Name: אפיון פיזיולוגיים, מורפולוגי והעצבית של נוירונים מווסתת על ידי תנועת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: חקור תיעוד תגובות פיזיולוגיות של נוירונים יונקים במהלך תנועה באמצעות הקלטה תוך-תאית ואימונוכימיה. שיטה זו שומרת על חיבורים סינפטיים ומאפשרת ניתוח מורפולוגי מפורט של הפעילות העצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אני מודה אנתוני טיילור להכשרה ראשונית בהקלטה תאיים vivo ו בראון מקסוול לעזרה עם הפיתוח הראשוני של טכניקת צביעה תאיים. אני מודה כסף מ לעזרה עם המאקרו התגודדות. חוקרים רבים שאיתם אני שיתפו פעולה סיפק תובנה לתוך בפיתוח טכניקה זו, כולל ר דונגה, מ Moritani, פ &#39;לואו, ר&#39; Ambalavanar. טכניקה זו פותחה בסיוע ניכר של NIH מענקים DE10132, DE15386 ו RR017971.

1. הכנת בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברוש עם נתרן pentobarbital (IP 50mg/kg) ומניחים על משטח חימום. לגלח את העור המכסה את הגולגולת האחורי עם קוצץ בעלי חיים. בדוק את בעלי החיים כדי להבטיח רמה כירורגית של רמת הרדמה התקבל על ידי בדיקת העדר רפלקס נסיגה הניקוד כאשר האצבעות הן צבט כמו גם העדר רפלקס palpebral. בדוק את רמת הרדמה כל 15 דקות לשמור על רמה כירורגית של anesthetisa על ידי זריקות של 15mg/kg נתרן pentobarbital כל 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה aseptic ולעשות חתך באזור המפשעה דיסטלי רק כדי הקפל שנוצר על ידי הבטן והירך הפנימית להוסיף צינורית (1 מ"מ קוטר, קליי אדמס) לתוך וריד הירך, והוא עורק הירך. ביצוע חתך קו האמצע באזור submandibular, משקפים את השרירים infrahyoid. ביצוע חתך קטן קנה הנשימה להוסיף צינורית (2 מ"מ קוטר), כדי לאפשר אוורור. טיי תפר סביב trachael cannual לאבטח אותו בלחץ הדם הדיאסטולי מערכתית place.Monitor ו הסיסטולי דרך צינורית העורקים. בנוסף ניטור נסיגה רפלקס palpebral כעת לנטר את לחץ הדם על מנת להעריך את רמת הרדמה. ניהול הרדמה נוספות בעת הצורך דרך צינורית ורידי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חולדה לתוך מסגרת stereotaxic ולבצע craniotomy לחשוף את המוח הקטן. חבר את צינורית לקנה הנשימה אל הנשמה מכרסמים. לאוורר את חיה עם נפח של 2 ס"מ 3 בקצב של 100/min עם אוויר humidified. לחץ חיובי בסוף הנשיפה של 1 ס"מ H 2 O יש לשמור כדי למנוע התמוטטות ריאה. כל 15 דקות hyperinflate לריאות כדי למנוע atelectasis. ואז לכסות את פני השטח של המוח עם שמן מינרלי מחומם (30 מעלות צלזיוס). היזהר, כדי למנוע את סינוס ורידי גדול הממוקם ישירות מתחת לצומת בין הקודקודית ועצמות interparietal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל דבק cyanoacrylate למוט מצמידים את הויברטור אלקטרומגנטי ולצרף את המוט diastema של הלסת. הזז את הלסת התחתונה אותות באמצעות הפקודה כדי ויברטור מ או פלט / מחשב D או מחולל אותות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים siliver-כסף כלוריד אלקטרודה הארקה מתחת לעור הסמוך craniotomy. </li></ol> 2. אלקטרודה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק microelectrodes מ זכוכית קוורץ או aluminosilicate באמצעות חולץ microelectrode אופקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את microelectrode עם biotinamide 5-10% מומס 0.25M KCl ו 0.5m טריס HCl חיץ (pH 7.6) או tetramethlyrhodamine 2% מלח (pH 6). בדוק עכבה אלקטרודה אלקטרודה עם הבוחן. כדי להקליט מן האקסונים בקוטר גדול להפוך אלקטרודות עם עכבה של 60-80m Ω, עבור אקסונים קטנים interneurons לעשות אלקטרודות עם עכבה של 80 150MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את microelectrode לשלב ראש electrometer. דמיינו את האלקטרודה מבעד לטלסקופ קטן (20X עם reticle סגורה), אשר מקובע בעמדה מאחורי הראש של החיה. באמצעות הטלסקופ חשוב משום שהוא מאפשר אלקטרודות להיות ממוצבת stereotaxically בדייקנות רבה. </li></ol> 3. הקלטה אלקטרו והכתים תאיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את פתח קטן מאטר פיא מפצים את המשוב קיבול, כך שכאשר האלקטרודה נוגעת המוח אות משוב מיוצר. זה מאפשר מיקום מדויק של פני