אפיון פיזיולוגיים, מורפולוגי והעצבית של נוירונים מווסתת על ידי תנועת
21 באפריל 2011
הטכניקה מתוארת לכמת את בתגובה פיזיולוגית vivo של נוירונים יונקים במהלך התנועה לתאם את הפיזיולוגיה של הנוירון עם מורפולוגיה העצבית, פנוטיפ neurochemical ו microcircuitry הסינפטי.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקליט את התגובה הפיזיולוגית של נוירונים בודדים במהלך תנועה, ולאחר מכן לאפיין את המורפולוגיה והנוירוכימיה של נוירונים אלו. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמה והכנה כירורגית של בעל החיים. השלב הבא הוא הקלטה אלקטרופיזיולוגית של התגובה התוך-תאית של נוירונים בודדים במהלך תנועה.
לאחר ביצוע פרפוזיה לבעל החיים ועיבוד המוח, השלב הסופי הוא ויזואליזציה וניתוח של התגובה הפיזיולוגית והמורפולוגיה הנוירונלית. בסופו של דבר, השילוב בין טכניקות של רישום נוירונלי תוך-תאי, אימונוכימיה וניתוח, מאפשר להראות את המודולציות בפוטנציאל הממברנה של נוירונים בודדים במהלך תנועה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית תאים, הוא שהקשרים הנוירונליים והקליטות הסינפטיות נשמרים, והנוירונים אינם מופרדים או מועברים למדיומים מלאכותיים. ביום שלפני הניסוי, מזריקים סמן נוירונלי, כגון horseradish peroxidase, לאזורי המטרה הפריפריים כדי לסמן רטרוגרדית נוירונים מוטוריים.
ביום למחרת הרדימו את החולדה והניחו אותה על משטח חימום, גלחו את העור מעל החלק האחורי של הגולגולת באמצעות מכונת גילוח לבעלי חיים תוך שימוש בטכניקה אספטית. בצעו חתך לאורך הירך הפנימית, והחדירו קנולה לווריד הפמורלי למתן הרדמה נוספת. החדירו קנולה נוספת לעורק הפמורלי למעקב אחר לחץ הדם.
לבסוף, הכניסו קנולה לקנה הנשימה. לאחר מכן, מקמו את החולדה במסגרת סטריאוטקסית. בצעו קרניוטומיה כדי לחשוף את המוחון, תוך הקפדה להימנע מהסינוס הוורידי הגדול הממוקם ישירות מתחת לחיבור שבין העצם הפריאטלית לעצם האינטר-פריאטלית.
בשלב הבא, כסו את פני השטח של המוח בשמן מינרלי מחומם. כעת הדביקו את הלסת התחתונה למוט המחובר לרטט אלקטרומגנטי. תנועת הלסת התחתונה נשלטת על ידי אותות פקודה המועברים לרטט ממחולל אותות.
לאחר מכן, מקמו אלקטרודת הארקה מתחת לעור בסמוך לקרניוטומיה. כדי להכין את האלקטרודות התוך-תאיות, מלאו מיקרו-אלקטרודות בתמיסת צבע IDE או tetraethyl diamine. עכבת האלקטרודות צריכה להיות 60 עד 80 mega ohms עבור אקסונים בעלי קוטר גדול, ו-80 עד 150 mega ohms עבור אקסונים אפרנטיים קטנים ונוירונים מקשרים.
בשלב הבא, הכניסו את המיקרו-אלקטרודה לתוך שלב הראש (head stage) של האלקטרומטר באמצעות טלסקופ קטן המקובע במיקומו מאחורי ראשו של בעל החיים. הדמיאנו את המיקרו-אלקטרודה דרך ה-redle המובנית של הטלסקופ בהגדלה של 20 x. אזור המטרה נמצא במרחק של כ-0.5 millimeters coddle מהגבול התחתון של ה-inferior colliculus.
כעת צרו פתח קטן ב-pia mater כדי לאפשר מיקום מדויק של פני השטח של המוח. בצעו פיצוי יתר למשוב הקיבול (capacitance feedback), כך שכאשר האלקטרודה תיגע במוח, ייווצר אות משוב. התקדמו עם האלקטרודה עד שהיא תיכנס לתוך המוח.
השלב הבא הוא להפעיל תזוזה חוזרת של הלסת התחתונה. לאחר מכן, בעזרת מנוע פולסי (stepping motor), הקידמו את האלקטרודה אל תוך המוח. כאשר חדירה לנוירון תצוין על ידי ירידה פתאומית בפוטנציאל ה-dc ופעילות סינפטית מתמשכת, הפסיקו את קידום האלקטרודה.
