטריאתוקסיסילאן</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>919-30-2</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>פירידין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-86-1</td><td></td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7776</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>Research Organics</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9682T</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>Amresco</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMR-0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MSI</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>ניטרוצלולוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60443</td><td></td></tr><tr><td>N,N-דימתילפורממיד</td><td>הוצאה מתוך Large New</td><td>D4254</td><td></td></tr><tr><td>מיוזין II שלד של ארנב</td><td>ארנבים לבנים מזן זילנד (7-8)</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן MF30 (9-10)</td><td>בנק היברידומות למחקר התפתחותי</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן MF20 (6)</td><td>בנק היברידומה</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מעבדה</td><td>בוריאלי</td><td>WW57905M00</td><td></td></tr><tr><td>תושבת שמימית (Equatorial mount)</td><td>Celestron</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית לווידאו</td><td>Sony Corporation</td><td>XCDV60</td><td></td></tr><tr><td>שחרור הקליפר</td><td>Cabelas</td><td>IA-415482</td><td></td></tr><tr><td>קפיץ לחיצה</td><td>Jones Spring Co.</td><td>723</td><td></td></tr><tr><td>קפיץ מתיחה</td><td>Jones Spring Co.</td><td>770</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td>לא צוין טקסט לתרגום. נא לספק את הטקסט המקור באנגלית.</td><td></td></tr><tr><td>דרייברים של Fire-i &amp;יישום </td><td>Unibrain</td><td>3.80</td><td></td></tr><tr><td>אקסל</td><td>Microsoft</td><td>לא זמין</td><td></td></tr></tbody></table>

הדגמת שימושים של ספקטרומטר הכבידה רומן כוח כדי למתוח מדוד חלבונים סיביים

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

המחקר של מבנה macromolecular הפך קריטי הבהרה של המנגנונים המולקולריים ותפקוד. יש bioinstruments מוגבל, אבל חשוב כמה מסוגל לבחון את התלות של תכונות כוח חלבונים מבניים. סולם כבר פרמטר הגבלת כיצד במדויק החוקרים יכולים להציץ לתוך העולם nanomechanical של מולקולות, כגון חומצות, אנזימים גרעין, חלבונים מנוע המבצעים של חיים עבודה. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא מכוון היטב כדי לקבוע מבנים יליד חלבונים סיביים עם רזולוציה מרחק שוה עם מיקרוסקופ אלקטרונים. עם זאת, מחקרים AFM כוח, הכוחות הם בדרך כלל הרבה יותר גבוה מאשר מולקולה בודדת עשוי להיתקל 1, 2. מלכודות אופטי (OT) טובים מאוד לקבוע את המרחק היחסי בין חרוזים לכודים והם יכולים להקנות כוחות קטנים מאוד 3. עם זאת, הם אינם אורכים תשואה אבסולוטית מדויק של מולקולות הנחקרת. סימולציות מולקולרית לספק מידע תומכת ניסויים כאלה, אבל הם מוגבלים ביכולת להתמודד עם גדלים באותו מולקולרי גדול, מסגרות זמן רב, לשכנע כמה חוקרים בהעדר ראיות תומכות אחרות 2, 4. ספקטרומטר כוח הכבידה (GFS) ממלא נישה קריטי בארסנל של חוקר על ידי מתן שילוב ייחודי של יכולות. מכשיר זה היא מסוגלת לייצר כוחות בדרך כלל עם 98% או יותר דיוק מטווח femtonewton לטווח nanonewton. מדידות מרחק כיום מסוגלים לפתור את אורך מולקולרית מוחלטת עד חמישה ננומטרים, ויחסי חרוז ההפרדה זוג מרחקים עם דיוק דומה מלכודת אופטי. כמו כן, GFS יכול לקבוע מתיחה או ומתעקל שבו הכוח נמצא ליד שיווי משקל, או לספק כוח מדורגים הצבתם נגד שינויים מבניים נמדד. אפשר אפילו לקבוע כמה שאריות חומצת אמינו מעורבים ומתעקל אירועים תחת עומסים כוח פיזיולוגי 2. בניגוד לשיטות אחרות שבהם יש כוח רב כי כיול חייבת להקדים כל assay, GFS לא דורש כיול כוח כזה 5. על ידי המשלימה את החוזק של שיטות אחרות, GFS יהיה לגשר על פערים בהבנת Nanomechanics של חלבונים חיוניים מקרומולקולות אחרים.

זהו צעד אחר צעד מדריך המציג את המטרה, תפעול, והתוצאות נציג ספקטרומטר כוח הכבידה הרומן.

חקר המבנה המקרו-מולקולרי הפך לקריטי להבנת המנגנונים המולקולריים ותפקודם. קיימות מספר שיטות מוגבלות, אך...

