Name: המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 6 s
Description: למד ליצור מערכת תרבות עצבית דו-הידרוג'לית ממוקרנת באמצעות צילום מסכה דינמי. השיטה משתמשת במכשיר מיקרו-מראות דיגיטלי ליצירת תבניות גיאומטריות מדויקות לחקר צמיחת נויריטים וחייות תאים עצביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות במעבדה של פרופ &#39;אנתוני Windebank לשיתוף המומחיות שלהם על DRG לנתיחה ותרבות, כמו גם פרופ&#39; Shaochen חן לדיונים מועיל בדבר ההתקנה DMD. מחקר זה מומן בחלקו על ידי אוניברסיטת טוליין ומענקים מועצת העוצרים לואיזיאנה (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) ו-NIH (NS065374).

<ol><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
<li>Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+three+dimensions%3A+3D+nanostructured+environments+for+cell+culture+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine.</a> Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).</li>
<li>Maltman, D. J., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+three-dimensional+cell+culture+technology+aimed+at+improving+the+accuracy+of+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).</li>
<li>Irons, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+neural+constructs%3A+a+novel+platform+for+neurophysiological+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation.</a> Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).</li>
<li>Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+in+rotating+bioreactors+promotes+maintenance+of+cardiac+myocyte+electrophysiology+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties.</a> Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Cushing, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+science.+Hydrogel+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Materials science. Hydrogel cell cultures.</a> Science. 316, 1133-1134 (2007).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324, 59-63 (2009).</li>
<li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photolabile+hydrogel+for+guided+three-dimensional+cell+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration.</a> Nature Materials. 3, 249-253 (2004).</li>
<li>Wylie, R. G., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+micropatterning+of+amines+within+an+agarose+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel.</a> Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).</li>
<li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+three-dimensional+hyaluronic+acid+nanofibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).</li>
<li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li>
<li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li>
<li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li>
