Name: תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: למד תצפית ישירה של פאגוציטוזה והיווצרות רשתות נויטרופילים בריאות נגועות באמצעות מיקרוסקופיית שני-פוטון. שיטה זו מאפשרת מחקר תפקודי של תאי חיסון בחיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר לארס Philipsen לעזרה עם אופטימיזציה של סרטים intravital, ד&quot;ר יונתן לינדקוויסט עבור בזהירות לקרוא את כתב היד, וכל אנשי המעבדה Gunzer לדיונים הערות מועילות במהלך הפיתוח של השיטה. עבודה זו מומנה על ידי תרומות של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) ל MG

1. זיהום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Conidia נפיחות של העובש אספרגילוס fumigatus (זן ATCC 46,645) מופקים על ידי הדגירה טרום ב RPMI 1640 (Biochrom AG, ברלין, גרמניה), בתוספת 5% FCS (v / v). 2x10 7 conidia מנוחה הם resuspended בינוני 5 מ"ל ו מודגרות בתוך צלחת 6-היטב רקמות תרבות (TPP AG; Trasadingen, שוויץ, קטלוג # 92006) עבור 7h על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התקופה נפיחות, הנבגים הם שכותרתו fluorescently ידי הוספת 10 μl של פתרון לבן המניות calcofluor (סיגמא אולדריץ', Deisenhofen, גרמניה, קטלוג # F3543; [25 מ"ג / מ"ל] ב DMSO) לכל אספרגילוס המכיל היטב 6-היטב צלחת, והגיע ריכוז סופי calcofluor של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​RPMI. לאחר ערבוב עדין, הנבגים מודגרת 15 דקות נוספות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, הנבגים נקצרים על ידי סינון דרך תא 70 מיקרומטר מסננת (BD Biosciences, היידלברג, גרמניה). אחרי כביסה אחת עם 10 מ"ל PBS (צנטריפוגות ב 900xg במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר) היא גלולה resuspended ב 2 מ"ל PBS ואת המספר הכולל של conidia נפוחות נקבע על ידי ספירה עם תא Neubauer. לבסוף ההשעיה נבג הוא הסתובב לעבר 900xg 5 דקות בטמפרטורת החדר, supernatant הוא הסיר בזהירות, גלולה resuspended הריכוז הסופי של 1x107 נבגים ל -100 μl PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זיהום, 100 μl של פתרון נבג מוחל intratracheally לעכברים הנשי (C57/BL6, 8-10 שבועות, הארלן, גרמניה). אם נויטרופילים יש לצפות גם השימוש ליס-EGFP עכברים, נושאת EGFP תחת promotor ליזוזים 1 מומלץ. בגין על ידי הרדמה החיה עם זריקה IP יחידה של פתרון 150 Ketamin / Rompun μl (Inresa Arzneimittel GmbH, פרייבורג, גרמניה (Ketamin) ו באייר ויטל GmbH, לברקוזן, גרמניה (Rompun), 1 מ"ל Ketamin [50 מ"ג / מ"ל] + 0.5 מ"ל Rompun [2%] + 3.5 מ"ל סטרילי NaCl [0.9%]). 5 דקות מאוחר יותר העכבר הרדים יכול להיות קבוע עם גומייה על ידי השיניים שלה הרמפה (כלומר, משטח משופע) כדי להקל על אינטובציה (דמות משלים 1). בעזרת מלקחיים, הלשון היא משכה הצידה צנתר ורידי 22g שכינת (B. Braun AG, Melsungen, גרמניה, Vasofix Braunüle) יכול להיות מוכנס בעדינות תחת תאורה קבועה עם מנורה צוואר אווז לתוך קנה הנשימה. הכניסה המוצלחת של הקטטר מאומת על ידי התבוננות תנועה סדירה של בית החזה של החיה עם תדירות ההנשמה המכני. כאשר אינטובציה מוצלחת אושרה, 100 ההשעיה נבג μl מיושמת באמצעות micropipette 100 μl. נפח זה צריך להיות בשאיפה ידי החיה ללא כל עזרה נוספת 1-2 s. הפצה מוגברת של חלקיקים פטרייתי בתוך הריאה מושגת על ידי אוורור מכני החיה הנגועים במשך 2 דקות עם הנשמה חיה קטנה (MiniVent, הוגו סאקס, מארס Hugstetten, גרמניה) בשיעור של 250 נשימות בדקה ואת נפח שאיפה של 300 μl לכל נשימה (דמות משלים 2). אחרי החיות זיהום מוחזר לכלוב שלהם נצפו כל 5 דקות עד אמבולטורי שוב. עכברים לא מראים כל עדות של כאב או מצוקה במהלך תקופת הדגירה הבאה. </li></ol> 2. ריאות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7 שעות לאחר ההדבקה עם הנבגים, בעל החיים מורדמים ממנת יתר של isoflurane (בקסטר GmbH, Unterschleiβheim, גרמניה) עד תנועות נשימה הפסיקו במשך יותר מ 30 שניות. זהו לאחר מכן על ידי פתיחת בית החזה כשיטה משנית להבטיח מוות קליני ולאפשר גישה להדמיה של קנה הנשימה והריאות. ואז החזה נפתח בזהירות כדי לחשוף את הריאה ואת דרכי הנשימה העליונות. ואז צנתר ורידי אחר 22g שכינת מוכנס לתוך קנה הנשימה החל מכסה הקנה חשוף. דרך אבובית זה הריאות מלאים 1 מ"ל מראש חימם ההיתוך agarose נמוכה (2% w / v, Promega, מנהיים, גרמניה) באמצעות מזרק 1 מ"ל Omnifix (B. Braun). ברגע לריאות מלאים קנה הנשימה נקשר עם חתיכת קצר של חוט תפירה החי כולו מוכנס לתוך מקרר ב -4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 דקות מאוחר יותר, כאשר agarose יש הקרושה, הריאה כולה הוא נכרת החל לקנה הנשימה. בעזרת מספריים מחודדות, האונה ריאה ימין מוסרת לאחר מכן, על פני השטח התחתונה היא מיובשים בקצרה על דף נייר, ואז כל האונה מודבק לחסום את הכנת (Campden מכשירים, בריטניה, vibratome 752M Vibroslice ) באמצעות טיפת דבק רקמות עבור קיבעון (קרל רוט GmbH, קרלסרוהה, גרמניה, רוטי, קול 1). לאחר דקות 1 לחסום את מותקן בתא החנית של vibratome, אשר מלא מראש מצונן (4 ° C) PBS. Vibratome מוגדר רטט אמצע טווח (5 מתוך מקסימום 10.) וגם מהירות בינונית (5 מתוך מקסימום 10). כזה חתך אופקי שלריאה מיוצר. החצי העליון של האיבר הוא הועבר לאחר מכן לתוך פלסטיק קטן צלחת פטרי (5 ס"מ קוטר), שם הוא הפוך וקבוע עם מכונת כביסה מתוצרת עצמית שטוח (1 ס"מ קוטר פנימי), כי הוא מכוסה על ידי קבוצה של חוטי ניילון במקביל, כל 1 מ"מ זה מזה (איור משלים 3). לבסוף צלחת פטרי מלא 10 מ"ל PBS בתוספת 10 μl של צבע DNA Sytox אורנג' [5 mM] (Invitrogen, גרמניה) וכתוצאה מכך ריכוז צבען הסופי של 5 מיקרומטר. </li></ol> 3. 