השטח של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצרת עקירה mandibular חזר ולקדם את האלקטרודה לתוך המוח עם מנוע צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכיר impalements העצבית על ידי טיפות פתאומית פוטנציאל DC ולזהות impalements העצבית intrasomatic ידי פעילות סינפטית מתמשך. מזמזמים את האלקטרודה עם לפיצוי יתר של קיבול או הקשה לעתים רחוקות לייצר חדירה לתא מוצלח. בגלל העכבה הגבוהה של האלקטרודות, תגובות עצביות הם נצפו לעתים נדירות לפני החדירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לדקור תא עצב ואת החדירה נחשבת יציבה, לאפיין את התגובה העצבית באמצעות רמפה ארוכה ותנועה הלסת סינוסי. 5 מפת שדה פתוח של הנוירון ידי חיטוט העור סביב הראש תוך חלל הפה עם החללית הלא מוליך כגון מקל עץ. אם רלוונטי המחקר, לבחון את התגובה של הנוירון אחרים גירויים רלוונטיים מבחינה תפקודית כגון התכווצות שרירים גירוי מזיק. ראשיים מביא 6 קולטנים עצביים nociceptive להגיב לגירויים nociceptive. Anesthesetics כללי כגון נתרן pentobarbital לא לחסום את ההולכה axonal בנוירונים מביא העיקרי אלא לדכא את ההולכה הסינפטית. לפיכך הולכה axonal ב האקסון העיקרי העצבית מביא נשמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק הנוכחי (DC, 1-4nA) במשך זמן הזרקה הכולל של 15-70nA דקות. צג חדירת האלקטרודה במהלך הזריקה הנוכחית ולהפסיק אם פוטנציאל הממברנה נהיה יותר חיובי-30mV.</li></ol> 4. עיבוד רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדימו על ידי מינון יתר של pentobarbital (140mg/kg IV) perfuse עם כלי דם ולשטוף (0.9% NaCl 38 ° C המכיל 500 יחידות של הפרין ו 1ml 2% xylocaine ואחריו paraformaldehyde 4% ב 0.1M פוספט חיץ (pH 7.4) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח סעיף זה ב 50-100μm באמצעות vibratome באחת המטוס, חזיתית sagittal או אופקי. Secions נאספים צף חופשי 25 ° C-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך המוח DAB ידי דוגרים בסרום 1-2% עז רגיל 1% Triton X-100 ב 0.01M PBS ואחריו הדגירה ב avidin ביוטין מורכב (01:50 עלית Vectastain). להגיב חלקים באמצעות ניקל DAB עם H 2 O 2. כדי תהליך טקסס האדום, חלקים דגירה avidin ב-ביוטין מורכב (01:50) ב-PBS לילה בשעה 4 ° C ו דגירה אז 4 ° C במשך הלילה 4% טקסס האדום avidin DCS ב PBST. Counterstain קטעים עם ניאון Nissl כתם (NeuroTrace) 20min ב 23 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נוירון הזריקו rhodamine, לדמיין את נוירון מוזרק ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אקס 545nm). </li></ol> 5. שילוב השיטה עם תיוג immunocytochemistry מדרדר, הדמיה confocal, ניתוח כמותי colocalization ההצלחה של שילוב בטכניקה זו עם שיטות אחרות תלויה במידה רבה על תיוג תאיים טוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השיטה דמיינו כאן יכול בקלות להיות משולבת עם תיוג העצבית מדרדר. 7-10 כדי לעשות זאת, להרדים את החיה באמצעות הטכניקה aseptic, להזריק נותב עצבי כגון peroxidase חזרת (20% peroxidase חזרת. Sigma השישי, Sigma) ו -1% נבט חיטה aggultinated peroxidase חזרת (Sigma) לאזורים היעד היקפי כגון שריר masseter. נותב זה העצבית יילקחו לתוך האקסונים הפריפריה מועבר באמצעות תחבורה axonal כדי somata motoneuron. עבור השריר masseter, 15μl של נותב מוזרק לתוך השריר באמצעות microsyringe סטרילי 10 microliter. בעלי חיים ממוקמות אז על כרית חימום במעקב עד התאושש מההרדמה והניח אז בכלובים שלהם להחלמה. לאחר 24 שעות, להרדים בעלי חיים פיזיולוגית לאפיין נוירונים intracellularly כתם אותם. אנקב את החיה כפי שתואר לעיל ורקמות סעיפים תהליך נוכחות של HRP באמצעות tetramethylbenzidine (TMB), כמו כרומגן ו tungstate נתרן כמו מייצב והתגברה עם קובלט. סעיפים מקום נתרן 1% tungstate מומס 0.1M PBS (pH 6.5) ו TMB 0.0007% מומס באתנול אצטון מוחלט על 15 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. ואז להגיב סעיפים רקמה ידי הוספת 1.0 מ"ל של 0.3% H 2 O 2 לכל 100 מ"ל של תמיסת הדגירה של 60 דקות. לשטוף רקמות 0.1M PBS (pH 6.5) ומניחים diaminobenzidine 0.05% (pH 7.4), קובלט 0.02% ו 0.01% H 2 O 2 ב 0.1M PBS (pH 7.4) עבור 10 דקות. בשעה 37 ° C. תהליך הרקמה להדמיה של הנוירון הזריקו biotinamide כמתואר ולדמיין את יחסי הגומלין בין הנוירון חושית שכותרתו ועוד מגוון של motoneurons. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטכניקה המוצגת כאן יכול גם בקלות להיות משולבת עם immnocytochemistry. 6 כדוגמה, immunocytochemically תהליך המוח synaptophysin במדויק לאתר סינפסות בתוך הנוירונים שכותרתו (איור 3). כדי לעשות זאת, דגירה חלקים במוח נוגדן אנטי synaptophysin העכבר (1:10,000) של 2 ימים 4 ° C ולאחר מכן מדגירים את האנטי עכבר FITC (1:400) עבור 1h על 23 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים שכותרתו עם סמנים ניאון או מעובדים דימות פלואורסצנטי הם אידיאליים עבור הדמיה confocal. איור 3 הוא דוגמה סעיף אופטי שהושגו עם מיקרוסקופיה confocal באוטון דרך האקסון. (איור 3). יצירת אנימציות של נוירונים שכותרתו באמצעות רכישת חלקים אופטיים מרובים באמצעות נוירון שכותרתו (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים שכותרתו בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך ניתוח כמותי colocalization. כדי לעשות זאת, להשתמש במאקרו תוכנה זמינים לציבור בשיתוף עם NIH Image (למצוא http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm). בתרגום synaptophysin בתוך מסופי האקסון אחת על ידי שילוב של תיוג תאיים עם immunocytochemistry synaptophysin. 6 </li></ol> 6. נציג תוצאות: סקירה של נציג את התוצאות שניתן להשיג בשיטה זו הם באיור 1. זה גזע המוח נוירון יחיד נרשם electrophysiologically במהלך התנועה של הלסת התחתונה, וכפי ניתן בבירור לראות את התגובה של נוירון זה (איור 1 השמאלית התחתונה, כחול בהיר) היה מווסת במהלך התנועה. נוירון זה היה מוזרק עם biotinamide לאחר אפיון אלקטרו ומעובד לאחר מכן להדמיה. נוירון משוחזר (1 איור באמצע, ירוק) יכול להיות אמיתיטד לציון אנטומית, במקרה זה הגרעין מנוע trigeminal המיועד (מתאר אדום). בהתבסס על התגובה העצבית במהלך התנועה ושיקום נוירון זו ניתן לזהות כ נוירון ציר משני שרירים מביא. איור 2 ממחיש דוגמה מייצגת של התגובה הפיזיולוגית של נוירון במהלך עקירה בלסת. התגובה של הנוירון מיוצג תדירות ירי מיידי. שים לב התגובה העצבית מקרוב מחקה תזוזה mandibular המעיד על כך נוירון מסוים מספק משוב תחושתי הקשורים במצבו mandibular. באיור 3 היא תמונה בהגדלה גבוהה של האקסון מוכתם intracellularly בשילוב עם מכתים עבור synaptophysin ו Nissl כתם. שים לב colocalization של synaptophysin (צהוב) בתוך באוטון האקסון. באיור 4 הוא הנפשה של נוירון יחיד, המאופיינת פיזיולוגית ומסומן intracellularly. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. סקירה כללית של השיטה. העליון השמאלי: עקירה mandibular. הקלטה תאיים התיכון (ירוק) נוירון יחיד (צהוב). מורפולוגיה של נוירון זה שוחזר לאחר ההקלטה הזרקת תאיים. מתאר האדום מציין מיקום של גרעין מנוע trigeminal. התחתון השמאלי: התגובה הפיזיולוגית של נוירון זה במהלך התנועה הלסת. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. התגובה הפיזיולוגית נציג תא עצב שריר בודד חושית רשמה in vivo במהלך התנועה של הלסת התחתונה. הערה הדמיון של התגובה העצבית עם עקירה בלסת. <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Arborization Terminal axonal עם boutons הסינפטי (נפיחויות אדום) של נוירון intracellularly מוכתם חושי אשר הגיבו במהלך חיטוט שריר. לאחר עיבוד immunocytochemical עבור synaptophysin מראה לוקליזציה של synaptophysin בתוך באוטון axonal (צהוב). הירוק הוא Nissl פלורסנט הכתם. איור 4. אנימציה של כישור השריר העיקרי האקסון נוירון אשר מביא פיזיולוגיים התגובה נרשמה in vivo במהלך התנועה mandibular, האקסון היה אז מוכתם intracellularly ומעובד להדמיה. <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">הורד וידיאו ברזולוציה גבוהה של איור 4 כאן</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">הורד וידיאו ברזולוציה בינונית של איור 4 כאן</a>