<li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+tectonics%3A+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li>
<li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex%2C+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li>
<li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת לעיל יכול לשמש חוקר כל המבקשים פשוטה לשחזור התרבות מערכות התא. תיאורטית, בשל המגוון הרחב של הידרוג photopolymerizable זמין, הסביבה יכולה להיות מותאם כדי לאפשר להשתמש בכל סוג תא, כולל explants רקמה שלמה. בנוסף, מערכת הידרוג כפולה מאפשרת שליטה מרחבית משופרת במצגת של העצמי polymerizing הידרוג, אשר נוטים ליצור צורות אמורפיות בכוחות עצמם. כתוצאה מכך &quot;2.5D&quot; בונה micropatterned הידרוג לספק מטריצה ​​3D לצמיחה עצבית הציג בתצורת 2D, המאפשרת הערכה מיקרוסקופית נוח. המצע שעליו ג&#39;לים polymerized הם יכולים גם להיות מגוונות, ומאפשר שליטה רבה יותר בתכנון הניסוי. השיטות שלנו הן מותאמות לשימוש עם התרבות תומך התא חדיר, כפי שראינו הכדאיות משופרת (איור 4) לעומת פילמור בשקופיות זכוכית (מידע לא מוצג). עם זאת, משטחים פילמור אחרים עשויים לחול יותר עבור יישומים שונים: ייצור על שקופיות הזכוכית המשמשים בניסויים מיקרופלואידיקה או במצטבר תצורות התא, למשל. הניסיון שלנו עם מערכות אלה תרבות הוביל לזיהוי של אזורים פוטנציאליים של קושי. ראשית, טכניקות זהירות נדרשים כדי לשמור על סטריליות של מבנים. בשל אופייה מגושם של ההתקנה DMD, קשה להפעיל צעדים פילמור בתנאים סטריליים. כדי להתמודד עם בעיה זו, הצעד לשטוף המתואר השיטות מועיל, ואנטיביוטיקה יש להשתמש בתקשורת בכלל. בנוסף, עובי הצורה הסופית של לבנות את polymerized תלויה מאוד על התנהגות נוזלים של תערובת טרום הפולימר, ואת הנוכחות של המניסקוס עלול לגרום בונה ג&#39;ל כי הם רזה מדי או polymerized חלקית (איור 6). שני צעדים שניתן לנקוט כדי לצמצם את היווצרות של המניסקוס הפנימי מוסיף תרבית תאים. עבור הידרוג עבה (&gt; 200 מיקרומטר), ציפוי פשוט של X-Rain סביב הקיר הפנימי של להכניס את די. עם זאת, כפי שתואר בקצרה לעיל, בונה דק (&lt;200 מיקרומטר), שכבת שמן נדרש גם למזער את המניסקוס ולשלול מרווה חמצן פילמור של הרדיקלים החופשיים. החלטה נמצא כי תלוי בעובי, עם ירידה בגודל תכונת הבינה עם ג&#39;ל סמיך יותר ויותר. ההחלטה מגוונות גם תלוי אם התכונה ייצג הקלה חיובי או שלילי הידרוג. עם זאת, השגנו החלטה די בונה עם גדלים תכונה מינימום בקנה מידה של ~ 100 מיקרומטר באמצעות מיקרוסקופ מטרות רק התמקדות אופטיקה. הניסויים שלנו הראו כי בונה הידרוג כפול המתואר כאן מהווים בסיס מצוין ליצירת חוץ גופית הדגמים הבסיסיים של צמיחה הדרכה neurite ו. הטכניקה micropatterning המועסקים הוא עיבוד של השיטות הקיימות 18,19, אך הגדרת שלנו הדגיש פשוט ליישם העיצוב היה מותאם במיוחד הייצור של בונה הידרוג כפול מוסיף על התרבות התא; תרבות מוסיף התא היו חיוניים לשיפור כדאיות התא, כמו גם כמו crosslinking סביב explants רקמות חסיד בעבר. היקף התוצאות הראו מוגבל על ידי האינטרסים של המעבדה שלנו, אולם אנו מאמינים כי שיטות המתוארים בפרסום זה יוכיח שימושי החוקרים מחפשים שיטה, זול יחסית, מהיר וקל לשימוש עבור ייצור של תרבית תאים 3D מודלים.