מערך כוח הכבידה מורכב ממעמד epi, מיקרוסקופ אור רגיל, מצלמה דיגיטלית ומחשב. אנו משתמשים במערך זה לצורך ביצוע acid של מולקולות בודדות. ניתן להקליט שיווי משקל של כוחות או לספק כוח מדורג באמצעות טיפה.כדי להתחיל, עלינו להכין מיקרו-זכוכית כך שניתן יהיה לבצע בה סוג זה של תהליך. למדידה של כ-10 מיליגרם מהפולים שבהם נשתמש, אני מכין בדרך כלל 2K. כאן יש לנו חמישה מיליליטר של we're gonna three triology.שם נכין את דגימת הביקורת הראשונה. ערבבו את התערובת היטב בעזרת פיפטה, ולאחר מכן העבירו 2 mL מהתערובת אל מעל ה-bead cake. השאירו את ה-bead cakes למשך 2 דקות, ולאחר מכן בצעו ערבוב ב-vortex באופן יסודי במשך 2 שניות.המיסו את השניים הרטובים. יש להוסיף purine אחד במים מזוקקים פעמיים. צימוד ב-pH 6.בפשטות, הוסיפו חמישה מיליליטר של באפר הצימוד (coupling buffer) לכל חרוז, וצימוד זה גורם לחרוז להתחבר. לאחר מכן, הנוגדנים נקשרים בצימוד שוב; ערבבו ב-vortex למשך דקה. צנטריפוגו למשך חמש דקות, ואם אתם משתמשים במקפיא כדי להשיג את הגלייד (glide), עליכם לדלל אותו מכל ריכוז שיהיה ל-5% באמצעות באפר הצימוד.לאחר מכן, קחו שני מיליליטרים מתמיסה זו והוסיפו אותם, ופעולה זו תאפשר את הצימוד של ה-TER עם הקצוות שכבר נמצאים על הוורטקס שלנו. ביצעו זאת עבור שניים, סובבו למשך שלושה. הליך באפר הצימוד.הוסף שוב חמישה מיליליטרים של בופר

demonstrating-uses-novel-gravitational-force-spectrometer-to-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מיקרוסקופיה וטכניקות לעיבוד תמונה שימשו להתבוננות וניתוח של דחיסת ג'ל בתיווך פיברובלסט וארגון מחדש של סיבי פיברין בביוריאקטור מבוקר לסביבה על פני תקופה של 48 שעות.

התבוננות וכימות דחיסה של ג'ל פיברובלסט בתיווך פיברין

צלולוזומים הם קומפלקסים מולטי-אנזימים המיועדים לעיכול תאית. SMFS מבוסס AFM שימש לחקר התכונות המכניות ותצורת הקיפול של מכלולי חלבון הקשורים לתאית. אנו מציגים זרימת עבודה מלאה לקיבוע חלבונים, רכישת נתונים וניתוח נתונים כדי לחקור את האינטראקציות של קומפלקסים בודדים של קולטנים-ליגנדים המעורבים בהרכבת תאית.

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

אנו מציגים במאמר זה פלטפורמה חדשני מתיחה שיכול לשמש כדי לחקור את תגובות תא בודדות לעיוות מכאנית biaxial איזוטרופי מורכב ולכמת את התכונות מכאניות של רקמות ביולוגיות.

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

ניתוח של מאפייני ההתכווצות של סיבי שריר כימי עור, או permeabilized, שלד מציע אמצעי רב עוצמה שבאמצעותו להעריך את תפקוד שרירים ברמה של תא השריר הבודד. במאמר זה אנו מתארים טכניקה תקפה ומהימנה להכנה ובדיקת permeabilized סיבי שריר שלד במבחנה.

מדידה המרבית איזומטרי הכוח שנוצרה על ידי סיבי שריר שלד permeabilized

אנו מציגים פרוטוקול ליישום ספקטרוסקופיה של פיזור אור Brillouin על סיבי קולגן מסוג I מטוהרים על ידי אלסטין וטריפסין של המטריצה החוץ-תאית כדי לחלץ את מלוא תכונותיהם האלסטיות.

הכנת סיבי חלבון תאי מטריקס עבור ספקטרוסקופיה ברילואן

לאחרונה פותחו מספר חיישני כוח מבוססי FRET, המאפשרים רזולוציה ספציפית לחלבון של כוח תוך-תאי. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש באחד מהחיישנים הללו, המיועד לקישור של החלבון הקומפלקס Nesprin-2G Nesprin-2G כדי למדוד את כוחות האקטומיוזין על קומפלקס ה-LINC הגרעיני.

פרוטוקול באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) חיישנים ביולוגיים -force למדוד כוחות מכניים ברחבי המכלול הגרעיני LINC

אנו מתארים את הליכים מפורטים על מנת למדוד את תכונות מכניות מסלולים מכני התגלגלות של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. אנו גם מראים תוצאות נציג כנקודת התייחסות הבחירה ואת ההצדקה של הקלטות מולקולת חלבון אחד טוב.

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בו זמנית של פורסטר תהודה אנרגיה מבוססת על העברת מתח חיישנים שימדדו עומס חלבון ושחזור פלורסצנטיות לאחר photobleaching למדוד דינמיקה חלבון המאפשר מדידת כוח רגיש דינמיקה חלבונים בתאים חיים.

מדידה של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים באמצעות שילוב של טכניקות פלורסנט

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) היא טכניקה חזקה לפתיחה מכנית וחישה בזמן אמת של מערך אנסמבל של מבנים ביומולקולריים בתחומים ביופיזיים וביו-סנסורים.

ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל על ידי כוחות גזירה

למד כיצד להשתמש בספקטרומטר כוח הכבידה למדידת כוחות מולקולריים ברמת מולקולה בודדת. שיטה זו משלבת מיקרוסקופ אור ומצלמה דיגיטלית לניתוח אינטראקציות מולקולריות בביופיזיקה ומדעי המוח.

הדגמת שימושים של ספקטרומטר הכבידה רומן כוח כדי למתוח מדוד חלבונים סיביים

גלה סרטונים נוספים