<ol><li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li>
<li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li>
<li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li>
<li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).</li>
<li>Dessem, D., Donga, R., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary-+and+secondary-like+jaw-muscle+spindle+afferents+have+characteristic+topographic+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions.</a> J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).</li>
<li>Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li>
<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat%3A+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li>
<li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li>
<li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li>
<li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li>
<li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li>
<li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם guidlines ורגולציה שנקבעו מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (NIH פרסום מס &#39;86-23, מתוקנת 1985) ואוניברסיטת מרילנד Animal Care השתמש הוועדה.

השיטה מאויר כאן היא טכניקה רבת עוצמה אשר מספק תובנה חשובה לתוך הפונקציה של נוירונים בודדים איך התגובה של נוירונים בודדים תורם מעגלים עצביים. 9 הידע הזה הוא היסוד להבנת תפקוד הסנסורית. הכוח הגדול ביותר של טכניקה זו היא כי הוא מאפשר קביעה של מספר רב של פרמטרים על נוירון כולל פיזיולוגיה, מורפולוגיה ומורפולוגיה הפצה הסינפטי ו. בשילוב עם טכניקות אחרות כגון מידע מדרדר תיוג עצביים נוספים כגון מעגלים עצביים ניתן לאפיין. 7,8 יתרון נוסף של שיטה זו הוא כי ניתן ללמוד צעד...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב או ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> אלקטרומגנטית ויברטור </td><td> לינג Dynamic Systems </td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td> האות גנרטור </td><td> מערכות משוב </td><td> PFG605 </td><td> מסוגל לייצר אות פלט טרפז </td></tr><tr><td> אלקטרודת הזכוכית </td><td> סאטר מכשירים </td><td> AF100-68-10 </td><td> עם נימה </td></tr><tr><td> אלקטרודה חולץ </td><td> סאטר מכשירים </td><td> דגם P-2000 או P-80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td> וקטור מעבדות </td><td> SP-1120 </td><td> מאוחסן ב 4 ° C </td></tr><tr><td> טקסס האדום avidin DCS </td><td> וקטור מעבדות </td><td> A-2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td> מולקולרית בדיקות </td><td> D-3308 </td><td> 3000 משקל מולקולרי, ליזין ניתן לתקן </td></tr><tr><td> עכבר אנטי synaptophysin נוגדן </td><td> Chemicon </td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td> פלורסנט Nissl כתם </td><td> Neurotrace, בדיקות מולקולריות </td><td> N-21480 </td><td></td></tr><tr><td> אלקטרודה הבוחן </td><td> וינסטון אלקטרוניקה </td><td> BL-1000-B </td><td> כדי למדוד עכבה אלקטרודה </td></tr><tr><td> electrometer </td><td> אקסון מכשירים </td><td> Axoprobe 1A, Axoclamp 2B </td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון פיזיולוגיים, מורפולוגי והעצבית של נוירונים מווסתת על ידי תנועת