<table><tbody><tr><td>התקן מיקרו-מראות דיגיטלי (Digital Micromirror Device)</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>תמיכה חדירה מסוג Transwell מצופה קולגן</td><td>Corning</td><td>3491</td><td>מכונה בכתב היד גם כמעתק לתרבית תאים (Cell Culture Insert)</td></tr><tr><td>תמיכה חדירה מסוג Transwell מפוליאסטר</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>מכונה בכתב היד גם כמעתק לתרבית תאים (Cell Culture Insert)</td></tr><tr><td>מצע Neurobasal</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (Fetal Bovine Serum)</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>גורם גידול עצבי (Nerve Growth Factor)</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>שמן</td><td>נעשה שימוש הן בשמן קנולה והן בשמן סיליקון</td><td></td><td>חייב להיות שקוף ל-UV ולמזער את היווצרות המניסקוס (+/-)</td></tr><tr><td>OmniCure Series 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

יותר ויותר, תרבות בדוגמת סביבות התא נעשים בטכניקה רלוונטי ללמוד מאפיינים הסלולר, וחוקרים רבים מאמינים בצורך 3D סביבות לייצג בניסויים במבחנה אשר עדיף לחקות תכונות vivo ב 1-3. מחקרים בתחומים כגון סרטן מחקר 4, ההנדסה העצבית 5, לב ופיזיולוגיה 6, תא-matrix אינטראקציה 7,8 הראו התנהגות התא שונה באופן משמעותי בין תרבויות monolayer מסורתיים בונה 3D. הידרוג משמשים 3D סביבות בגלל הרבגוניות שלהם, במגוון ואת היכולת להתאים את ההרכב המולקולרי באמצעות functionalization 9-12. טכניקות רבות קיימות עבור יצירה של מבנים כמו תאים תומכים מטריצות, כולל electrospinning 13, אלסטומר 14 בולים, דיו להדפסה 15, photopatterning כתוסף 16, photomask סטטי הקרנת-ליתוגרפיה 17, microstereolithography מסכה דינמי 18. למרבה הצער, שיטות אלה כוללות מדרגות ייצור מרובים ו / או ציוד לא להתאמה בקלות לתא קונבנציונאלי ותרבות שיטות רקמות. הטכניקה המועסקים פרוטוקול זה מתאים את שני האחרונים, באמצעות מכשיר micromirror הדיגיטלי (DMD) כדי ליצור photomasks דינמי מסוים גאומטרית crosslinking פולי (אתילן גליקול) (PEG) הידרוג, הנגרמת באמצעות פילמור UV יזם רדיקלים חופשיים. כתוצאה מכך &quot;2.5D&quot; מבנים לספק סביבת 3D מוגבל לצמיחה עצבית. אנו מעסיקים גישה כפול הידרוג&#39;ל, שם PEG משמש מבנה התא מגבילים אזור באספקת ג&#39;ל הרכבה עצמית צורה אחרת אבל התא מתירני עשוי גם Puramatrix או agarose. התהליך הוא ייצור מהיר פשוט צעד אחד אשר לשעתקו מאוד להתאים בקלות לשימוש עם שיטות קונבנציונליות תרבות התא מצעים. Explants רקמות שלמות, כמו הגרעינים עובריים השורש הגבי (DRG), יכול להיות משולב בתוך המבנים הידרוג כפול עבור מבחני ניסיוניים כגון תולדה neurite. בנוסף, התאים ניתק ניתן הגלום הידרוג polymerizing photocrosslinkable או עצמית, או דבק סלקטיבי קרום חדיר תמיכה באמצעות תאים מגבילים photopatterning. שימוש DMD, יצרנו הידרוג בונה עד ~ 1mm עבה, אבל סרט דק (&lt;200 מיקרומטר) מבנים PEG היו מוגבלים על ידי מרווה חמצן התגובה פילמור חינם הרדיקלי. אנו מכן פיתח טכניקה ניצול שכבה של שמן מעל הנוזל פילמור אשר אפשרה פילמור דק מבנה PEG. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הבריאה מהירה של מערכות הידרוג 3D עבור ייצור של תאים עצביים microfabricated ותרבויות רקמות. בונה הידרוג כפול הפגינו בזאת מייצגים צדדי במודלים חוץ גופית שעשוי להיות שימושי עבור מחקרים במדעי המוח מעורבים הישרדות התא, הגירה, ו / או צמיחה הדרכה neurite ו. יתר על כן, כפרוטוקול יכול לעבוד עבור סוגים רבים של תאים הידרוג, יישומים אפשריים הן מגוון עצום.

טכניקות פשוטות מתוארים לייצור מהיר של microfabricated מערכות תרבות עצביים באמצעות מכשיר micromirror דיגיטלי ליתוגרפיה הקרנת דינמי מסכה על מצעים תרבות קבוע התא. אלה מערכות תרבות יכול להיות נציג נוסף של ארכיטקטורה ביולוגי טבעי, ואת הטכניקות המתוארות יכול להיות מותאם עבור יישומים רבים.

