רגישות גבוהה 5-hydroxymethylcytosine איתור ברקמה Balb / C המוח
1 בפברואר 2011
EpiMark 5-5-HMC ו MC ערכת ניתוח יכול לשמש כדי לנתח לכמת 5-5-methylcytosine ו hydroxymethylcytosine בתוך מוקד spe cific. הערכה מבדיל 5-MC מתוך 5-HMC על ידי תוספת של גלוקוז אל קבוצת הידרוקסיל של 5-HMC דרך התגובה האנזימטית ניצול β-glucosyltransferase (T4-BGT). כאשר 5-HMC מתרחשת בהקשר של CCGG, שינוי זה ממיר אתר cleavable MspI לאתר הלא cleavable.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח ולכמת 5-מתיל ציטוזין ו-5-הידרוקסי אתיל ציטוזין בתוך לוקוס ספציפי של DNA גנומי. דבר זה מושג על ידי חסימה (gating) של קבוצת ההידרוקסיל של 5-הידרוקסי אתיל ציטוזין, פעולה הממירה אתר MSP 1 שניתן לעיכול לאתר שאינו ניתן לעיכול. כשלב שני, ה-DNA הגנומי מעוכל על ידי אנזימי הגבלה, MSP 1 ו-HPA 2, המנצלים את הרגישויות השונות שלהם למתילציה כדי לזהות אתרים של 5-הידרוקסי אתיל ציטוזין הקשורים לגלוקוז.
בשלב הבא נעשה שימוש ב-PCR על מנת לבחון את הלוקוס. התוצאות המתקבלות מראות נוכחות של five hydroxyethyl cytosine בלוקוס ספציפי. ניתן להשתמש ב-QPCR כדי לכמת את כמות ה-five methyl cytosine וה-five hydroxyethyl cytosine.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון ריצוף ביסולפיט, הוא היכולת להבחין בין 5-methylcytosine לבין 5-hydroxyethylcytosine. את הניסויים היום תבצע Romas Vice Villa; Romas הייתה מפתחת ראשית של ערכה זו ב-New England Biolabs. לפני תחילת הפרוטוקול, purified the genomic DNA מרקמת מוח של B Sea כפי שמתואר בנוהל הכתוב. בתוך מבחנה לתגובה בנפח 1.5 מיליליטר, ערבב את ה-genomic DNA, UDP-glucose, NEB buffer 4 וכמות מספקת של מים נטולי נוקלאז כדי להביא את הנפח הכולל ל-310 µL.
חלק תערובת תגובה זו לשתי מבחנות של 155 µL כל אחת. לאחר מכן, הוסף לשתי המבחנות 30 units או 3 µL של T4 beta-glucosyltransferase. ערבב היטב על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה.
אין להוסיף את ה-T4 BGT למבחנה השנייה מכיוון שהיא משמשת כתגובת ביקורת, אך יש להוסיף שלושה מיקרוליטרים של מים. דגרו את שתי המבחנות בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 עד 18 שעות, ובמהלך זמן זה ה-BGT יוסיף גלוקוז לקבוצת ההידרוקסיל של קבוצות 5-hydroxyethyl cytosine בדגימה. כדי להתחיל את עיקר אנזים ההגבלה, העבירו מנה של 50 µL מתערובת התגובה לכל אחת משלוש מבחנות PCR strip בנפח 0.2 mL המסומנות כמספר 1 עד 3.
לאחר מכן, העבירו מנה (aliquot) של 50 µL מתערובת הביקורת לכל אחת משלוש מבחנות PCR של פס (strip tubes) המסומנות כ-4 עד 6. הוסיפו 100 units של msp, אחת למבחנות 1 ו-4. לאחר מכן, הוסיפו 50 units של HPA 2 למבחנות 2 ו-5 וערבבו היטב על ידי פיפוט עדין מעלה ומטה.
אין להוסיף דבר למבחנות שלוש ושש, כיוון שהן משמשות כביקורות. הדגרו את שש המבחנות בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות לפחות. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של proteinase K לכל מבחנה והדגרו בטמפרטורה של 40 °C למשך 30 דקות.
לבסוף, יש לבטל את פעילות ה-proteinase K על ידי דגירה ב-95 °C למשך 10 דקות. הליך זה מודגם באמצעות NE B'S long amp TAC עבור endpoint PCR. עם זאת, ניתן להחליף את ריאגנטים ופרוטוקולים אחרים של PCR בתוך מבחנה לתגובת PCR בנפח 0.2 ml על קרח.