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

תפקידו של נוירונים בודדים והתפקוד שלהם מעגלים עצביים הוא היסוד להבנת מנגנונים עצביים של פונקציות החושי והמוטורי. רוב החקירות של מנגנוני הסנסורית להסתמך על בדיקה או של נוירונים בעוד חיה הוא 1,2 סטטי או פעילות תאית שיא העצבית במהלך תנועה. 3,4 בעוד מחקרים אלו סיפקו את הרקע הבסיסי לתפקוד הסנסורית, הם גם לא להעריך מידע פונקציונלי אשר מתרחשת במהלך תנועה או מוגבלים ביכולתם מלא לאפיין את הפנוטיפ, אנטומיה פיזיולוגיה neurochemical של הנוירון. טכניקה מוצג כאן המאפשרת אפיון נרחב של נוירונים בודדים במהלך בתנועה vivo. טכניקה זו יכולה לשמש לא רק ללמוד הנוירונים מביא העיקרי, אלא גם לאפיין motoneurons ו interneurons הסנסורית. בתחילה התגובה של נוירון בודד נרשם בשיטות אלקטרו במהלך התנועות של הלסת התחתונה ואחריו להגדרה של שדה פתוח עבור הנוירון. נותב עצביים לאחר מכן מוזרק intracellularly לתוך תא העצב לבין המוח מעובד כך הנוירון ניתן דמיינו עם מיקרוסקופ אור, אלקטרונים או confocal (איור 1). מורפולוגיה מפורט של הנוירון מאופיין הוא שיחזר אז כך מורפולוגיה העצבית יכולה להיות בקורלציה עם התגובה הפיזיולוגית של נוירון (איורים 2,3). בתקשורת זה פרטים מפתח חשוב טיפים ליישום מוצלח של טכניקה זו מסופקים. פרטים נוספים המוערכים ניתן לקבוע עבור נוירון הנחקרת על ידי שילוב שיטה זו עם שיטות אחרות. תיוג העצבית מדרדר ניתן להשתמש כדי לקבוע נוירונים עם סינפסות שבו נוירון שכותרתו: נחישות ובכך מאפשר מפורט של מעגלים עצביים. Immunocytochemistry ניתן לשלב עם שיטה זו לבחון נוירוטרנסמיטורים בתוך הנוירון שכותרתו כדי לקבוע את פנוטיפים הכימי של הנוירונים שבה צמתי נוירונים שכותרתו. הנוירון שכותרתו יכול גם להיות מעובד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לקבוע את התכונות ultrastructural ו microcircuitry של הנוירון המסומן. בסך הכל טכניקה זו היא שיטה רבת עוצמה ביסודיות לאפיין נוירונים במהלך בתנועה vivo ובכך מאפשר תובנה משמעותית לתוך תפקיד של הנוירון בתפקוד הסנסורית.