סביבות תרבית תאים בעלות תבניות הופכות לטכניקה רלוונטית יותר ויותר לחקר מאפיינים תאיים, וחוקרים רבים מאמינים ב...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מערכת תרביות תאים בעלת תבנית מיקרוסקופית המורכבת מהידרוג'ל כפול למחקרים נוירונליים. דבר זה מושג תחילה על ידי זריעה של שתלי רקמה, כגון גנגליונים של שורש הגב עובריים, על תבתי תרבית תאים חדירים. לאחר מכן, נוצרת תבנית מיקרוסקופית בתוך הידרוג'ל הניתן לקשירה צולבת פוטוכימית באמצעות התקן מראות מיקרוסקופי דיגיטלי (DMD) המשמש כמסכה פוטו-דינמית.לאחר מכן מוסיפים את ההידרוג'ל בעל ההרכבה העצמית במצב טהור, שעשוי להכיל סספנסיה של תאים מופרדים. נדרש זמן דגירה מתאים לפני ביצוע האנליזה התאית. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות חיוניות של תאי עצב וצמיחת נוריטים דרך תצורות גיאומטריות ספציפיות שהוגדרו על ידי ה-DMD.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן ליצור, לשנות ולהקרין במהירות מסה פוטו-דינמית ממרחק, כדי להתאים כמעט לכל תשתית, כגון רכיבי תרבית תאים חדירים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מערכות עצביות, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות שעשויות להפיק תועלת מאילוצים גיאומטריים שניתן להגדיר, כגון סיגנלינג תאי, נדידה של תאים, מגע בין תאים או מורפוגנזה, אם למנות כמה דוגמאות. נורות ה-UV של לוח ה-DMD, המדריך והעדשה עם הגדלה של פי ארבעה מותקנים כולם בצורה אנכית על שולחן בידוד רעידות.מיקרוסקופ הפוך ממוקם מתחת לעדשת העצם כך שניתן יהיה להדמיות את אור המיקוד המוחזר מה-DMD דרך המיקרוסקופ. לפרטים נוספים על הגדרת ה-DMD, אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף. ראשית, הכינו את תבניות השתיל לתרבית תאים בעלות שישה בארות המצופות בקולגן לקבלת תרביות X explan; צפו את דפנות תבניות השתיל לתרבית תאים ב-rain x, תוך הקפדה שלא למרוח rain X על הממברנה עצמה.לאחר מכן, הוסיפו 1.5 milliliters של מצע aian למסננים (inserts) והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide. למחרת, לאחר קצירת גנגליונים של שורש גב עובריים (dorsal root ganglia) מגורי חולדה ביום העוברי E 15, זרעו עד ארבעה DRGs בכל מסנן שש-בארים (six-well insert) מצופה קולגן, והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide כדי לאפשר ל-DRG להיקשר לממברנה.לאחר תקופת האינקובציה, ה-DRGs יהיו מוכנים לפוטו-פולימריזציה. התקן מיקרו-מראות דיגיטלי (DMD) הוא מערך של 1024 על 768 מראות בודדות, אשר מחזירות אור באופן סלקטיבי בהתבסס על מיקום המראה. בהליך זה, ה-DMD משמש ליצירת תבניות של אור על-סגול על גבי photo CROs, הינם הידרוגלים הניתנים לקישור, ובכך יוצר גאומטריות ספציפיות של הידרוגלים באופן פשוט ומהיר.למרות שה-DMD שלנו הוא יחידה עצמאית, ניתן לשלב את המכשיר לשימוש עם מיקרוסקופים קיימים רבים. ראשית, הוציאו את צמחי ה-DRGX מהאינקובטור, ושאבו את כל הנוזל העודף מההכנסה (insert). לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של תווך פולימריזציה לתוך ההכנסה.