המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מערכת תרביות תאים בעלת תבנית מיקרוסקופית המורכבת מהידרוג'ל כפול למחקרים נוירונליים. דבר זה מושג תחילה על ידי זריעה של שתלי רקמה, כגון גנגליונים של שורש הגב עובריים, על תבתי תרבית תאים חדירים. לאחר מכן, נוצרת תבנית מיקרוסקופית בתוך הידרוג'ל הניתן לקשירה צולבת פוטוכימית באמצעות התקן מראות מיקרוסקופי דיגיטלי (DMD) המשמש כמסכה פוטו-דינמית.

לאחר מכן מוסיפים את ההידרוג'ל בעל ההרכבה העצמית במצב טהור, שעשוי להכיל סספנסיה של תאים מופרדים. נדרש זמן דגירה מתאים לפני ביצוע האנליזה התאית. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות חיוניות של תאי עצב וצמיחת נוריטים דרך תצורות גיאומטריות ספציפיות שהוגדרו על ידי ה-DMD.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן ליצור, לשנות ולהקרין במהירות מסה פוטו-דינמית ממרחק, כדי להתאים כמעט לכל תשתית, כגון רכיבי תרבית תאים חדירים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מערכות עצביות, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות שעשויות להפיק תועלת מאילוצים גיאומטריים שניתן להגדיר, כגון סיגנלינג תאי, נדידה של תאים, מגע בין תאים או מורפוגנזה, אם למנות כמה דוגמאות. נורות ה-UV של לוח ה-DMD, המדריך והעדשה עם הגדלה של פי ארבעה מותקנים כולם בצורה אנכית על שולחן בידוד רעידות.

מיקרוסקופ הפוך ממוקם מתחת לעדשת העצם כך שניתן יהיה להדמיות את אור המיקוד המוחזר מה-DMD דרך המיקרוסקופ. לפרטים נוספים על הגדרת ה-DMD, אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף. ראשית, הכינו את תבניות השתיל לתרבית תאים בעלות שישה בארות המצופות בקולגן לקבלת תרביות X explan; צפו את דפנות תבניות השתיל לתרבית תאים ב-rain x, תוך הקפדה שלא למרוח rain X על הממברנה עצמה.

לאחר מכן, הוסיפו 1.5 milliliters של מצע aian למסננים (inserts) והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide. למחרת, לאחר קצירת גנגליונים של שורש גב עובריים (dorsal root ganglia) מגורי חולדה ביום העוברי E 15, זרעו עד ארבעה DRGs בכל מסנן שש-בארים (six-well insert) מצופה קולגן, והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide כדי לאפשר ל-DRG להיקשר לממברנה.

לאחר תקופת האינקובציה, ה-DRGs יהיו מוכנים לפוטו-פולימריזציה. התקן מיקרו-מראות דיגיטלי (DMD) הוא מערך של 1024 על 768 מראות בודדות, אשר מחזירות אור באופן סלקטיבי בהתבסס על מיקום המראה. בהליך זה, ה-DMD משמש ליצירת תבניות של אור על-סגול על גבי photo CROs, הינם הידרוגלים הניתנים לקישור, ובכך יוצר גאומטריות ספציפיות של הידרוגלים באופן פשוט ומהיר.

למרות שה-DMD שלנו הוא יחידה עצמאית, ניתן לשלב את המכשיר לשימוש עם מיקרוסקופים קיימים רבים. ראשית, הוציאו את צמחי ה-DRGX מהאינקובטור, ושאבו את כל הנוזל העודף מההכנסה (insert). לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של תווך פולימריזציה לתוך ההכנסה.

העבירו את המכלילים עם צמחי ה-DRGX אל על גשמי זכוכית מסוג rain extre והניחו את הגשמיות מתחת ל-DMD. השתמשו בתוכנת ממשק המשתמש הגרפי הבסיסי של ALP three כדי לטעון לתוך ה-DMD את התמונה בשחור-לבן שתשמש כמסכת פוטו. במקרה זה, נבחרה צורה משתעפת כדי לאפשר יישום של מערכות להנחיית נוריטים באמצעות מיקרוסקופ הפוך ומקור אור גלוי מסוג DI.