הטכניקה מתוארת לכמת את בתגובה פיזיולוגית vivo של נוירונים יונקים במהלך התנועה לתאם את הפיזיולוגיה של הנוירון עם מורפולוגיה העצבית, פנוטיפ neurochemical ו microcircuitry הסינפטי.

תפקידם של נוירונים בודדים ותפקודם במעגלים נוירונליים הואו מרכזי להבנת המנגנונים הנוירונליים של תהליכים תחושתיים ומוטוריים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקליט את התגובה הפיזיולוגית של נוירונים בודדים במהלך תנועה, ולאחר מכן לאפיין את המורפולוגיה והנוירוכימיה של נוירונים אלו. דבר זה מושג תחילה על ידי הרדמה והכנה כירורגית של בעל החיים. השלב הבא הוא הקלטה אלקטרופיזיולוגית של התגובה התוך-תאית של נוירונים בודדים במהלך תנועה.לאחר ביצוע פרפוזיה לבעל החיים ועיבוד המוח, השלב הסופי הוא ויזואליזציה וניתוח של התגובה הפיזיולוגית והמורפולוגיה הנוירונלית. בסופו של דבר, השילוב בין טכניקות של רישום נוירונלי תוך-תאי, אימונוכימיה וניתוח, מאפשר להראות את המודולציות בפוטנציאל הממברנה של נוירונים בודדים במהלך תנועה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית תאים, הוא שהקשרים הנוירונליים והקליטות הסינפטיות נשמרים, והנוירונים אינם מופרדים או מועברים למדיומים מלאכותיים. ביום שלפני הניסוי, מזריקים סמן נוירונלי, כגון horseradish peroxidase, לאזורי המטרה הפריפריים כדי לסמן רטרוגרדית נוירונים מוטוריים.ביום למחרת הרדימו את החולדה והניחו אותה על משטח חימום, גלחו את העור מעל החלק האחורי של הגולגולת באמצעות מכונת גילוח לבעלי חיים תוך שימוש בטכניקה אספטית. בצעו חתך לאורך הירך הפנימית, והחדירו קנולה לווריד הפמורלי למתן הרדמה נוספת. החדירו קנולה נוספת לעורק הפמורלי למעקב אחר לחץ הדם.לבסוף, הכניסו קנולה לקנה הנשימה. לאחר מכן, מקמו את החולדה במסגרת סטריאוטקסית. בצעו קרניוטומיה כדי לחשוף את המוחון, תוך הקפדה להימנע מהסינוס הוורידי הגדול הממוקם ישירות מתחת לחיבור שבין העצם הפריאטלית לעצם האינטר-פריאטלית.בשלב הבא, כסו את פני השטח של המוח בשמן מינרלי מחומם. כעת הדביקו את הלסת התחתונה למוט המחובר לרטט אלקטרומגנטי. תנועת הלסת התחתונה נשלטת על ידי אותות פקודה המועברים לרטט ממחולל אותות.לאחר מכן, מקמו אלקטרודת הארקה מתחת לעור בסמוך לקרניוטומיה. כדי להכין את האלקטרודות התוך-תאיות, מלאו מיקרו-אלקטרודות בתמיסת צבע IDE או tetraethyl diamine. עכבת האלקטרודות צריכה להיות 60 עד 80 mega ohms עבור אקסונים בעלי קוטר גדול, ו-80 עד 150 mega ohms עבור אקסונים אפרנטיים קטנים ונוירונים מקשרים.בשלב הבא, הכניסו את המיקרו-אלקטרודה לתוך שלב הראש (head stage) של האלקטרומטר באמצעות טלסקופ קטן המקובע במיקומו מאחורי ראשו של בעל החיים. הדמיאנו את המיקרו-אלקטרודה דרך ה-redle המובנית של הטלסקופ בהגדלה של 20 x. אזור המטרה נמצא במרחק של כ-0.5 millimeters coddle מהגבול התחתון של ה-inferior colliculus.כעת צרו פתח קטן ב-pia mater כדי לאפשר מיקום מדויק של פני השטח של המוח. בצעו פיצוי יתר למשוב הקיבול (capacitance feedback), כך שכאשר האלקטרודה תיגע במוח, ייווצר אות משוב. התקדמו עם האלקטרודה עד שהיא תיכנס לתוך המוח.