העבירו את המכלילים עם צמחי ה-DRGX אל על גשמי זכוכית מסוג rain extre והניחו את הגשמיות מתחת ל-DMD. השתמשו בתוכנת ממשק המשתמש הגרפי הבסיסי של ALP three כדי לטעון לתוך ה-DMD את התמונה בשחור-לבן שתשמש כמסכת פוטו. במקרה זה, נבחרה צורה משתעפת כדי לאפשר יישום של מערכות להנחיית נוריטים באמצעות מיקרוסקופ הפוך ומקור אור גלוי מסוג DI.יישרו את נתח הרקמה עם המיקום המתאים במסיכת התמונה, תוך שימוש באור המוחזר מה-DMD כמדריך. לאחר מכן, החליפו את מקור האור הנראה במקור אור UV. האירו את מדיום הפולימריזציה בתוך תרבית התאים.החדירו עד להשלמת הצלובת של ה-PEG. חזרו על הפעולה עבור כל DRG על גבי ההחדרה. לאחר מכן, שטפו כל החדרה שלוש פעמים במי מלח פוספט (PBS) סטריליים המכילים 1% penicillin streptomycin.לבסוף, הוסיפו 1.5 milliliters של מצע גידול מתחת לסבבי תרבית התאים והניחו להם להגיע לשיווי משקל באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 30 דקות. במהלך תקופת האינקובציה, בצעו סוניקציה למטריקס טהור למשך 30 דקות. כדי להמיס את הפפטידים, דללו את התמיסה הריכוזית של 1% לסביבות 0.15% במים סטריליים והוסיפו one microgram per milliliter של למינין מסיס.לאחר 30 דקות, הוצא את התרביות מהאינקובטור ושאיף את כל עודפי המצע מההכנסה (insert). לאחר מכן, תוך כדי צפייה בחלל תחת מיקרוסקופ, שאיף את המצע מתוך האזור החלול במבנה ה-PEG המכיל את ה-DRGX explan, והזרק באמצעות פיפט כ-1 µL של תמיסת מטריקס טהורה לתוך החלל סביב ה-X explan. ודא שהמטריקס הטהורה אינה גולשת מהחלל ב-peg.לאחר מכן, טפטפו 1.5 milliliters של מצע גידול מתחת לרכיב המוכנס (insert) והניחו באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide למשך שעה אחת. כדי להבטיח התאפסות מלאה לאחר פרק זמן זה, החליפו את מצע הגידול והחזירו את התרביות לאינקובטור. מצע הגידול מוחלף בכל 48 שעות של תרבית.דוגמאות למבני הידרוג'ל כפולים המכילים צמחים של DRGX מוצגות כאן. צמחי ה-DRGX סומנו עבור מדדי גדילה ופרוליפרציה. מבנה ה-PEG הפולימרי מופיע באפור, NEURITES של DRG המסומנים ב-beta three tubulin מופיעים בירוק, וצביעת DPI מסמנת את גרעיני התאים המופיעים בכחול.שימו לב כי נדידה תאית והארכת רשת מוגבלים לאזור התאים המאפשר של מבנה ההידרוג'ל הכפול. כמיסה בהידרוג'ל כפול היא מתאימה כאשר משתמשים בכל ג'ל המרכיב עצמו, יחד עם ג'ל הניתן לקשירה פוטו-כימית. במקרה זה, PEG משמש כתמיכה מבנית להצגה גיאומטרית של הג'ל המרכיב עצמו.לדוגמה, pure matrix או aris. סוג הג'ל ובחירת מסכת הפוטו (photo mask) יהיו תלויים ביישום הספציפי הרצוי. טפלו את דפנותיהם של תבניות להשקיית תרביות תאים מפוליאסטר באמצעות rain X כפי שהודגם בעבר.העבירו את הסרט (insert) למשטח זכוכית מצופה rain X והניחו אותו תחת ה-DMD. לאחר מכן, הוסיפו 500 microliters של מדיום פולימריזציה לסרט. טענו את המסכה המתאימה לניסוי הישרדות זה ב-DMD.הצגה גלילית של מטריצה טהורה משמשת לסיוע בדימות של תאים. חשוף את הרכיב המוכנס לאור UV למשך 55 שניות כדי להשרות קשירה צולבת של peg לאחר הקשירה הצולבת. שטוף את החלל שנוצר זה עתה עם DPBS סטרילי ו-1% pen strep.