יישרו את נתח הרקמה עם המיקום המתאים במסיכת התמונה, תוך שימוש באור המוחזר מה-DMD כמדריך. לאחר מכן, החליפו את מקור האור הנראה במקור אור UV. האירו את מדיום הפולימריזציה בתוך תרבית התאים.

החדירו עד להשלמת הצלובת של ה-PEG. חזרו על הפעולה עבור כל DRG על גבי ההחדרה. לאחר מכן, שטפו כל החדרה שלוש פעמים במי מלח פוספט (PBS) סטריליים המכילים 1% penicillin streptomycin.

לבסוף, הוסיפו 1.5 milliliters של מצע גידול מתחת לסבבי תרבית התאים והניחו להם להגיע לשיווי משקל באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 30 דקות. במהלך תקופת האינקובציה, בצעו סוניקציה למטריקס טהור למשך 30 דקות. כדי להמיס את הפפטידים, דללו את התמיסה הריכוזית של 1% לסביבות 0.15% במים סטריליים והוסיפו one microgram per milliliter של למינין מסיס.

לאחר 30 דקות, הוצא את התרביות מהאינקובטור ושאיף את כל עודפי המצע מההכנסה (insert). לאחר מכן, תוך כדי צפייה בחלל תחת מיקרוסקופ, שאיף את המצע מתוך האזור החלול במבנה ה-PEG המכיל את ה-DRGX explan, והזרק באמצעות פיפט כ-1 µL של תמיסת מטריקס טהורה לתוך החלל סביב ה-X explan. ודא שהמטריקס הטהורה אינה גולשת מהחלל ב-peg.

לאחר מכן, טפטפו 1.5 milliliters של מצע גידול מתחת לרכיב המוכנס (insert) והניחו באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide למשך שעה אחת. כדי להבטיח התאפסות מלאה לאחר פרק זמן זה, החליפו את מצע הגידול והחזירו את התרביות לאינקובטור. מצע הגידול מוחלף בכל 48 שעות של תרבית.

דוגמאות למבני הידרוג'ל כפולים המכילים צמחים של DRGX מוצגות כאן. צמחי ה-DRGX סומנו עבור מדדי גדילה ופרוליפרציה. מבנה ה-PEG הפולימרי מופיע באפור, NEURITES של DRG המסומנים ב-beta three tubulin מופיעים בירוק, וצביעת DPI מסמנת את גרעיני התאים המופיעים בכחול.

שימו לב כי נדידה תאית והארכת רשת מוגבלים לאזור התאים המאפשר של מבנה ההידרוג'ל הכפול. כמיסה בהידרוג'ל כפול היא מתאימה כאשר משתמשים בכל ג'ל המרכיב עצמו, יחד עם ג'ל הניתן לקשירה פוטו-כימית. במקרה זה, PEG משמש כתמיכה מבנית להצגה גיאומטרית של הג'ל המרכיב עצמו.

לדוגמה, pure matrix או aris. סוג הג'ל ובחירת מסכת הפוטו (photo mask) יהיו תלויים ביישום הספציפי הרצוי. טפלו את דפנותיהם של תבניות להשקיית תרביות תאים מפוליאסטר באמצעות rain X כפי שהודגם בעבר.

העבירו את הסרט (insert) למשטח זכוכית מצופה rain X והניחו אותו תחת ה-DMD. לאחר מכן, הוסיפו 500 microliters של מדיום פולימריזציה לסרט. טענו את המסכה המתאימה לניסוי הישרדות זה ב-DMD.

הצגה גלילית של מטריצה טהורה משמשת לסיוע בדימות של תאים. חשוף את הרכיב המוכנס לאור UV למשך 55 שניות כדי להשרות קשירה צולבת של peg לאחר הקשירה הצולבת. שטוף את החלל שנוצר זה עתה עם DPBS סטרילי ו-1% pen strep.

השתמש במיקרו-פיפט או במקלון צמר sterile כדי להסיר את כל הנוזל העודף מהחלל. הכן Matrixx טהור על ידי סוניקציה למשך 30 דקות, דלל ל-0.15% במים סטריליים, בתוספת מיקרוגרם אחד למילליטר של laminin מסיס ו-10% סוכרוז. לאחר מכן, שקיע את התאים המיועדים לתרבית באמצעות צנטריפוגציה.