הוסיפו 5x long amp TAC reaction buffer, DN NTPs, פריימרים קדמיים ואחוריים, את ה-template DNA שהתקבל קודם לכן, long AMP TDNA polymerase וכמות מספקת של מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) כדי להגיע לנפח סופי של 50 microliters. ערבבו בעדינות את התגובה ובמידת הצורך, רכזו את כל הנוזל לתחתית המבחנה באמצעות ספינט קצר. העבירו את מבחנות ה-PCR מהקרח לתרמוסייקלר שבלוק שלו חומם מראש ל-94 degrees Celsius והפעילו את תוכנית המחזורים עבור PCR שגרתי בן שלושה שלבים.
יש לבצע שלב דנטורציה ראשוני אחד ב-94 °C למשך 30 שניות, ולאחריו 30 מחזורים של דנטורציה ב-94 °C למשך 15 שניות, הידבקות (annealing) ב-55 עד 65 °C למשך 30 שניות והארכה ב-65 °C למשך 20 שניות או 50 שניות ל-kb. לאחר מכן יש לבצע שלב הארכה סופי אחד ב-65 °C למשך חמש דקות. ניתן לבצע גם Realtime PCR כדי לכמת את כמויות ה-5-methylcytosine וה-5-hydroxymethylcytosine.
אנא עיינו במדריך המוצר הנמצא ב-nb. com לקבלת מידע ספציפי. ביצוע השוואה של כמויות hydroxyethyl aine חמישה ב-Locus 12 בוצע באמצעות endpoint PCR ו-real-time PCR; נדגמו ארבע דגימות שונות של רקמות עכבר BSY, כולל מוח, כבד, לב וטחול.
השונות ב-five hydroxyethyl cytosine ניכרת במסלול הג'ל המסומן בריבוע של דגימות ה-endpoint PCR לצורכי השוואה. נתוני ה-Real-time PCR נורמלו ביחס ל-DNA שלא נחתך, ועקומת סטנדרט שימשה לקביעת מספר העותקים. הדגימות נורמלו על ידי חלוקת מספר העותקים של הדגימות במספר העותקים של ביקרת ה-undigested.
כאן ניתן לראות את השונות ב-five hydroxyethyl cytosine על ידי השוואת הפסים הצהובים. מספר הערות על ביצוע הטכניקה: קריטי שכל התגובות האנזימטיות יגיעו לסיום. עבור ה-BGT, חשוב להמתין לילה שלם כדי שתוכלו לבודד את כל אתרי ה-DNA עבור Ms.P one ו-HEPA two; חשוב להמתין לפחות ארבע שעות עם תגובות אלו כדי לוודא שהגעתם לסיום.
ולסיום, אנו מספקים בקרות DNA ובקרות פריימרים, כך שתוכלו לבצע תגובות בקרה במקביל.
סקירה כללית
ערכת ניתוח EpiMark 5-hmC and 5-mC מאפשרת ניתוח וכימות של 5-methylcytosine ו-5-hydroxymethylcytosine באתרים גנומיים ספציפיים. שיטה זו עושה שימוש בתגובות אנזימטיות כדי להבחין בין שתי מודיפיקציות אלו, ובכך מספקת תובנות לגבי דפוסי מתילציה של DNA.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנומיקה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- 5-methylcytosine (5-mC) ו-5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) הם מודיפיקציות אפיגנטיות חשובות.
- הבנת הפריסה שלהם בגנום היא קריטית לחקר ויסות גנים.
- ערכה של EpiMark מספקת שיטה אמינה להבחנה בין מודיפיקציות אלו.
- תגובות אנזימטיות מקלות על ניתוח של לוקוסי DNA ספציפיים.
מטרת המחקר
- לניתוח ולכימות של 5-mC ו-5-hmC בתוך אזורים גנומיים ספציפיים.
- להשתמש בערכת EpiMark לשיפור הגילוי של מודיפיקציות אלו.
- להשוות את יעילותה של שיטה זו מול טכניקות מסורתיות.
שיטות שנutilized
- המרה אנזימטית של 5-hmC לאתר שאינו ניתן לניסור באמצעות β-glucosyltransferase.
- עיכול של DNA גנומי באמצעות אנזימי הגבלה MspI ו-HpaII.
- תגובת שרשרת פולימראז (PCR) להגברה של אזורי מטרה.
- PCR כמותי (qPCR) למדידת הרמות של 5-mC ו-5-hmC.
תוצאות עיקריות
- הבחנה מוצלחת בין 5-mC ל-5-hmC באטרי loci ספציפיים.
- נתונים כמותיים המדגימים את נוכחותו של 5-hmC בדגימות רקמות שונות.
- השוואה של תוצאות מ-endpoint PCR ומ-real-time PCR.
- שונות ברמות ה-5-hmC שנצפתה ברקמות עכבר שונות.
מסקנות
- ערכת ה-EpiMark יעילה לניתוח מודיפיקציות של מתילציה של DNA.
