תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין גרנולוציטים נויטרופילים חיים ורשתות DNA חוץ-תאיות בריאה שנדבקה לאחרונה בפתוגן פטרייתי. עכברים ראשונים שנמצאו חיוביים ל-EGFP באוכלוסיית הנויטרופילים שלהם נגועים בקנדיות שגם הן מסומנות פלואורסצנטיות. לאחר מכן, מותר לזיהום להתפתח במשך שבע שעות ולאחר מכן מקריבים את החיה הנגועה.

ואז הריאות של החיה הנגועה מתמלאות באגרוס נמס נמוך כדי להקל על החיתוך לפי beome. לבסוף, פרוסה עבה מרקמת הריאה הנגועה נרכשת באמצעות נויטרופילים של ויום וריאות. רשתות DNA ואלמנטים פטרייתיים מצולמים.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תמונות סטילס ברזולוציה גבוהה או רצפי סרטים של גרנולוציטים ברקמת ריאה חיה באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים צבעוני. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני הטכנולוגיות הקיימות הוא שניתן לצפות בתאי החיסון האחראים על פינוי הזיהום ישירות בתוך הסביבה הטבעית. ניתן לעשות זאת במהלך תהליך היווצרות הרשת והרג פטריות, ובכך מאפשר ניתוח הרבה פחות מלאכותי של פיזיולוגיה של נויטרופילים.

המצאתי את הטכניקה הזו כאשר מתיאס הרגיז אותי עם השאלות הבוערות שלו לגבי הרלוונטיות in vivo של הממצאים הקודמים שלי במבחנה, ואציג את הטכניקה הזו בדקות הקרובות כדי ליצור קדיה נפוחה של העובש הסביבתי. Aspergilus fumigatus. הוסף חמישה מיליליטר של מדיום לצלחת תרבית תאים של שש בארות, ואז העביר פעמיים 10 לשביעית, הנח את CEDIA לצלחת, ודגירה על הנבגים במשך שבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני במתקן BSL 2.

לאחר תקופת הנפיחות, תייג את הנבגים באופן פלואורסצנטי על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של תמיסת גבעול לבן סידן לכל באר לאחר ערבוב עדין. דגרו את הצלחת למשך 15 דקות נוספות באותם תנאים כדי לקצור את הנבגים המסומנים בפלואורסצנט, הניחו מסננת תאים של 70 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי של 50 מיליליטר. אסוף את הנבגים מהצלחת באמצעות פיפטה, ולאחר מכן העביר את תמיסת המדיה דרך מאמן התא לתוך הצינור.

לאחר מכן, סובב את התאים ב-900 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשליך את המדיה. לאחר מכן שטפו את הנבגים עם 10 מיליליטר PBS באותם תנאי צנטריפוגה. השעו מחדש את כדור הנבגים בשני מיליליטר PBS וקבעו את המספר הכולל של קנדה הנפוחה על ידי סיבוב נגד תאים על תרחיף הנבגים שוב באותם תנאי צנטריפוגה כמו לפני ואחרי, הסר בזהירות את ה-supernatant resus.

השעו את הקדיה המשקעת בריכוז סופי של אחד כפול 10 לשבעת התאים לכל 100 מיקרוליטר PBS כדי להכין את העכבר לזיהום בתמיסת הנבגים, החיה מורדמת וההרגעה מאושרת על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן. בסרטון זה, עכברי lys EGFP, הנושאים EGFP תחת מקדם הליזוזים ולכן יש להם נויטרופילים חיוביים ל- EFG FP משמשים חמש דקות לאחר מתן הרדמה ואישור הרגעה באמצעות רצועה אלסטית כדי לתלות עכבר נרקוטי על שיפוע בשיניו מתחת למנורת צוואר אווז. השתמש במלקחיים כדי למשוך את הלשון לצד אחד ולהכניס קטטר ורידי בגודל 22 לקנה הנשימה של החיה.

לאחר החדרה מוצלחת של צינור זה, השתמש במיקרו פיפטה של 100 מיקרוליטר כדי לתת 100 מיקרוליטר מתרחיף הנבגים. לאחר מכן, כדי לשפר את פיזור חלקיקי הפטרייה ברחבי הריאה, יש לאוורר מכנית את החיה הנגועה למשך שתי דקות עם מכונת הנשמה קטנה של בעלי חיים בקצב נשימה של 250 נשימות לדקה, ונפח שאיפה של 300 מיקרוליטר לנשימה. לבסוף, הסר את הקטטר והחזר את העכבר לכלוב שלו למשך שבע שעות בזמן שהזיהום מתקדם.

שימו לב להחלמה של החיה כל חמש דקות עד ששוב אמבולטורי, רגע לפני תום תקופת ההדבקה. ממיסים 20 מיליליטר אגרוס נמס נמוך במיקרוגל ושומרים אותו חם כך שהאגרוס לא יתמצק לפני הזרקה. מצננים בקבוק PBS לארבע מעלות צלזיוס במקרר גם בשלב זה.

ממש בסוף תקופת ההדבקה, החיה מורדמת. השתמש במחטים כדי לקבע את העכבר למחצלת הכנה מסיליקון ופתח בזהירות את החזה באמצעות מספריים ומלקחיים כדי לחשוף את הריאות ודרכי הנשימה העליונות. החל מהאפיגלוטיס החשוף, הכנס צנתר ורידי נוסף בגודל 22 לקנה הנשימה.