כאשר החדירה נחשבת ליציבה, התחל בתנועות לסנאט של סוג ramp and hold ושל תנועות סינוסואידליות. רשום את התגובה הנוירונלית ואפיין את הנוירון על בסיס תגובתו. לאחר מכן, כדי למפות את השדה הרספטיבי של הנוירון, השתמש במ probes קהה כדי לבחון את העור מסביב לראש ואת החלל התוך-פה.
בחן את תגובת הנוירון לגירויים אחרים, כגון התכווצות שרירים או גירויים נוקסיים (noxious stimuli). עם סיום ההקלטות, הזרק זרם DC של 1 עד 4 nano amp, להזרקה כוללת של 15 עד 70 nano amp minutes. עקוב אחר חדירות האלקטרודה והפסק את הזרקת הזרם.
אם פוטנציאל הממברנה הופך לחיובי יותר מ-30- מיליוולט, השלב הבא הוא חיתוך של רקמת המוח. לאחר הרדמה ופרפוזיה של בעל החיים, הוצא את המוח. לאחר מכן, בצע חיתוכים בעובי של 50 עד 100 מיקרון במישור הפרונטלי, הסגיטלי או ההוריזונטלי.
כדי להדמיות את הקשר בין הנוירון התחושתי המסומן לבין מגוון של נוירונים מוטוריים, יש לעבד את הרקמה עבור H-R-P-D-A-B או Texas red, בהתאם לסוג הרקמה; ניתן לבצע ניתוחים נוספים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקאלי, או באמצעות תוכנה למיקום משותף כמותי (quantitative colocalization). במידת הצורך, ניתן לבצע עיבוד אימונוכימי עבור synaptophysin כדי למקם במדויק סינפסות בתוך נוירונים מסומנים. איור זה מציג נוירון מגזע המוח שהוזרק לו IDE לאחר אפיון אלקטרופיזיולוגי.
בהתבסס על התגובה העצבית במהלך התנועה, ניתן לזהות נוירון זה כנוירון אפרנטי משני של כישורי שריר. המסגרת החומה מציינת את מיקומו של הגרעין המוטורי של עצב השלישייה. איור זה מציג את התגובה הפיזיולוגית של נוירון תחושתי במהלך תזוזת הלסת.
תגובת הנוירון מיוצגת כתדירות פריקה רגעית. שימו לב כי התגובה מחקה מקרוב את תזוזת הלסת התחתונה (mandible), מה שמעיד על כך שנוירון מסוים זה מספק משוב תחושתי הקשור למיקום הלסת התחתונה. איור זה מציג נוירון תחושתי שהגיב במהלך דיגום של השריר.
הנוירון נצבע ב-ide לאחר עיבוד אימונוכימי. מקלות הסינפסה, המופיעים כבליטות אדומות, נראים במיקום משותף (co-localized) עם synaptophysin הצהוב. הצבע הירוק הוא צביעת missile פלואורסצנטית.
איור זה הוא אנימציה של אקסון מנוירון אפרנטי ראשוני של כישור שריר. מספר חתכים אופטיים של הנוירון המסומן שימשו ליצירת האנימציה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה קונפוקלית, וסימון נוירונלי בדרגה קדמית (anterograde) או רטרוגרדית (retrograde) כדי לענות על שאלות נוספות לגבי המאפיינים an ultra-structural של הנוירון, קולוקליזציה של מוליכים עצביים עם קשרי סינפטיים וקישוריות נוירונלית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה לכימות התגובה הפיזיולוגית in vivo של נוירונים ביונקים במהלך תנועה. היא מקשרת בין הפיזיולוגיה הנוירונלית לבין מורפולוגיה, פנוטיפ נוירוכימי ומעגלים סינפטיים זעירים.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- נוירו-אנטומיה
רקע
- הקלטה של תגובות פיזיולוגיות של נוירונים היא חיונית להבנת תפקודם.
- שיטות קיימות משבשות לעיתים קרובות את הקשרים הנוירונליים.
- טכניקה זו משמרת את הסביבה הטבעית של הנוירונים.
- סומנים נוירונליים משמשים לסימון נוירונים ספציפיים לצורך מחקר.
מטרת המחקר
- להקליט את התגובה הפיזיולוגית של נוירונים בודדים במהלך תנועה.
- לאפיין את המורפולוגיה והנוירוכימיה של נוירונים אלו.
- לנתח את הקשר בין הפעילות הנוירונלית למבנה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הרדמה והכנה כירורגית של בעל החיים.
- רישום אלקטרופיזיולוגי של תגובות תוך-תאיות במהלך תנועה.
- פרפוזיה של בעל החיים והכנת המוח לצורך אנליזה.
- הדמיה ואנליזה של מורפולוגיה נוירונלית ותגובות פיזיולוגיות.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של מודולציות בפוטנציאל הממברנה של נוירונים במהלך תנועה.