שאבו היטב את המצע ממשקע התאים ושחזרו את השCעק בריכוז של כחמש פעמים 10³ תאים למיליליטר בתמיסת 0.15% pure matrix. קריטי לשאוב את כל המצע ממשקע התאים, שכן pure matrix מתחיל בתהליך של הרכבה עצמית (self-assembly) עם המגע עם תמיסת מלח. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפט כ-1 µL מתערובת תאי ה-pure matrix המועשרת אל תוך חלל הפיג (peg void).

נפח זה בדרך כלל מספיק כדי למלא את החלל הריק מבלי לגלוש; פלפט 1.5 milliliters של מצע גידול מתחת להכנסה (insert). לאחר מכן, העבר את ההידרוג'ל המשני של המטריקס הטהור למדגרה לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide למשך שעה אחת כדי להבטיח ג'לציה (gelation) מלאה. לאחר זמן זה, שאב את המצע והוסף מצע טרי מתחת להכנסה, תוך הקפדה שלא לפגוע במטריקס הטהור החלש מבחינה מכנית.

החזירו את התרביות לאינקובטור לתרביות רקמה והחליפו את המצע בכל 48 שעות של תרבית. להלן דוגמאות של נוירונים חיים מ-DRG המעטפים בתוך מגוון מבני הידרוג'ל כפולים. לאחר 48 שעות במצע גידול, התאים סומנו בסימון סידן, סמן לתאים חיים המופיע בצבע ירוק.

כאן, בשל האופי הדינמי של מסכת הצילום של ה-DMD, הגאומטריה הזמינה לכלילה מוגבלת אך ורק על ידי הממדים והרזולוציה של האופטיקה. כלילה בודדת של הידרוג'ל מתאימה כאשר ניתן לבחון את התאים בתוך הידרוג'ל הניתן להשחלה פוטו-כימית, בדומה לתרבית תאים בפוליאסטר. הכניסו באמצעות Rain X והניחו תחת ה-DMD על שקופית מצופה ב-Rain X.

כפי שנעשה קודם לכן, העבירו בעזרת פיפט את התאים המיועדים לתרבית ישירות אל מצע הפולימריזציה בריכוז הרצוי וערבבו היטב כדי להבטיח התפלגות הומוגנית. לאחר מכן, העבירו בעזרת פיפט 500 µL מתערובת התאים במצע הפולימריזציה אל תוך ההכנסה (insert). בחרו את המסכה המתאימה והטעינו אותה על ה-DMD; השראו קשירת PEG על ידי חשיפה לאור UV למשך 55 שניות.

עבור מחקרי הישרדות תאים, נעשה שימוש במסכה מעגלית בסיסית המייצגת גליל; שטפו את התשת (insert) שלוש פעמים ב-DPBS סטרילי וב-1% pen strep, ולאחר מכן העבירו בפיפט 1.5 milliliters של מצע גידול מתחת לתשת וכמות מספקת של מצע גידול מעליו כדי להטביע את התשת לחלוטין; דגרו ב-37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide עם החלפת מצעים בכל 48 שעות. להלן דוגמה לנוירונים קורטיקליים חיים ומפורקים המעטופים בתוך peg. תאים חיים מסומנים ב-calcium am ומופיעים בירוק, בעוד שתאים מתים מסומנים ב-ahy homodimer one ומופיעים באדום.

הכלילה ב-PEG נועדה לשמש כדוגמה בלבד, שכן PEG אינו מהווה סביבה אידיאלית לתאי עצב. הגאומטריה הנבחרת מייצגת אמצעי פשוט לבחינת חיות תאים, אך ניתן להתאימה למגוון רחב של מבנים. ניתן להשתמש בהידרוגלים של סרט דק כדי ליצור דפוסים ספציפיים של תאים מוגבלים.