השתמש במיקרו-פיפט או במקלון צמר sterile כדי להסיר את כל הנוזל העודף מהחלל. הכן Matrixx טהור על ידי סוניקציה למשך 30 דקות, דלל ל-0.15% במים סטריליים, בתוספת מיקרוגרם אחד למילליטר של laminin מסיס ו-10% סוכרוז. לאחר מכן, שקיע את התאים המיועדים לתרבית באמצעות צנטריפוגציה.שאבו היטב את המצע ממשקע התאים ושחזרו את השCעק בריכוז של כחמש פעמים 10³ תאים למיליליטר בתמיסת 0.15% pure matrix. קריטי לשאוב את כל המצע ממשקע התאים, שכן pure matrix מתחיל בתהליך של הרכבה עצמית (self-assembly) עם המגע עם תמיסת מלח. לאחר מכן, טפטפו באמצעות פיפט כ-1 µL מתערובת תאי ה-pure matrix המועשרת אל תוך חלל הפיג (peg void).נפח זה בדרך כלל מספיק כדי למלא את החלל הריק מבלי לגלוש; פלפט 1.5 milliliters של מצע גידול מתחת להכנסה (insert). לאחר מכן, העבר את ההידרוג'ל המשני של המטריקס הטהור למדגרה לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide למשך שעה אחת כדי להבטיח ג'לציה (gelation) מלאה. לאחר זמן זה, שאב את המצע והוסף מצע טרי מתחת להכנסה, תוך הקפדה שלא לפגוע במטריקס הטהור החלש מבחינה מכנית.החזירו את התרביות לאינקובטור לתרביות רקמה והחליפו את המצע בכל 48 שעות של תרבית. להלן דוגמאות של נוירונים חיים מ-DRG המעטפים בתוך מגוון מבני הידרוג'ל כפולים. לאחר 48 שעות במצע גידול, התאים סומנו בסימון סידן, סמן לתאים חיים המופיע בצבע ירוק.כאן, בשל האופי הדינמי של מסכת הצילום של ה-DMD, הגאומטריה הזמינה לכלילה מוגבלת אך ורק על ידי הממדים והרזולוציה של האופטיקה. כלילה בודדת של הידרוג'ל מתאימה כאשר ניתן לבחון את התאים בתוך הידרוג'ל הניתן להשחלה פוטו-כימית, בדומה לתרבית תאים בפוליאסטר. הכניסו באמצעות Rain X והניחו תחת ה-DMD על שקופית מצופה ב-Rain X.כפי שנעשה קודם לכן, העבירו בעזרת פיפט את התאים המיועדים לתרבית ישירות אל מצע הפולימריזציה בריכוז הרצוי וערבבו היטב כדי להבטיח התפלגות הומוגנית. לאחר מכן, העבירו בעזרת פיפט 500 µL מתערובת התאים במצע הפולימריזציה אל תוך ההכנסה (insert). בחרו את המסכה המתאימה והטעינו אותה על ה-DMD; השראו קשירת PEG על ידי חשיפה לאור UV למשך 55 שניות.עבור מחקרי הישרדות תאים, נעשה שימוש במסכה מעגלית בסיסית המייצגת גליל; שטפו את התשת (insert) שלוש פעמים ב-DPBS סטרילי וב-1% pen strep, ולאחר מכן העבירו בפיפט 1.5 milliliters של מצע גידול מתחת לתשת וכמות מספקת של מצע גידול מעליו כדי להטביע את התשת לחלוטין; דגרו ב-37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide עם החלפת מצעים בכל 48 שעות. להלן דוגמה לנוירונים קורטיקליים חיים ומפורקים המעטופים בתוך peg. תאים חיים מסומנים ב-calcium am ומופיעים בירוק, בעוד שתאים מתים מסומנים ב-ahy homodimer one ומופיעים באדום.הכלילה ב-PEG נועדה לשמש כדוגמה בלבד, שכן PEG אינו מהווה סביבה אידיאלית לתאי עצב. הגאומטריה הנבחרת מייצגת אמצעי פשוט לבחינת חיות תאים, אך ניתן להתאימה למגוון רחב של מבנים. ניתן להשתמש בהידרוגלים של סרט דק כדי ליצור דפוסים ספציפיים של תאים מוגבלים.