2-פוטון לייזר מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פטרי שמכילה את דגימת הריאות מותקן ולאחר מכן, תחת המטרה מיקרוסקופ כך החיץ ניתן לחמם 37 ° C על ידי חיישן טמפרטורה שבשליטת דוד (דמות משלים 4). 2-פוטון מיקרוסקופית נישא החוצה על פני השטח חתך שלם באמצעות LSM Zeiss 710 מיקרוסקופ NLO על הבמה זקוף בוחן Axio מצויד בעדשה 20xNA1.0 מים טבילה (Zeiss, Jena, גרמניה). עבור הדמיה, אזורים שונים לאורך הקטע נסרקים עד לעומק 400 מיקרומטר באמצעות גל של 800 ננומטר תאורה גילוי ירוק (530 ננומטר) אדום (580 ננומטר) הקרינה, כמו גם את הדור הרמוני השני (SHG) אות ו כחול calcofluor הקרינה (על פליטת 400-470 ננומטר) עם גלאים חיצוניים שאינם descanned (NDD). מלבד 2-D תמונות זמן לשגות סרטים (1 תמונה כל 50-10 שניות), יחיד או חוזרות 3 מימדי ערימות תמונה ניתן לעבד לאחר מכן כמו renderings voxel יחיד או תמונות מוקד המורחבת או 4-D נתונים (3D לאורך זמן) באמצעות חבילות תוכנה שונות. זו ההגדרה המיקרוסקופית מאפשרת תצפית על התנהגות הסלולר בסביבה כמעט ללא פגע, כפי שהיא מהווה נמל כניסה עבור מגוון רחב של פתוגנים מוטס, הוא הרלוונטיות החיסונית עצום. תנועתיות התא, phagocytosis ייצור NET ידי נויטרופילים זיהום אנדוגני הבאים עם עובש אספרגילוס fumigatus ניתן לחקור בקלות בתנאים באתרו תחת אלה. </li></ol> 4. נציג תוצאות אם נעשה כראוי הדמיה יפיק 2 - או 3 צבעים שקופיות או סרטים. למרות צביעה נעשה בהליך עיבוד פוסט ועל כן להתאמה בחופשיות, אנחנו בדרך כלל לבחור ערכת צביעה המשקף את הצבע הטבעי של צבע / אות, אשר מזוהה בערוץ יחסית. לפיכך, צבעי Sytox מתוארים אדום, פטריות, כמו גם את האות SHG מוצג כחול, אם קיימת, EGFP שכותרתו תאים מוכתמות בירוק. בדוגמה הראשונה (איור 1) את האות SHG כחול מתאר את סיבי רקמת הריאה הלא נגועים לבין האות אדום Sytox מופק על ידי גרעין של הריאה תושב תאים יחתכו אותי vibratome. בדוגמה השניה (איור 2) הריאות נגוע מוצג, שם שניהם, מבנים מכתשיים כמו גם ההמונים פטרייתי, יופיעו בכחול, בעוד הגרעינים ורשתות מוכתמות באדום. הדוגמה השלישית (איור 3) היא מבעל חיים מהונדס ליס-EGFP שבו בנוסף למבנים כחול ואדום נויטרופילים ירוק ניתן גם לראות. הגירה של נויטרופילים phagocytosis שלהם אלמנטים פטרייתי בודדים רצפי זמן לשגות מוצג בסרט משלים. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. המראה של פרוסת שאינם נגועים ריאה בצבע-2 2 פוטון מיקרוסקופית. פרוסת ריאות הוכן מתוך עכבר C57/BL6 הלא נגוע צילמו כמפורט בפרוטוקול. מתפרסמות כאן את האות SHG של מבנה רקמות מכתשיים (א), את האות Sytox של גרעיני תאים לחתוך לפתוח במהלך תקופת ההכנה של הפרוסה ריאות (ב), וכן כיסוי של שני ערוצים (C). שטח ארוזות (ג) נראה מוגדל (ד '). שימו לב רקמה סיבית בחלק התחתון של הריאות פרוסה לעומת הארגון מכתשיים בבירור בתוך נשימה פעיל בתחומים של הריאה לעיל. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. המראה של פרוסת ריאות של בעל חיים נגוע מסוג אספרגילוס בר צבע 2 2 פוטון מיקרוסקופית. פרוסת ריאה מן העכבר C57/BL6 נגוע 7 שעות לפני כן עם א ' fumigatus הוכן צילמו כמפורט בפרוטוקול. המוצג הוא מבנה פטרייתי בשילוב SHG של הרקמה מכתשיים (א), את האות Sytox של רשתות ה-DNA, כמו גם גרעין התא לחתוך לפתוח במהלך תקופת ההכנה של הפרוסה ריאות (ב), וכן כיסוי של שני ערוצים (C) . שטח ארוזות (ג) נראה מוגדל (ד '). לידיעתך, באזורים שונים בבירור ההמונים פטרייתי, alveoli, ו-NET המבנים המסומנים באותיות, F ו-N, בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. המראה של פרוסת ריאות של בעל חיים נגוע ליס-EGFP אספרגילוס בצבע 3 2 פוטון מיקרוסקופית. פרוסת הריאות של עכבר ליס-EGFP נגוע 7 שעות לפני עםא fumigatus הוכן צילמו כמתואר בפרוטוקול. המוצג הוא מבנה פטרייתי SHG בשילוב של רקמות מכתשיים (כחול), את האות Sytox של גרעיני תאים ורשתות (אדום), וכן גם נויטרופילים רבים (ירוק). <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig1.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> משלימה דמות 1. קיבעון עכבר עבור אינטובציה. תחת הרדמה Ketamin / Rompun החיה קבוע עם גומייה על השיניים שלה כדי להקל על אינטובציה עם צנתר ורידי שכינת 22g. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig2.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> משלימה דמות 2. עכבר אוורור מכני. העכבר צנרר נגוע על ידי יישום זה של 7 נבגים 1x10 resuspended ב 100 μl PBS. הפצה מוגברת של חלקיקים פטרייתי בתוך הריאה מושגת על ידי אוורור מכני העכבר נגוע הנשמה חיה קטנה. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig3.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> משלימה דמות 3. האונה ריאות קיבעון. לאחר הכנה של האונה הימנית איבר הריאות הוא קבוע בצלחת פטרי על ידי שימוש מכונת כביסה שטוח מעבדה מתוצרת כי הוא מכוסה על ידי מערכת של חוטי ניילון במקביל. <img src="/files/ftp_upload/2659/2659supfig4.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> משלימה דמות 4. 2-פוטון ההתקנה הדמיה. צלחת פטרי שמכילה את האונה ריאה ימין מותקן על מחצלת חימום תחת מיקרוסקופ 2-הפוטון לאחר תוספת של ה-DNA Sytox צבע כתום. הסרט משלים:. נויטרופילים נויטרופילים נודדות phagocytosing אלמנטים פטרייתי בריאות אספרגילוס נגוע כפי שניתן לראות על ידי זמן לשגות 2-פוטון מיקרוסקופית של h חי פלח 7 ריאות לאחר ההדבקה עם הפטרייה הם ירוק, פטריות מרכיבים SHG הם כחול, גרעיני תאים כמו גם NET-המבנים מתוארים אדום. השעה האמיתית של הניסוי מוצג בפינה הימנית התחתונה. סרגל מידה מתאר 50 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/2659/5_9_1%20-%20supplemental.mpg">לחץ כאן כדי לצפות וידאו</a>