השלב הבא הוא להפעיל תזוזה חוזרת של הלסת התחתונה. לאחר מכן, בעזרת מנוע פולסי (stepping motor), הקידמו את האלקטרודה אל תוך המוח. כאשר חדירה לנוירון תצוין על ידי ירידה פתאומית בפוטנציאל ה-dc ופעילות סינפטית מתמשכת, הפסיקו את קידום האלקטרודה.כאשר החדירה נחשבת ליציבה, התחל בתנועות לסנאט של סוג ramp and hold ושל תנועות סינוסואידליות. רשום את התגובה הנוירונלית ואפיין את הנוירון על בסיס תגובתו. לאחר מכן, כדי למפות את השדה הרספטיבי של הנוירון, השתמש במ probes קהה כדי לבחון את העור מסביב לראש ואת החלל התוך-פה.בחן את תגובת הנוירון לגירויים אחרים, כגון התכווצות שרירים או גירויים נוקסיים (noxious stimuli). עם סיום ההקלטות, הזרק זרם DC של 1 עד 4 nano amp, להזרקה כוללת של 15 עד 70 nano amp minutes. עקוב אחר חדירות האלקטרודה והפסק את הזרקת הזרם.אם פוטנציאל הממברנה הופך לחיובי יותר מ-30- מיליוולט, השלב הבא הוא חיתוך של רקמת המוח. לאחר הרדמה ופרפוזיה של בעל החיים, הוצא את המוח. לאחר מכן, בצע חיתוכים בעובי של 50 עד 100 מיקרון במישור הפרונטלי, הסגיטלי או ההוריזונטלי.כדי להדמיות את הקשר בין הנוירון התחושתי המסומן לבין מגוון של נוירונים מוטוריים, יש לעבד את הרקמה עבור H-R-P-D-A-B או Texas red, בהתאם לסוג הרקמה; ניתן לבצע ניתוחים נוספים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקאלי, או באמצעות תוכנה למיקום משותף כמותי (quantitative colocalization). במידת הצורך, ניתן לבצע עיבוד אימונוכימי עבור synaptophysin כדי למקם במדויק סינפסות בתוך נוירונים מסומנים. איור זה מציג נוירון מגזע המוח שהוזרק לו IDE לאחר אפיון אלקטרופיזיולוגי.בהתבסס על התגובה העצבית במהלך התנועה, ניתן לזהות נוירון זה כנוירון אפרנטי משני של כישורי שריר. המסגרת החומה מציינת את מיקומו של הגרעין המוטורי של עצב השלישייה. איור זה מציג את התגובה הפיזיולוגית של נוירון תחושתי במהלך תזוזת הלסת.תגובת הנוירון מיוצגת כתדירות פריקה רגעית. שימו לב כי התגובה מחקה מקרוב את תזוזת הלסת התחתונה (mandible), מה שמעיד על כך שנוירון מסוים זה מספק משוב תחושתי הקשור למיקום הלסת התחתונה. איור זה מציג נוירון תחושתי שהגיב במהלך דיגום של השריר.הנוירון נצבע ב-ide לאחר עיבוד אימונוכימי. מקלות הסינפסה, המופיעים כבליטות אדומות, נראים במיקום משותף (co-localized) עם synaptophysin הצהוב. הצבע הירוק הוא צביעת missile פלואורסצנטית.איור זה הוא אנימציה של אקסון מנוירון אפרנטי ראשוני של כישור שריר. מספר חתכים אופטיים של הנוירון המסומן שימשו ליצירת האנימציה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה קונפוקלית, וסימון נוירונלי בדרגה קדמית (anterograde) או רטרוגרדית (retrograde) כדי לענות על שאלות נוספות לגבי המאפיינים an ultra-structural של הנוירון, קולוקליזציה של מוליכים עצביים עם קשרי סינפטיים וקישוריות נוירונלית.