שוב, הכינו את התשתית (insert) לפיתוח תרביות תאים מפוליאסטר באמצעות Rain X כפי שנעשה קודם לכן, והניחו אותה על שקף שעבר טיפול ב-Rain X. לאחר מכן, העבירו בעזרת פיפט 250 עד 300 µL של מצע פולימריזציה לתחתית התשתית המטופלת. נפח זה מספיק כדי לכסות במעט את תחתית התשתית. דגרו בטמפרטורה של החדר למשך 30 עד 45 דקות כדי לאפשר למצע לחלחל דרך ממברנת התשתית. שאבו את עודפי המצע מהתשתית באמצעות מיקרו-פיפט.לאחר מכן, טפטפו כמות מספקת של שמן שקוף ל-UV לתחתית המבנית (insert) כדי לכסות את השטח לחלוטין. דגרו את המבנית בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות, זמן המספיק כדי שהשמן יגבש שכבה נפרדת מעל תווך הפולימריזציה. לאחר רוויית ממברנת המבנית, טענו מסכה מתאימה ל-DMD.לאחר הנחת המבואית (insert) והסלייד תחת ה-DMD, השרו קשירה צולבת (cross linking) של הפיגים על ידי חשיפה לאור UV. שטפו את המבואית שלוש פעמים עם DPBS סטרילי ו-1% pen strap. לאחר השטיפה, העבירו את המבואית לפלטת תרבית רקמות של שישה בארות, קצרו ורססו את התאים שיושבחו. שאבו את המדיום והשביו את משקע התאים במדיום גדילה בריכוז הרצוי, בין 10⁴ ל-10⁶ תאים למילליליטר.לאחר מכן, טפטפו בעזרת פיפט נפח מספיק של תרחיף התאים לתוך תבנית השכבה (cell culture insert) כדי להשיג את צפיפות התאים הרצויה. הוסיפו כמות מספקת של מצע גידול מתחת לתבנית כדי לשמור באופן מלא על חיוניות התאים. דגרו בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 48 שעות של דגירה.שטפו את הרכיב המוחדר (insert) שלוש פעמים ב-DPBS סטרילי וב-1% pen strep כדי להסיר תאים שאינם קשורים. לאחר מכן, הוסיפו מצע גידול טרי לבארים. החזירו את הפלטה לאינקובטור לתרביות רקמה ובצעו החלפת מצעים מדי 48 שעות.כאן בוצע פולימריזציה של PEG מגביל-תאים כשכבה דקה באמצעות תבנית בדיקה, כדי להצמיד באופן סלקטיבי תאים מופרדים לממברנה מצופה קולגן של תומכים חדירים. התאים סומנו לאחר 48 שעות של אינקובציה. תאים חיים המסומנים ב-calc am נראים בירוק, בעוד שתאים מתים מסומנים ב-atherium homodimer one ונראים באדום.ניתן לראות כי היצמדות מינימלית של תאים מתרחשת באזור המכיל את שכבת ה-PEG הדקה שלהם. זוהי דוגמה לתוצאה לא רצויה. פולימריזציה חלקית של PEG הובילה למבנה PEG בלתי שמיש.פולימריזציה לקויה עלולה להתרחש עקב נוכחות של מניסקוס בתהליכי הפרה-פולימר, כמויות לא מספיקות של תווך הפולימריזציה, חשיפה לא מספקת ל-UV או מיקוד שגוי של האופטיקה. זוהי דוגמה למעטפת תלת-ממדית לקויה של הידרוג'ל כפול עבור תרבית צמחים מסוג A-D-R-G-X. בתמונה זו ניתן לראות כי הנוריטים הנראים בירוק הצליחו לגדול מחוץ לתעלות ה-peg המודפסות.דבר זה קורה לעיתים קרובות אם מטריצה טהורה גולשת מעל חלק ה-PEG במהלך ההזרקה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות סטנדרטיות אחרות, כגון patch clamping או אימונוהיסטוכימיה, כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לאלקטרופיזיולוגיה או לביטוי פנוטיפי.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה באופן השימוש בפוטוליתוגרפיה עם הקרנת מסכה דינמית כדי להגדיר את התצוגה הגאומטרית של מערכות הידרוג'ל בודדות או כפולות לצורך חקר תרביות של תאי עצב.