<ol><li>Faust, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96, 719-719 (2000).</li>
<li>Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectrum+of+biophysical+interaction+modes+between+T+cells+and+different+antigen+presenting+cells+during+priming+in+3-D+collagen+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A spectrum of biophysical interaction modes between T cells and different antigen presenting cells during priming in 3-D collagen and in vivo.</a> Blood. 104, 2801-2801 (2004).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-154 (2004).</li>
<li>Bousso, P., Robey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CD8%28%2B%29+T+cell+priming+by+dendritic+cells+in+intact+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CD8(+) T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes.</a> Nat. Immunol. 4, 579-579 (2003).</li>
<li>Beuneu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+functional+diversification+of+CD8%28%2B%29+T+cell+responses+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Visualizing the functional diversification of CD8(+) T cell responses in lymph nodes.</a> Immunity. 33, 412-412 (2010).</li>
<li>Aimanianda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+hydrophobin+prevents+immune+recognition+of+airborne+fungal+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surface hydrophobin prevents immune recognition of airborne fungal spores.</a> Nature. 460, 1117-1117 (2009).</li>
<li>Snelgrove, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Role+for+LTA4H+in+Limiting+Chronic+Pulmonary+Neutrophilic+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Role for LTA4H in Limiting Chronic Pulmonary Neutrophilic Inflammation.</a> Science. 330, 90-90 (2010).</li>
<li>Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-Cytokine-Chemokine+Cascade+Drives+Neutrophil+Recruitment+in+a+Murine+Model+of+Inflammatory+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lipid-Cytokine-Chemokine Cascade Drives Neutrophil Recruitment in a Murine Model of Inflammatory Arthritis.</a> Immunity. 33, 266-266 (2010).</li>
<li>Nitschke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+and+4-D+imaging+of+immune+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">3-D and 4-D imaging of immune cells in vitro and in vivo.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 1053-1053 (2008).</li>
<li>Niesner, R. A., Andresen, V., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+microscopy+-+focus+on+speed+and+time+resolved+imaging+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon microscopy - focus on speed and time resolved imaging modalities.</a> Immunol Rev. 221, 7-7 (2008).</li>
<li>Bruns, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Extracellular+Traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+Infected+Lung+Tissue+is+Dependent+on+Invading+Neutrophils+and+Influenced+by+Hydrophobin+RodA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Production of Extracellular Traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in Infected Lung Tissue is Dependent on Invading Neutrophils and Influenced by Hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6, 1000873-1000873 (2010).</li>
<li>Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2604-2604 (2003).</li>
<li>Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Kill+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria.</a> Science. 303, 1532-1532 (2004).</li>
<li>Marcos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR2+mediates+NADPH+oxidase-independent+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+cystic+fibrosis+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">CXCR2 mediates NADPH oxidase-independent neutrophil extracellular trap formation in cystic fibrosis airway inflammation.</a> Nat Med. 16, 1018-1018 (2010).</li>
<li>Clark, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+TLR4+activates+neutrophil+extracellular+traps+to+ensnare+bacteria+in+septic+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood.</a> Nat Med. 13, 463-463 (2007).</li>
<li>Bianchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2619 (2009).</li>
</ol>

