אפיון פיזיולוגיים, מורפולוגי והעצבית של נוירונים מווסתת על ידי תנועת

הטכניקה מתוארת לכמת את בתגובה פיזיולוגית vivo של נוירונים יונקים במהלך התנועה לתאם את הפיזיולוגיה של הנוירון עם מורפולוגיה העצבית, פנוטיפ neurochemical ו microcircuitry הסינפטי.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד את התגובה הפיזיולוגית של נוירונים בודדים במהלך תנועה ולאפיין עוד יותר את המורפולוגיה והנוירוכימיה של נוירונים אלה. זה מושג על ידי הרדמה ראשונה והכנה כירורגית של בעל החיים. השלב הבא הוא רישום אלקטרופיזיולוגי של התגובה התוך תאית של נוירונים בודדים במהלך התנועה.

לאחר החדרת החיה ועיבוד המוח, השלב האחרון הוא לדמיין ולנתח את התגובה הפיזיולוגית והמורפולוגיה העצבית. בסופו של דבר, הטכניקות של הקלטה עצבית תוך-תאית, אימונוכימיה וניתוח משתלבות כדי להראות את המודולציות בפוטנציאל הממברנה של נוירונים בודדים במהלך התנועה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תרבית תאים, הוא שקשרים עצביים ותשומות סינפטיות נשמרים, והנוירונים אינם אוטומטיים או ממוקמים במדיה מלאכותית ביום הקודם, הניסוי מזריק עוקב עצבי, כגון צנון סוסים, פרוקסידאז לאזורי המטרה ההיקפיים כדי לסמן לאחור נוירונים מוטוריים.

למחרת יש להרדים את החולדה ולהניח אותה על כרית חימום, לגלח את העור, לכסות את הגולגולת האחורית בקוצץ בעלי חיים בטכניקה אספטית. בצע חתך לאורך הירך הפנימית, הכנס צינורית לווריד הירך להרדמה נוספת. הכנס צינורית נוספת לעורק הירך כדי לפקח על לחץ הדם.

לבסוף, הכנס צינורית לקנה הנשימה. לאחר מכן, הכניסו את החולדה למסגרת סטריאוטקסית. בצע קרניוטומיה כדי לחשוף את המוח הקטן תוך הקפדה על הימנעות מהסינוס הוורידי הגדול הממוקם ישירות מתחת לצומת בין העצמות הקודקודיות והבין-קודקודיות.

לאחר מכן, כסו את פני המוח בשמן מינרלי מחומם. כעת הדביקו את הלסת התחתונה למוט המחובר לוויברטור אלקטרומגנטי. תנועת הלסת התחתונה נשלטת על ידי אותות פקודה לוויברטור ממחולל אותות.

לאחר מכן, הניחו אלקטרודת הארקה מתחת לעור הסמוך לקרניוטומיה. כדי להתכונן לאלקטרודות התוך תאיות, משוך מילוי מיקרו אלקטרודות עם IDE או מוט טטראתיל בדיקות תמיסת צבע דומין. עכבת האלקטרודה הזו היא 60 עד 80 מגה אוהם עבור אקסונים בקוטר גדול ו-80 עד 150 מגה אוהם עבור אקסונים קטנים ובין נוירונים.

לאחר מכן, הנח את המיקרו אלקטרודה לשלב הראש של האלקטרומטר באמצעות טלסקופ קטן המקובע במקומו מאחורי ראש החיה. דמיין את המיקרו אלקטרודה דרך ה-20 x הסגור של הטלסקופ. אזור המטרה הוא כ-0.5 מילימטר עד לגבול התחתון של הקוליקולוס התחתון.

כעת צרו פתח קטן בפיה מאטר כדי לאפשר מיקום מדויק של פני השטח של המוח. פיצוי יתר על המידה של משוב הקיבול כך שכאשר האלקטרודה נוגעת במוח, נוצר אות משוב. קדם את האלקטרודה עד שהיא נכנסת למוח.

השלב הבא הוא הפעלת תזוזה חוזרת ונשנית של הלסת התחתונה. לאחר מכן בעזרת מנוע צעד, קדם את האלקטרודה למוח. כאשר פגיעה עצבית מסומנת על ידי ירידה פתאומית בפוטנציאל dc ופעילות סינפטית מתמשכת, הפסק לקדם את האלקטרודה.

כאשר החדירה נחשבת יציבה, התחל רמפה והחזקה ותנועות לסת סינוסואידיות. רשום את התגובה העצבית ואפיין את הנוירון על סמך תגובתו. לאחר מכן, כדי למפות את שדה הקליטה של הנוירון, השתמשו בבדיקה קהה כדי לחקור את העור סביב הראש והחלל התוך-אורלי.

חקור את תגובת הנוירון לגירויים אחרים כגון התכווצות שרירים או גירויים מזיקים. לאחר השלמת ההקלטות, הזרקו זרם DC אחד עד ארבעה ננו אמפר להזרקה כוללת של 15 עד 70 ננו אמפר דקות. עקוב אחר חדירת האלקטרודה והפסק את הזרקת הזרם.

אם פוטנציאל הממברנה הופך חיובי יותר ממינוס 30 מילי-וולט, השלב הבא הוא לחתוך את רקמת המוח. לאחר המתת חסד וחדירה של החיה, הסר את המוח. לאחר מכן חותכים חלקים של 50 עד 100 מיקרון במישור הקדמי, הסגיטלי או האופקי.

כדי לדמיין את הקשר בין הנוירון החושי המסומן למגוון נוירונים מוטוריים, לעבד את הרקמה עבור H-R-P-D-A-B או טקסס אדום, בהתאם לרקמה, ניתן לבצע ניתוחים נוספים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי או באמצעות תוכנת קולוקליזציה כמותית. לפי הצורך ניתן לבצע עיבוד אימונוכימי עבור סינפטופיזין כדי לאתר במדויק סינפסות בתוך נוירונים מסומנים. איור זה מציג נוירון בגזע המוח שהוזרק עם IDE לאחר אפיון אלקטרופיזיולוגי.

בהתבסס על התגובה העצבית במהלך התנועה, ניתן לזהות נוירון זה כנוירון אפרנטי של ציר שריר משני. המתאר החום מציין את מיקום הגרעין המוטורי הטריגמינלי. איור זה מציג את התגובה הפיזיולוגית של נוירון תחושתי במהלך תזוזה של הלסת.

תגובת הנוירון מיוצגת כתדירות ירי מיידית. שימו לב שהתגובה מחקה מקרוב את תזוזה של הלסת התחתונה, מה שמצביע על כך שהנוירון המסוים הזה מספק משוב חושי הקשור למיקום הלסת התחתונה. איור זה מראה תא עצב תחושתי שהגיב במהלך גישוש שרירים.

תא העצב נצבע באיד לאחר עיבוד אימונוכימי. האלות הסינפטיות המופיעות כנפיחות אדומות נראות ממוקמות יחד עם הסינפטופיזין הצהוב. ירוק הוא כתם של טיל פלורסנט.

איור זה הוא אנימציה של אקסון מנוירון אפרנטי ראשוני של ציר שריר. חלקים אופטיים מרובים של הנוירון המסומן שימשו ליצירת האנימציה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלקטרומיקרוסקופיה, מיקרוסקופיה קונפוקלית ותיוג עצבי בדרגה קדמית או רטרוגרדית כדי לענות על שאלות נוספות לגבי המאפיינים האולטרה-מבניים של קולוקליזציה של נוירונים של נוירוטרנסמיטורים עם bns סינפטי וקישוריות עצבית.