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את ייצור של מערך microactuator מכלל הודעות העקורים אנכית שבו הטכנולוגיה מבוססת, ואיך הטכנולוגיה הזו בסיס ניתן לשנות לנהל תפוקה גבוהה תרבית תאים דינמי מכנית בתרבות הן דו מימדי ותלת מימדי פרדיגמות.

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

פרוטוקולים לעריכה אחת נוירון microfluidic ומיסוך מים לדפוסי פלזמה בשבב של ציפויים ביולוגי מתוארים. ניתן להכין שיתוף תרבויות מקושרות ביותר באמצעות תשומות תא מינימליות.

הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם Precision תא בודד

אנו מתארים ייצור של יריעות הידרוג'ל בתבנית מיקרו בתהליך פשוט, הניתן להרכבה ולתפעל בצורה עצמאית. באמצעות יריעות הידרוג'ל מודולריות אלה, ניתן ליצור מערכת תרבית תאים תלת מימדית פשוטה בקנה מידה מאקרו עם מיקרו-סביבה תאית מבוקרת.

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבות תאים בודדים עם פלטפורמה מיקרופלואידית, המשתמשת בתפיסת עיצוב מיקרו-באר חדשה כדי לאפשר בידוד תא בודד ביעילות גבוהה ותרבית משובטת לטווח ארוך.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

אנו מתארים תהליך רציף להיווצרות בתיווך אור ודפוס ביוכימי לאחר מכן של מטריצות הידרוג'ל סינתטיות ליישומי תרבית תאים תלת מימדיים. מודגמת בנייה ושינוי של הידרוג'לים עם כימיה של פוטו-קליק תואם ציטו. בנוסף, מוצגות טכניקות קלות לכימות והתבוננות בדפוסים וקביעת כדאיות התאים בתוך הידרוג'לים אלה.

אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

פרוטוקולים מתוארים להרכבת מתכלה thermoresponsive hydrogels מבוסס על hydrazone cross-linking של oligomers פולימריים על הסולם בתפזורת, microscale, ו ננו, והשני עבור הכנת ג'ל חלקיקים והן nanofibers.

בדיית Thermoresponsive Hydrogels מתכלה-פיסיקליות מרובים באמצעות שחול תגובתי, מיקרופלואידיקה, הרכבה עצמית, Electrospinning

פרוטוקול זה מציג שיטת המיקרו-ליתוגרפיה ללא הגבלה, פשוטה ונגישה לבעלי רקע ביוהנדסי מוגבל. שיטה זו משתמשת בסטנסילים מותאמים אישית לחתוך לייזר כדי מיקרו מטריצות חלבונים מטריצה בצורה של עניין עבור מודלדירוג תאים מורפולוגיות. ההליך עבור מיקרופנינג הוא הפגין באמצעות מושרה המושרה תא גזע המופק הקרדיוציטים.

פשוט ליתוגרפיה-ללא מיקרוהדפס תא יחיד באמצעות סטנסילים לייזר לחתוך

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר ייצור אוטומטי של מיקרופטרנים המתקננים את צורת התא כדי לחקור מבנים ציטוסקלטליים בתוך תאי יונקים. טכניקה ידידותית למשתמש זו ניתנת להגדרה עם מערכות הדמיה זמינות מסחרית ואינה דורשת ציוד מיוחד שאינו נגיש למעבדות סטנדרטיות לביולוגיה של התא.

שליטה בגיאומטריית התא באמצעות מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

באופן מסורתי, תרבית תאים מבוצעת על מצעים מישוריים המחקים בצורה גרועה את הסביבה הטבעית של תאים in vivo. כאן אנו מתארים שיטה לייצור מצעי תרביות תאים עם גיאומטריות מעוגלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית וחלבונים חוץ-תאיים מיקרו-פטרייתיים, המאפשרת חקירה שיטתית של חישה תאית של רמזים חוץ-תאיים אלה.

יצירת מיקרו-סביבה תאית רב-תכליתית על-ידי UV-Photopatterning של מצעי תרביות תאים תלת-ממדיים

הדפסה תלת ממדית בקנה מידה מיקרומטרי מאפשרת אב טיפוס מהיר של התקנים פולימריים עבור תרביות תאים עצביים. כהוכחה עקרונית, קשרים מבניים בין נוירונים הוגבלו על ידי יצירת מחסומים וערוצים המשפיעים על צמיחת נוירוטים, בעוד שההשלכות התפקודיות של מניפולציה כזו נצפו על ידי אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית.

פילמור שני פוטונים הדפסה תלת-ממדית של התקני תרבית תאים עצביים בקנה מידה מיקרוני

למד ליצור מערכת תרבות עצבית דו-הידרוג'לית ממוקרנת באמצעות צילום מסכה דינמי. השיטה משתמשת במכשיר מיקרו-מראות דיגיטלי ליצירת תבניות גיאומטריות מדויקות לחקר צמיחת נויריטים וחייות תאים עצביים.

המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

גלה סרטונים נוספים