בזמן אמת 2-פוטון מיקרוסקופית in vivo או באיברים שלמים צברה חשיבות רבה במחקרים העוסקים הפיזיולוגיה של תאים חיסוניים במהלך 10 השנים האחרונות. זה היה עם הטכניקה הזו, כי אירועים חשובים כמו הדינמיקה של הפעלת תא T בתוך בלוטות הלימפה הראשון הפך גלוי 2-4. לאחרונה, חוקרים החלו גם לנתח פונקציות סלולריות ספציפיות כמו הצעדים הראשונים בדור מפעיל תאים ברקמות הלימפה שימוש בגישה זו 5. עם זאת, למרות מספר מושגים ביולוגיים חדשים נחשפו באמצעות שיטה זו, ישנם עדיין מאתגרת שאלות חשובות עבורו אין מחקרים להדמיה intravital פורסמו עד כה. יש לציין כי זו חלה על הריאות של יונקים. ההיבט המעניין של האיבר הזה, כנמל כניסה עבור מגוון רחב של פתוגנים מוטס, עושה את זה אחד המשטחים החשוב ביותר שבו תהליכים מתרחשים החיסונית בגופם של יונקים. עם כל נשימה על תוחלת החיים, חלקיקים לא רצויים הם נשאפים שבחלקם יש פוטנציאל לגרום לזיהומים מסכני חיים 6. זה מובן מאליו כי במקום כה רגיש וסיכנו רשת הדוקה של מנגנוני הגנה צריך להיות נוכח מציג את רפרטואר שלם של המערכת החיסונית. מצד שני זה מאוד חשוב שהמאבק החיסונית הנגרמת נגד פתוגנים פוטנציאליים מקום כזה &quot;מלוכלך&quot; נתונה לפיקוח הדוק. תגובות מוגזמות של המערכת החיסונית לשאת בסיכון גבוה של פגיעה בגופו על ידי פציעה של רקמות איבר מאסיבי על גירוי של תא החיסון נוקבים פעולות 7,8. לאור המחשבות האלה זה יהיה מעניין מאוד מועיל יש את האפשרות לחקור את התנהגות התא בריאות יונקים תחת נכון בתנאים vivo. עם זאת, העובדה כי מערכת כזו עד כה לא יושמו בהצלחה בבירור מצביע על הקשיים העצומים שיש לפתור בהקמת פרוטוקול עבודה. האתגר התובעני ביותר כנראה הוא יציבות להתמקד. הריאות כגוף האחראי על הנשימה תחת תנועה מתמדת בכל שלושת הכיוונים של מרחב לממש שאיפה. תנאי זה לבד גורם לבעיות הדמיה חמורים יכולים להיחשב imagers intravital &quot;סיוט&quot;. כבר תנועה קלה מימד בחלל יש השפעה מסיבית על הידרדרות להציג את מיקרוסקופיים, אשר צריך להיות יציב עם דיוק מיקרומטר על מנת להפיק תמונות בעלות משמעות 9. בהתחשב להתמקד הדוק מטבעו שלה המקומיות 10, 2-פוטון מיקרוסקופית הוא אפילו רגיש יותר אי יציבות מוקד, כמו פריקה של מבנה מסוים בטווח של רק כמה מיקרומטרים בכיוון-Z שווה לאובדן מלא של המוקד ובכך הניסוי נכשל. פרוטוקול שהוצג במחקר זה לצורך השגחה של תאים חיסוניים בתוך הריאה Murine עדיין לא ביישום vivo, אלא הערכה קרובה למצב ריאה שלם מבחינה תפקודית 11. גישות Ex vivo עבור לימפוציטים הדמיה, למשל הלימפה explanted צמתים, הוכחו להניב תוצאות שוות ערך אמיתי תצפיות vivo 12 וכך הן רלוונטיות מאוד 5. בתצפיות באתרם פרוסות ריאה, אשר אפשרי רק עם הגישה שלנו, יתקיים ריאות נגוע זמן קצר לאחר כריתה. שלמות 3D בתהליך חיתוך מובטחת על ידי מטריקס agarose, צעד חיוני כדי לאפשר תהליך חיתוך מבוקר בדיוק של הריאה. אמנם יש צורך לקרר את הריאות explanted לתקופה קצרה כדי לאפשר התמצקות של מטריקס agarose, ניתן לחזור בתנאים פיסיולוגיים ליד עבור תאים לאחר חיתוך rewarming של הרקמה. זו מוצגת בבירור הנתונים שלנו, אשר מראים כי בתנאים אלה נויטרופילים פעילים מאוד ולהציג את מלוא הפוטנציאל שלהם כמו phagocytes זריז, אשר נחוצים פינוי יעיל של זיהום Aspergillus fumigatus. הם מפטרלים רקמת הריאה עובר דרך אפיתל מחסומים כדי להגיע לחלקים הפנימיים של alveoli פעיל יתר על כן הם תופסים נבגי פטריות 11. ממצא מרכזי של עבודה זו הייתה הופעתו של מבנים דומים מלכודות תאי נויטרופילים (סלים) של אספרגילוס האיבר הנגוע. NETS הם ממצא האחרונות מאוד של הרומן מנגנון הגנה נויטרופילים 13. עם זאת, מאז הדיווח הראשוני שלה בשנת 2004, מספר מצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים במודלים של בעלי חיים או בני אדם שבו התופעה נצפתה או חסר כבר בפיצוץ הגדלת 14-16. מעניין לציין, כי כל כך הרבה עבודה כבר בילה על מבנים אלה על ידי קבוצות רבות ושונות כל כך, רוב הדיווחים הם עדיין ברמה תיאורי מאוד ולא הרבהידוע על מנגנון של שחרור NET ורגולציה שלה. עם פרוטוקול שלנו הצלחנו בפעם הראשונה כדי להראות סיבים NET בריאה נגוע. יתר על כן, אנחנו יכולים להדגים את החשיבות של נויטרופילים גייס טרי, כמו גם מבנים מולקולריים פטרייתי עבור המופע שלהם או עיכוב 11. זה מראה בבירור את הפוטנציאל של השיטה שלנו כדי לחקור את אחד השלבים של היווצרות NET ביתר פירוט. אפשר לחשוב למשל להשתמש נויטרופילים מעכברים מתאים עקום החוצה כדי לבחון את יכולתם של היווצרות NET בניסויים העברת המאמצת. לכן, למרות תצפית ישירה של העלייה נויטרופילים מן הדם ההיקפיים אינו אפשרי עם המערכת הזו בשל חוסר אספקת דם לאחר explantation איברים, אנחנו עדיין מאמינים כי פרוטוקול שלנו היא גישה יקר יחסית קל לטפל המאפשר הדמיה של צעדים מוקדם או מאוחר בהגנה החיסונית כנגד דלקות ריאה. זהו, אפוא, צעד חשוב לקראת חוקרת את התופעה בתוך הריאות בנשימה של בעלי חיים.