שוב, הכינו את התשתית (insert) לפיתוח תרביות תאים מפוליאסטר באמצעות Rain X כפי שנעשה קודם לכן, והניחו אותה על שקף שעבר טיפול ב-Rain X. לאחר מכן, העבירו בעזרת פיפט 250 עד 300 µL של מצע פולימריזציה לתחתית התשתית המטופלת. נפח זה מספיק כדי לכסות במעט את תחתית התשתית. דגרו בטמפרטורה של החדר למשך 30 עד 45 דקות כדי לאפשר למצע לחלחל דרך ממברנת התשתית. שאבו את עודפי המצע מהתשתית באמצעות מיקרו-פיפט.

לאחר מכן, טפטפו כמות מספקת של שמן שקוף ל-UV לתחתית המבנית (insert) כדי לכסות את השטח לחלוטין. דגרו את המבנית בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות, זמן המספיק כדי שהשמן יגבש שכבה נפרדת מעל תווך הפולימריזציה. לאחר רוויית ממברנת המבנית, טענו מסכה מתאימה ל-DMD.

לאחר הנחת המבואית (insert) והסלייד תחת ה-DMD, השרו קשירה צולבת (cross linking) של הפיגים על ידי חשיפה לאור UV. שטפו את המבואית שלוש פעמים עם DPBS סטרילי ו-1% pen strap. לאחר השטיפה, העבירו את המבואית לפלטת תרבית רקמות של שישה בארות, קצרו ורססו את התאים שיושבחו. שאבו את המדיום והשביו את משקע התאים במדיום גדילה בריכוז הרצוי, בין 10⁴ ל-10⁶ תאים למילליליטר.

לאחר מכן, טפטפו בעזרת פיפט נפח מספיק של תרחיף התאים לתוך תבנית השכבה (cell culture insert) כדי להשיג את צפיפות התאים הרצויה. הוסיפו כמות מספקת של מצע גידול מתחת לתבנית כדי לשמור באופן מלא על חיוניות התאים. דגרו בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 48 שעות של דגירה.

שטפו את הרכיב המוחדר (insert) שלוש פעמים ב-DPBS סטרילי וב-1% pen strep כדי להסיר תאים שאינם קשורים. לאחר מכן, הוסיפו מצע גידול טרי לבארים. החזירו את הפלטה לאינקובטור לתרביות רקמה ובצעו החלפת מצעים מדי 48 שעות.

כאן בוצע פולימריזציה של PEG מגביל-תאים כשכבה דקה באמצעות תבנית בדיקה, כדי להצמיד באופן סלקטיבי תאים מופרדים לממברנה מצופה קולגן של תומכים חדירים. התאים סומנו לאחר 48 שעות של אינקובציה. תאים חיים המסומנים ב-calc am נראים בירוק, בעוד שתאים מתים מסומנים ב-atherium homodimer one ונראים באדום.

ניתן לראות כי היצמדות מינימלית של תאים מתרחשת באזור המכיל את שכבת ה-PEG הדקה שלהם. זוהי דוגמה לתוצאה לא רצויה. פולימריזציה חלקית של PEG הובילה למבנה PEG בלתי שמיש.

פולימריזציה לקויה עלולה להתרחש עקב נוכחות של מניסקוס בתהליכי הפרה-פולימר, כמויות לא מספיקות של תווך הפולימריזציה, חשיפה לא מספקת ל-UV או מיקוד שגוי של האופטיקה. זוהי דוגמה למעטפת תלת-ממדית לקויה של הידרוג'ל כפול עבור תרבית צמחים מסוג A-D-R-G-X. בתמונה זו ניתן לראות כי הנוריטים הנראים בירוק הצליחו לגדול מחוץ לתעלות ה-peg המודפסות.

דבר זה קורה לעיתים קרובות אם מטריצה טהורה גולשת מעל חלק ה-PEG במהלך ההזרקה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות סטנדרטיות אחרות, כגון patch clamping או אימונוהיסטוכימיה, כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לאלקטרופיזיולוגיה או לביטוי פנוטיפי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה באופן השימוש בפוטוליתוגרפיה עם הקרנת מסכה דינמית כדי להגדיר את התצוגה הגאומטרית של מערכות הידרוג'ל בודדות או כפולות לצורך חקר תרביות של תאי עצב.