בעזרת מחט תפירה, חוט תפירה סטנדרטי מונח סביב קנה הנשימה כהכנה לשלב מילוי האגרוס הבא של הריאה. לאחר מכן, מלאו מזרק של מיליליטר אחד עם הארוס המחמם מראש והעבירו את התמיסה דרך הקטטר כדי למלא בו את הריאות. ברגע שהריאות מתמלאות, קושרים את קנה הנשימה סגור בחוט התפירה המוכן תוך הוצאת הקטטר ומכניסים את כל החיה למקרר בחום של ארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר שהארוס התמצק, החל מקנה הנשימה, הוציאו את כל הריאה מהחזה הפתוח ושטפו אותה עם ה-PBS המתקרר מראש בעזרת מספריים מחודדים חדים. הסר את אונת הריאה הימנית. יבש לזמן קצר את תחתית האונה על דף נייר טישו ולאחר מכן קבע את האונה לבלוק הכנת ויברם באמצעות טיפת דבק רקמות למשך דקה אחת.

לאחר מכן, התקן את הבלוק בתא החיתוך של הוויברטו ואז מלא את החדר ב- PBS מקורר מראש. הגדר את סכין הגילוח לרטט בינוני עם הגדרת נהיגה מדיאלית וחתוך חתך אופקי של הריאה. לאחר מכן הניחו את החצי העליון של רקמת הריאה הפרוסה הפוכה בצלחת פטרי מפלסטיק בקוטר חמישה סנטימטרים.

קבע את רקמת הריאה לצלחת הפטרי על ידי הנחת מכונת כביסה שטוחה מעליה. ממלאים את המנה ב -10 מיליליטר PBS ומוסיפים 10 מיקרוליטר צבע ציטוקסין. לבסוף, התקן את הצלחת המכילה את רקמת הריאה מתחת למטרת המיקרוסקופ כך שניתן יהיה לחמם את המאגר על ידי תנור חימום הנשלט על ידי חיישן טמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס לצורך הדמיה.

אזורים שונים לאורך החיתוך R סורקים עד לעומק של 400 מיקרומטר באמצעות אורך גל תאורה של 800 ננומטר המגלה פלואורסצנטיות ירוקה של 530 ננומטר ואדום 580 ננומטר, כמו גם את הדור ההרמוני השני או אות SHG. בפלואורסצנציה הכחולה של המועצה בפליטה של 400 עד 470 ננומטר עם גלאי סריקה חיצוניים שאינם DS או NDD המוצג כאן בכחול הוא אות ה-SHG של מבנה הרקמה המכתשית של ריאה לא נגועה של עכבר C 57 שחור שש. שימו לב לרקמה הסיבית בתחתית פרוסת הריאה בהשוואה לארגון המכתשית בבירור בתוך האזורים הפעילים בנשימה בחלק העליון של הריאה.

באיור זה, אות הדיבור של גרעיני תאי ריאה שנחתכו במהלך הכנת פרוסת הריאה מוצגים באדום. איור זה מציג שכבת-על של שני הערוצים עם תקריב של האזור הקופסה של הרקמה המוצג כאן. הנה. אות ה-SHG הכחול מצביע על המבנים המכתשית והפטרייתית הקיימים בפרוסת ריאה של עכבר C 57 שחור 6 שנדבק שבע שעות קודם לכן ב-afu tis.

באיור הזה, אות הדיבור האדום של Cyt מראה לא רק את גרעיני תאי הריאה שנחתכו במהלך הכנת פרוסת הריאה, אלא גם את רשתות הדנ"א כאן. ניתן לראות שכבת על של שני הערוצים בגרפיקה מוגדלת זו של השטח הקופסה מהאיור הקודם. אזורים מובהקים של מסות פטרייתיות, נאדיות ומבנים נטו מסומנים באותיות FA ו-N בהתאמה, המבנה הפטרייתי המשולב ו-SHG של הרקמה המכתשית כחולה.

אות הדיבור של גרעיני התאים והרשתות אדום, כמו גם נויטרופילים רבים החודרים לריאות. ניתן לדמיין ירוק כאן בפיסת רקמת ריאה מעכבר EGFP lys. שבע שעות לאחר ההדבקה באלת האפו ניתן לראות נויטרופילים בירוק נודדים ופגוציטוזציה של אלמנטים פטרייתיים בכחול בריאות נגועות באספרס כפי שניתן לראות על ידי זמן-lapse.

מיקרוסקופ שני פוטונים של פרוסת ריאה חיה. שבע שעות לאחר ההדבקה, גרעיני התאים ומבני הרשת מתוארים באדום. הזמן האמיתי של הניסוי מוצג בפינה הימנית התחתונה וסרגל קנה המידה מעיד על 50 מיקרומטר.

כעת שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי זיהומים פטרייתיים. זה עשוי להיות מיושם גם על מערכות אחרות כמו זיהומים נגיפיים או חיידקיים, וזה עשוי גם לתת תובנה לגבי התפקוד של תאים חיסוניים אחרים בתוך הריאה.