תצפית ישירה של phagocytosis ו-net היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

לאחר העיכול, הריאות הוא השטח השני בגודלו עבור האינטראקציה בין הגוף חוליות ואיכות הסביבה. הנה, חילופי גז יעיל חייבת להישמר, ואילו באותו זמן הימנעות זיהום על ידי פתוגנים רבים כי הם נשאפים במהלך נשימה רגילה. כדי להשיג זאת, סט מעולה של אסטרטגיות ההגנה שילוב מנגנוני החיסון הלחות ואת הסלולר קיים. אחד האמצעים היעילים ביותר להגנה אקוטית של הריאות הוא גיוס של נויטרופילים, אשר גם phagocytose פתוגנים בשאיפה או להרוג אותם על ידי שחרור חומרים כימיים ציטוטוקסיות. בנוסף האחרונים לארסנל של נויטרופילים הוא לשחרר נפץ שלהם NETS תאי ה-DNA על ידי חיידקים או פטריות, אשר יכול להיתפס או מומת גם לאחר שחרור התאים NET מתו. אנו מציגים כאן שיטה המאפשרת להתבונן ישירות אחד נויטרופילים, נודדים בתוך ריאה נגועה לאחרונה, phagocytosing פתוגנים ופטריות כמו גם לדמיין את NETS נרחב שהם יצרו לאורך הרקמה הנגוע. השיטה מתארת ​​את הכנת פרוסות עבות ריאות קיימא 7 שעות לאחר ההדבקה intratracheal של עכברים עם conidia של העובש אספרגילוס fumigatus ובדיקה שלהם על ידי מיקרוסקופ ססגוניות 2-פוטון זמן לשגות. גישה זו מאפשרת לנו לחקור ישירות הגנה נגד פטריות ברקמת הריאה יליד ובכך פותח דרך חדשה עבור החקירה מפורט של חסינות ריאתי.