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמיה של המיטוכונדריה לחיות הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי פני משכי זמן ארוכים. הדמיה על תקופות ממושכות נעשה באמצעות הביטוי lentivirus בתיווך של חלבון פלואורסצנטי ממוקד mitochondrially ושימוש זול הבמה העליון חממה כי תוכנן ונבנה במעבדה שלנו.

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

מחקרים עדכניים רבים זיהו מוטציות חלבונים סינפטיים הקשורים פתולוגיות במוח. ראשי נוירונים בקליפת המוח בתרבית להציע גמישות רבה לבחון את ההשפעות של מחלות אלה הקשורים חלבונים על מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים.

ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured

המורפוגנזה ונדידת נוירונים הן אירועים מכריעים שבבסיס התפתחות מוח תקין. כאן אנו מתארים שיטות לתמרן גנטי נוירונים בתרבית המוח הקטן גרגיר והמוח קטן מתפתח להערכה של מורפולוגיה ומאפייני נדידה של תאי עצב.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

פרוטוקול זה משתמש תלת מימדי (3D) טכניקות הדמיה וניתוח כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. הטכניקות ישימות למצבים אחרים שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד ערכת משנה של נתונים מ עוד אות ניאון.

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית ​​נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

פרוטוקול זה מציע דיגיטציה של חלקים של משימות קליניות מסורתיות המשמשות בדרך כלל למדידת קוגניציה ושליטה מוטורית במחלת פרקינסון. משימות קליניות הם סרוקים בעוד מקצבים ביופיזיים הם שותפים רשומים רמות פונקציונליות שונות של מערכות העצבים, החל מרצון, ספונטני, אוטומטי לאוטונומית.

ביואריטים דיגיטליים דינמיים של תפקוד מוטורי וקוגניטיבי במחלת פרקינסון

הובלה מיטוכונדריאלי לקויה ומורפולוגיה מעורבים במחלות ניווניות שונות. הפרוטוקול המוצג משתמש מושרה המושרה תא גזע הנגזרת הנוירונים המוח כדי להעריך הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה ב מפרסטית תורשתית. פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר מיטוכונדריאלי לאורך אקסונים וניתוח של מורפולוגיה שלהם, אשר להקל על המחקר של מחלות ניווניות.

ניתוח הובלה מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה בתאי גזע בעלי השפעה של האדם המושרה בנוירונים

ניטור תנועת עיניים (או מעקב עיניים) מגלה היכן במרחב העיניים להשתהות, מתי ולכמה זמן. כאן, אנו מדגימים כיצד עקיבת העין ניתן להשתמש כדי לחקור את תקינות זיכרון באוכלוסיות משתתף מרובים, מבלי לדרוש דיווחים מילולית, מפורשת או אחרת.

תנועת העין ניטור של זיכרון

ההשפעה של חוסר משקל ו hypergravity משני תהליכים hemodynamic ו אלקטרו במוח הולך להיות אחריו במהלך הטיסה פרבוליות ידי טכניקות EEG ו NIRS. בדיקת היתכנות של ניסוי מורכב יותר, אשר תכנן לבצע במהלך טיסת חלל בינוני וארוך.

לכידות בין תפקוד המוח קליפתיים וביצועים נוירוקוגניטיבי במהלך תנאי הכבידה השתנה

כאן אנו מתארים הליך אמין ופשוט מהירה כדי לקבוע את הטמפרטורה הנמוכה ביותר שבה חולדות או עכברים מראים התנהגות...

קביעה מהירה של סף nociceptive תרמי בעכברים סוכרתיים

חקור תיעוד תגובות פיזיולוגיות של נוירונים יונקים במהלך תנועה באמצעות הקלטה תוך-תאית ואימונוכימיה. שיטה זו שומרת על חיבורים סינפטיים ומאפשרת ניתוח מורפולוגי מפורט של הפעילות העצבית.

אפיון פיזיולוגיים, מורפולוגי והעצבית של נוירונים מווסתת על ידי תנועת

גלה סרטונים נוספים