- שיטה זו מספקת יתרון משמעותי לעומת ריצוף ביסולפיט מסורתי.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל טכניקה זו להשגת תובנות מעמיקות יותר לגבי בקרה אפיגנטית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מדויק וספציפי לאתר של 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) תומך בתיקוף של מטרות אפיגנטיות בגילוי תרופות למדעי העצבים, על ידי הבחנה בין הידרוקסמתילציה פונקציונלית לבין רעש של מתילציה. שיטה אנזימטית זו מאפשרת הערכה כמותית של מצבים אפיגנטיים באתרים גנומיים מוגדרים, ובכך משפרת את הביטחון החזוי במחקרי מעורבות מטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים. היא נותנת מענה לפער קריטי בפיתוח ביומרקרים אפיגנטיים, שבו גישות מבוססות ביסולפיט אינן מצליחות להבדיל בין 5-hmC לבין 5-methylcytosine (5-mC).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות אפיגנטיות על ידי הבחנה בין 5-hmC ל-5-mC בלוקוסים ספציפיים, ובכך מבהיר תפקידים מכניסטיים בבקרת גנים.
- ערך תפעולי: מספק רזולוציה ספציפית ללוקוס ללא צורך בריצוף, ובכך מפחית את המורכבות בסריקה אפיגנטית בשלבים מוקדמים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות (target de-risking) על ידי אישור מצבים של מודיפיקציה אפיגנטית הקשורים לפעילות תמלול ברקמות הרלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות מבוססות הגברה (endpoint או qPCR) המאפשרות ניתוח השוואתי של רמות 5-hmC בין תנאים ניסיוניים שונים.
- ערך תפעולי: נעשה שימוש בתשתית PCR סטנדרטית, המאפשרת סטנדרטיזציה של הבדיקה ויכולת הרחבה בין מעבדות.
- ערך הדירות: תגובות בקרה פנימיות (mock-glucosylated) מבצעות נורמליזציה ליעילות העיכול, ובכך משפרות את מהימנות הנתונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: הוכחת ישימות ברקמות מוח, כבד, לב וטחול של עכברים תומכת בחקירה של סמנים ביולוגיים חוצי-רקמות.
- המשכיות פרה-קלינית: מאפשר מעקב לאורך זמן של דינמיקת 5-hmC במודלים של מחלות, תוך קישור שינויים אפיגנטיים לתוצאות פנוטיפיות.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מסייע בהקשר בין הידרוקסי-מתילציה ספציפית לאתר (locus-specific) לבין הפעלת מסלולים, ובכך מפחית עמימות לגבי מנגנון המטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת במסלול העבודה של גילוי אפיגנטי לאחר זיהוי המטרה ולפני תיקוף פונקציונלי, ומספקת פנוטיפ מולקולרי של מצבים אפיגנטיים בלוכוסים מועמדים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי קביעה האם אתר CpG רלוונטי מכיל 5-hmC, ובכך מסייע בבחירת מטרות על בסיס פעילות אפיגנטית.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות וספציפיות ללוקוס, התואמות לסריקה ברמת תפוקה בינונית של מודולטורים אפיגנטיים.
- אנליטיקה: תוצרי qPCR מאפשרים הערכת מספר עותקים ונורמליזציה, ובכך מקלים על השוואה סטטיסטית בין קבוצות טיפול.
- מחקר תרגומי: זיהוי ספציפי לרקמה במוח ובאיברים פריפריים תומך בהערכת רלוונטיות של ביומרקרים במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: הפרוטוקול משתמש בריאגנטים וציוד סטנדרטיים של ביולוגיה מולקולרית, מה שמאפשר אימוץ נרחב על ידי צוותים בתחומי האפיגנטיקה, מדעי העצבים וגנומיקה פונקציונלית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרים אפיגנטיים על ידי אספקת הבחנה חד-משמעית בין 5-mC ל-5-hmC.
- ערך תפעולי: מבטל את הצורך בהמרה של ביסולפיט או בריצוף, ובכך מפשט את זרימת העבודה ומקצר את זמן התוצאות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go בתוכניות למטרות אפיגנטיות באמצעות אספקת נתונים כמותיים ומהימנים על מודיפיקציות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון, המבוסס על מעורבות אפיגנטית מאומתת בלוכוסים רלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות ביולוגיה מולקולרית, כולל עיכול רסטריקציה ו-PCR.
- תלוי בגישה לגלוקוזילטרנספראז (T4-BGT) ואיזושיזומרים הרגישים למתילציה (MspI/HpaII).
- מחייב תכנון קפדני של פריימרים המקיפים את אתרי CCGG כדי להבטיח הגברה ספציפית.
- ביצועים אופטימליים דורשים תגובות אנזימטיות מלאות (גלוקוזילציה למשך לילה, עיכול של ≥ 4 שעות).
- מוגבל לאטרי CCGG; אינו רלוונטי לניתוח רחב-גנומי או לאתרים שאינם CCGG.