אנו מראים, כיצד להשתמש 2-פוטון מיקרוסקופית לצורך השגחה של הדינמיקה של גרנולוציטים נויטרופילים בריאות נגוע בזמן שהם phagocytose פתוגנים או לייצר מלכודות תאי נויטרופילים (סלים).

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

לאחר מערכת העיכול, הריאה היא השטח הגדול השני לאינטראקציה בין גוף בעלי חולייתים לבין הסביבה. כאן, ...

המטרה הכללית של הליך זה היא ויזואליזציה של גרנולוציטים נויטרופיליים חיים ושל רשתות DNA חוץ-תאיות בריאה שנדבקה לאחרונה בפתוגן פטרייתי. ראשית, עכברים שהאוכלוסייה הנויטרופילית שלהם חיובית ל-EGFP מודבקים ב-candia המסומנים אף הם בסימון פלואורסצנטי. לאחר מכן, מאפשרים לזיהום להתפתח במשך שבע שעות, ולאחריהם קוטל את בעל החיים המודבק.לאחר מכן, ממלאים את ריאות בעל החיים המודבק באגרוס בעל נקודת התכה נמוכה כדי להקל על ביצוע חתכים באמצעות ביומי. לבסוף, משיגים פרוסה עבה של רקמת ריאה מודבקת באמצעות ביומי ונויטרופילים של הריאה. רשתות DNA ומרכיבים פטרייתיים מדויקים בתמונה.בסופו של דבר, ניתן להשיג תמונות סטטיות ברזולוציה גבוהה או רצפי סרטונים של גרנולוציטים ברקאת ריאה חיה באמצעות מיקרוסקופיית פוטונים כפולים רב-צבעית. היתרון המרכזי של שיטה זו על פני טכנולוגיות קיימות הוא שניתן לצפות בתאי החיסון האחראים לסילוק הזיהום ישירות בתוך הסביבה הטבעית. ניתן לבצע זאת במהלך תהליך יצירת רשתות (net formation) והריגת הפטריות, ובכך מתאפשר ניתוח של פיזיולוגיית הנויטרופילים עם הרבה פחות ארטיפקטים.המצאתי את הטכניקה הזו כאשר מת'יאס העיק עליי עם שאלותיו הבוערות בנוגע לרלוונטיות in vivo של ממצאי ה-in vitro הקודמים שלי, ואציג את הטכניקה הזו בדקות הקרובות. כדי להפיק קונידיה נפוחה של העובס הסביבתי *Aspergillus fumigatus*, הוסיפו 5 mL של מצע לצלחת תרבית תאים בעלת 6 בארות, לאחר מכן העבירו לצלחת 2×10⁷ קונידיות במצב מנוחה, והדגירו את הנבגים למשך 7 שעות ב-37 °C ב-5% carbon dioxide במעבדה ברמת בטיחות BSL 2.לאחר תקופת הנפיחה, סמנו את הנבגים באופן פלואורסצנטי על ידי הוספת 10 µL של תמיסת calcior white stalk לכל באר, לאחר ערבוב עדין. דגרו את הפלטה למשך 15 דקות נוספות תחת אותם תנאים. כדי לאסוף את הנבגים המסומנים פלואורסצנטית, הניחו מסנן תאים של 70 µm על גבי מבחנה קונית של 50 mL. אספו את הנבגים מהפלטה באמצעות פיפטה, ולאחר מכן העבירו את תמיסת המצע דרך מסנן התאים אל תוך המבחנה.לאחר מכן, סבבו את התאים ב-900 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשליכו את המצע. לאחר מכן, שטפו את הנבגים עם 10 milliliters של PBS תחת אותם תנאי צנטריפוגה. השהו מחדש את משקע הנבגים בשני milliliters של PBS וקבעו את המספר הכולל של canadia נפוחים באמצעות סופר תאים; סבבובו את תרחיף הנבגים שוב תחת אותם תנאי צנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן, ולאחר מכן, הסירו בזהירות את supernatant resus.יש להשהות את המשקע של ה-kedia בריכוז סופי של 10⁷ תאים ל-100 µL של PBS. כדי להכין את העכבר להדבקה בתמיסת הנבגים, יש להרדימו ולאשר את הסדציה על ידי היעדר תגובה ללחיצה על בהונות הרגל. בסרטון זה נעשה שימוש בעכברי lys EGFP, הנושאים EGFP תחת הפרומוטור של הליזוזים ולכן בעלי נויטרופילים חיוביים ל-EGFP. חמש דקות לאחר מתן ההרדמה ואישור הסדציה, השתמשו בגומייה כדי לתלות את העכבר המורדם על גבי תעלת ניקוז באמצעות שיניו, תחת מנורת צוואר-גשמי. השתמשו בפינצטה כדי למשוך את הלשון לצד אחד והחדירו קטטר ורידי קבוע בכיול 22G לקנה הנשימה של בעל החיים.לאחר הכנסה מוצלחת של צינורית זו, השתמש במיקרופיפט של 100 microliter להחדרת 100 microliters של תמיסת הנבגים. לאחר מכן, כדי לשפר את פיזור החלקיקים הפטרייתיים ברחבי הריאה, בצע הנשמה מכנית לבעל החיים המודבק במשך שתי דקות באמצעות רספיטור לבעלי חיים קטנים, בקצב נשימה של 250 breaths per minute ונפח שאיפה של 300 microliters לנשימה. לבסוף, הסר את הקטטר והחזר את העכבר לכלובו למשך שבע שעות בזמן שהזיהום מתפתח.עקוב אחר התאוששות בעל החיים בכל חמש דקות עד שיחזור ללכת, ממש לפני סוף תקופת ההדבקה. המס 20 milliliters של agros בנקודת התכה נמוכה במיקרוגל ושמור אותו חם כדי שה-agros לא יתמצב לפני ההזרקה. במקביל, קרר בקבוק של PBS לטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius במקרר.