- הצגה של קשרים נוירונליים וקלט סינפטי שנשמרו.
- שילוב של טכניקות סיפק תובנות לגבי התנהגות נוירונלית.
- הדגשת יתרונות לעומת שיטות מסורתיות של תרביות תאים.
מסקנות
- טכניקה זו מציעה גישה חדשנית לחקר פיזיולוגיה נוירונלית in vivo.
- היא משפרת את ההבנה של הקשר שבין פעילות נוירונלית למורפולוגיה.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו כדי לבחון תפקודי נוירונים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת האופן שבו נוירונים בודדים מגיבים במהלך תנועה היא קריטית להפחתת סיכונים בתהליך התיקוף של מטרות (target validation) בתגליות של תרופות למדעי המוח. טכניקה זו מאפשרת הבנה מכניסטית על ידי מתאם בין פעילות פיזיולוגית לבין מורפולוגיה ונוירוכימיה במעגלים שלמים, ובכך תומכת בביטחון חיזוי לגבי המעורבות של המטרה (target engagement). היא נותנת מענה לפער מרכזי במחקר סנסורי-מוטורי, שבו שיטות סטטיות או חוץ-תאיות אינן מצליחות ללכוד דינמיקות תפקודיות במהלך התנהגות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקת היפותזות טיפוליות על ידי קישור דפוסי פריקה עצבית במהלך תנועה לסוגי תאים ומסלולים ספציפיים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על מודולציה עצבית בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי אפיון פנוטיפים נוירוכימיים וקישוריות סינפטית של נוירונים שעברו מודולציה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות עצביות שעברו ולידציה עם תגובות פיזיולוגיות מכמתות לצורך סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- שחזוריות: סטנדרטיזציה של האפיון המורפולוגי והנוירוכימי להבטחת תוצאות עקביות בין ניסויים שונים.
- יכולת הרחבה: ייעול השימוש החוזר בפלטפורמה על ידי מתן אפשרות למיפוי נוירונים מפורט שניתן לשלב עם אימונוכימיה או מיקרוסקופיה אלקטרונית לצורך ניתוח מולטיפלקס.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשרת בין הגילוי לוולידציה פרה-קלינית על ידי שימור המעגלים המקוריים במהלך מחקרי תנועה in vivo.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מפחיתה עמימות בתפקוד המטרה על ידי מתאם (קורלציה) בין הפעילות לבין מאפיינים אולטרה-סטרוקטורליים וקלט סינפטי.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת בסיס להחלטות go/no-go באמצעות פרופיל נוירונים מקיף התומך בהתאמה של ביו-מרקרים ובתיקוף של מסלולים.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות מטרות מוקדם ועד לאפיון פרה-קליני, על ידי אספקת נתונים מבניים ותפקודיים על נוירונים הפעילים במהלך תנועה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים באמצעות תיעוד תגובות תוך-תאיות במהלך התנהגויות מוטוריות מוגדרות, כגון תנועת הלסת.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של בדיקות (assays) באמצעות ויזואליזציה וכמותיות הדירות של מורפולוגיה נוירונלית ומודולציה פיזיולוגית.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של פוטנציאל ממברנה ונתונים של קולוקליזציה נוירוכימית המאפשרים השוואה אובייקטיבית של מצבים נוירונליים.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי שימור מיקרו-מעגלים סינפטיים, מה שמאפשר רציפות מהתגובה הפיזיולוגית ועד לתיקוף מבני.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמת אפיון רב-פעמית שניתן להחיל על מערכות תחושתיות, מוטוריות ומערכות של נוירונים מקשרים (interneurons) במודלים שונים של מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות קורלציה של פיזיולוגיה, מורפולוגיה ונוירוכימיה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות הכנה כירורגית קבועה, פרוטוקולי אלקטרודות ושלבי עיבוד רקמות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות באמצעות אפיון מקיף של נוירונים in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתונים רב-מודאליים המנחים את בחירת המטרות והחלטות הקידום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה תוך-תאית, הכנה כירורגית וטכניקות להזרקת סומנים עצביים.
- תלוי במכשור ייעודי הכולל אלקטרומטרים, מחוללי אותות, מנועי צעדים ומערכות מיקרוסקופיה לדימוי באור, אלקטרונים או קונפוקלי.
- מחייב סטנדרטיזציה רב-צוותית של פרוטוקולי הרדמה, שיטות פרפוזיה וחיתוך רקמות כדי להבטיח עקביות בנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הטכניקה על סוגים שונים של נוירונים או אזורי מוח מעבר למערכת התריגמינלית.
- מוגבל בשל האתגר הטכני של שמירה על רישומים תוך-תאיים יציבים במהלך תנועה, דבר התלוי בעכבת האלקטרודה ובייצוב המוח.