בסוף תקופת ההדבקה, בעל החיים מושמד (euthanized). השתמש במחטים כדי לקבע את העכבר למשטח הכנה מסיליקון ופתח בזהירות את בית החזה באמצעות מספריים ופינצטה כדי לחשוף את הריאות ואת דרכי הנשימה העליונות. החל מהאפיגלוטיס (מכסה הגרון) החשוף, הכנס קטטר ורידי קבוע נוסף בכילייב 22 (22 gauge) אל תוך הקנה.בעזרת מחט תפירה, עוברים על קשרי חוט תפירה סטנדרטי מסביב לקנה הנשימה כהכנה לשלב מילוי ה-agros הבא של הריאה. לאחר מכן, ממלאים מזרק של 1 mL ב-aros שחומם מראש ומזריקים את התמיסה דרך הקתטר כדי למלא בה את הריאות. ברגע שהריאות מלאות, קושרים את קנה הנשימה בעזרת חוט התפירה שהוכן תוך כדי הוצאת הקתטר, ומניחים את החיה כולה במקרר בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות.לאחר שה-aros התקשח, החל מהקנה, השג את הריאה כולה מחזה הפתוח ושטוף אותה ב-PBS שהוקרר מראש באמצעות מספריים מחודדים. הסר את האונה של הריאה הימנית. ייבש קצרות את תחתית האונה על גיליון נייר סופג ולאחר מכן קבע את האונה לבלוק הכנה של vibram באמצעות טיפה של דבק לרקמות למשך דקה אחת.בשלב הבא, התקינו את הבלוק בתא החיתוך של הוויברטום ומלאו את התא ב-PBS שקולל מראש. הגדירו את התסבוב לרמת רטט בינונית עם הגדרת הנעה מרכזית וחתכו חתך רוחבי אופקי של הריאה. לאחר מכן, הניחו את החצי העליון של רקמת הריאה הפרוסה כשהוא הפוך בתוך צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר של חמישה סנטימטרים.קבע את רקמת הריאה לצלוחית הפטרי על ידי הנחת דיסקיit שטוח מעליה. מלא את הצלוחית ב-10 milliliters של PBS והוסף 10 microliters של צבע cytoxin. לבסוף, התקן את הצלוחית המכילה את רקמת הריאה תחת העדשה של המיקרוסקופ, כך שהבופר יוכל להיות מחומם על ידי מחמם הנשלט על ידי חיישן טמפרטורה ל-37 degrees Celsius לצורך הדמיה.אזורים שונים לאורך סריקת הדיסקציה סורקים לעומק של 400 micrometer תוך שימוש באורך גל של תאורה של 800 nanometers, תוך גילוי פלואורסצנציה בירוק 530 nanometers ובאדום 580 nanometers, וכן את אות יצירת ההרמוניקה השנייה או SHG. בתוך הטווח הכחול של פלואורסצנציה בפליטה של 400 עד 470 nanometers עם גלאי סריקה חיצוניים שאינם DS או NDD המוצגים כאן בכחול, זהו אות ה-SHG של מבנה הרקמה האלבאולרית של ריאה שאינה מזוהמת של עכבר C 57 black six. שימו לב לרקמה הסיבית בתחתית פרוסת הריאה בהשוואה לארגון האלבאולרי הברור בתוך האזורים הפעילים בנשימה בחלק העליון של הריאה.באיור זה, אות ה-cyt talk של גרעיני תאי ריאה שנחתכו במהלך הכנת פרוסת הריאה מוצגים בצבע אדום. איור זה מציג מיזוג של שני הערוצים עם תקריב של האזור המסוגר בריבוע ברקמה המוצגת כאן. אות ה-SHG הכחול מצביע על מבני אלבולה ומבנים פטרייתיים הנוכחים בפרוסת ריאה של עכבר C 57 black six שהודבק שבע שעות קודם לכן ב-afu tis.באיור זה, אות ה-Cyt talk האדום מראה לא רק את הגרעינים של תאי ריאה שנחתכו במהלך הכנת פרוסת הריאה, אלא גם את רשתות ה-DNA כאן. חפיפה של שני הערוצים נראית בגרפיקה מוגדלת זו של האזור הממוסגר מהאיור הקודם. אזורים מובחנים של מסות פטרייתיות, נאדיות ומבני רשת מסומנים באותיות FA ו-N בהתאמה, כאשר המבנה הפטרייתי המשולב ו-SHG של רקמת הנאדיות מופיעים בכחול.אות ה-cyt talk של גרעיני התאים נצבע באדום, וניתן לראות מספר רב של נויטרופילים החודרים לריאות. צבע ירוק ניתן לצפייה כאן בחתך של רקמת ריאה מעכבר lys EGFP. שבע שעות לאחר הדבקה ב-afu goddess, ניתן לראות נויטרופילים בירוק נודדים ופגוציטוזים אלמנטים פטרייתיים בכחול בריאות שהודבקו ב-aspers, כפי שנראה בצילום time-lapse.מיקרוסקופיה דו-פוטונית של פרוסה של ריאה חיה. שבע שעות לאחר ההדבקה, גרעיני תאים ומבני רשת מוצגים בצבע אדום. הזמן האמיתי של הניסוי מוצג בפינה הימנית התחתונה וסרגל המقياس מציין 50 micrometers.כעת שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי זיהומים פטרייתיים. ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון זיהומים נגיפיים או חיידקיים, והיא עשויה לספק תובנות לגבי תפקודם של תאי חיסון תושבים אחרים בתוך הריאה.

direct-observation-phagocytosis-net-formation-neutrophils-infected

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מתארים טכניקה מבוססת מיקרוסקופ כדי להמחיש ולכמת את מפלי האירועים המוקדמים במהלך פגוציטוזיס של פתוגנים כגון הפטריות קנדידה אלביקנס וחלקיקים הגדולים מ-0.5 מיקרומטר כולל חרוזים מצופים זימוזאן ו-IgG.

חזותי בשלבים המוקדמים של Phagocytosis

כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה למדידת ה-pH והשטח הפגוזומלי וכן את ה-pH הציטופלזמי של נויטרופילים אנושיים ועכברים באמצעות האינדיקטור היחסי seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, או S-1. זה מושג באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי של תאים חיים וניתוח תמונה.

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

כאן נתאר שיטות באמצעות דיסק מסתובב קונפוקלית לאירועים phagocytic יחיד תמונה על-ידי מקרופאגים הצפק תושב העכבר. ניתן להאריך את הפרוטוקולים לתאים אחרים phagocytic.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע שני הפוטונים intravital הדמיה ותא ניתוח אינטראקציות בין רירית והכו אותי מאתר לאחר ההדבקה בנגיף שפעת. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי עבור החוקרים ללמוד את הדינמיקה תא החיסון במהלך זיהומים בדרכי הנשימה.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

מלכודות מוכילות (רשתות) הן מבנים תלת-מימדיים שנוצרו על-ידי ממריצים נויטרופילים גרנולוציטים. זה הפך ברור בשנים האחרונות כי רשתות מעורבות במגוון רחב של מחלות. זיהוי רשתות ברקמות עשויות להיות בעלת רלוונטיות אבחונית, ולכן נדרשות פרוטוקולים מתוקננת לתיוג רכיבי NET.

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

מוצג כאן פרוטוקול לאינדוקציה וניתוח של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות במבחנה (NETs). כימות של דנ"א, קתליצידין (LL37) ופעילות אנזים הניב נתונים המראים את השונות בהרכב ובמורפולוגיה של NETs המושרים על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים בתנאים מבוקרים דומים.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים (NETs) קשורות למחלות שונות, ואימונופלואורסנציה משמשת לעתים קרובות להדמיה שלהן. עם זאת, ישנם פרוטוקולי צביעה שונים, ובמקרים רבים, רק סוג אחד של רקמה נבדק. כאן, אנו קובעים פרוטוקול ישים באופן כללי להכתמת רשתות בעכבר וברקמות אנושיות.

הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר

פרוטוקול זה כולל סדרה של בדיקות פונקציונליות נויטרופילים שישמשו כשיטת סינון לכיסוי פונקציות ממסלולי איתות שונים. הפרוטוקול כולל הערכה ראשונית ופשוטה של כדאיות התא, טוהר, ייצור מיני חמצן תגובתי, נדידה בזמן אמת, פגוציטוזה, והצעה ראשונית של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל

אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.

טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של הריאה השמאלית של העכבר המושתל באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. זה מהווה כלי רב ערך לחקר דינמיקה תאית ואינטראקציות בזמן אמת לאחר השתלת ריאות מורין.

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

למד תצפית ישירה של פאגוציטוזה והיווצרות רשתות נויטרופילים בריאות נגועות באמצעות מיקרוסקופיית שני-פוטון. שיטה זו מאפשרת מחקר תפקודי של תאי חיסון בחיה.

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

גלה סרטונים נוספים