Name: מדידה מדויקת ופשוטה 1β-IL Pro-ציטוקין דלקתי באמצעות גירוי Assay Whole Blood (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T18:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: למד מדידת ציטוקינים דלקתיים בדם מלא באמצעות גירוי LPS לזיהוי מחלות אוטואימוניות. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של רמות IL-1β בנפח דם מוגבל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר עירונית של המכון הלאומי של דלקת מפרקים ומחלות עור השלד והשרירים וכן של המכון הלאומי לבריאות.

1. איסוף דם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השגת מינימום של 10 מ"ל של דם היקפיים מ אנשים מושפעים, כמו גם גיל ומין שולטת בריא מתאימים. דם ורידי יש לאסוף לתוך הפרין סודיום vacutainer צינורות דם אוסף, ולא באמצעות תרופות נגד קרישת דם אחרים כמו EDTA, וכמה פעמים הפוכה על מנת להבטיח תערובת נכונה עם הפרין סודיום. שים לב, 10 מ"ל הוא נפח מינימלי של דם כל הנדרש דגימות ציפוי בשני עותקים עבור assay המסוים הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות אמורה להתבצע מוקדם ככל האפשר לאחר איסוף התוצאות הטובות ביותר. עם זאת, דם heparinized ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר תחת תאורה עמומה של עד 24 שעות עד מוכן להיות מעובד (2). </li></ol> 2. הכנה של דם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל דגימות דם ב 3000 סל"ד (עם בלם מבוטלת) במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. מבלי להפריע את המעיל באפי, הפלזמה ניתן לאסוף מראש ומאוחסנים לצורך ניסויים אחרים. דגימות פלזמה יכול להיות מאוחסן באופן זמני ° C עבור אחסון לטווח ארוך ב -20 ° C או -80 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פלזמה נאסף, לשטוף דגימות ידי resuspending תא הדם האדומים (RBC) גלולה ואת המעיל באפי עם סרום חופשי (חלקית) RPMI 1640 מדיה (בטמפרטורת הסביבה). פיפטה בעדינות את התערובת צינורות איסוף והעברת צינור חרוטי 50 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח של עד 50 מ"ל עם שלם RPMI 1640 בתקשורת תרבות בעדינות להפוך את הצינורות כדי ליצור תערובת הומוגנית. צנטריפוגה דגימות ב 3000 סל"ד (עם בלם מבוטלת) למשך עשר דקות. לוודא שיש הפרדה ברורה, לשאוב supernatant, נזהרת לא להפריע את המעיל באפי. חזור על נוהל זה 2-4 פעמים על מנת להבטיח כי כל המזהמים ואת ציטוקינים מחויב מוסרים לפני הגירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף האחרון, resuspend גלולה RBC ו באפי מעיל כך הנפח הכולל הוא 20 מ"ל (עבור 10 מ"ל של דם מלא נמשך בתחילה) עם שלם RPMI 1640 התקשורת. הנפח הכולל יכול להיות מותאם על בסיס נפח הדם נמשך בתחילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות חזון Cellometer, דם מדולל ניתן לספור ללא RBCs lysing ידי בחירה דם לבנים ספירת אפשרות שימוש acridine כתום (AO). מוסיפים דם חלק מדולל AO חלק אחד ולטעון 20 μL מתערובת 01:01 החדרה הספירה הפנויה. הריכוז הסופי של AO לאחר דילול צריך להיות 1μg/mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם בהתאם עם שלם RPMI 1640 מדיה ריכוז התא הסופי של 2.0 x 10 6 תאים / מ"ל. </li></ol> 3. גירוי של דם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay דורש מינימום של ארבעה תנאים (כל אחד נעשה בשני עותקים): unstimulated, תוספת של LPS לבד, תוספת של ה-ATP לבד, ולבסוף LPS ועוד הוסיף ATP ביחד. הוסף 1 מ"ל של 2.0 מוכן x 10 6 תאים / מ"ל דם מדולל שלם לתוך הבאר המתאים צלחת 24 גם בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממריצים צריך להיות מחדש והביא עד לטמפרטורת החדר לפני תחילת assay גירוי. Lyophilized LPS ו-ATP צריך להיות מחדש על פי הוראות היצרן. בעקבות הכינון מחדש, LPS ו-ATP יכול להיות מדולל נוספת ריכוז המניה הנכונה באמצעות שלם RPMI 1640 התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף LPS של LPS בלבד, כמו גם את LPS בתוספת ATP גם כך ריכוז העבודה הסופית של LPS הוא 1 מיקרוגרם / מ"ל. בפעם גירוי הכולל הוא 3 שעות. עם זאת, הדם הזה הוא מגורה עם LPS עבור 2 שעות ו 40 דקות. דוגמאות צריך להיות ממוקם באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ATP הוא הוסיף במהלך 20 הדקות הנותרות של תקופת 3 שעות גירוי. הוסף ל-ATP בלבד ATP ו LPS היטב ATP דגימות מקום חממה. ריכוז העבודה הסופית של ה-ATP הוא 2 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה 3 שעות, לאסוף supernatants ידי aliquoting כל מדגם לתוך צינור 1.5 microcentrifuge מ"ל ולאחר מכן centrifuging דגימות בסל"ד 10000 למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את supernatants להגדיר אחרת של 1.5 צינורות microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות ניתן assayed מיד או מאוחסן באופן זמני ° C עבור אחסון לטווח ארוך ב -20 ° C או -80. </li></ol> 4. ציטוקין Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות כי הם קפואים צורך לאזן לטמפרטורת החדר לפני ניתוח. ריכוזים ציטוקין IL-1βcan להעריך באמצעות מגוון של שיטות. אנו מנצלים את ציטוקינים Bio-Plex האדם Pro x-Plex assay עם מערכת 200 Bio-Plex, לפי הוראות היצרן. בפרוטוקול זה אנו במיוחד למדידת IL-1β, עם זאת, אנו מנצלים את זה assay ציטוקינים זמנית כדי למדוד בו זמנית מספר רב של ציטוקינים assay אחד עם התועלת של השימוש נפח דגימה קטנה. </li></ol> 5. נציג תוצאות ניתוח של ייצור IL-1β על גירוי מוצלח עם LPS ו-ATP מציגה לעשותse התגובה תלויה במספר התאים להיות מגורה. מצאנו כי 2.0 x 10 6 תאים / מ"ל ריכוז מספיק כדי לייצר ריכוז אופטימלי למדידה של IL-1β כמו גם ציטוקינים אחרים (איור 2). מבחני דם שלמים שימושיים בלימוד חולים בהווה עם גילויי autoinflammatory. חולים אלה עשויים להראות פגם במערכת החיסון המולדת, אשר יכול להיות מאופיין על ידי ייצור יתר של IL-1β (כאשר בהשוואה לקבוצת הביקורת) על גירוי עם LPS לבד (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/2662/2662fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הדימוי נציג מכתים AO עבור גרעיני בתאי הדם הלבנים השתמשו על מנת לקבוע ריכוז תא בדילול דגימות דם כולו. <img src="/files/ftp_upload/2662/2662fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור IL-1β הייצור נמדד supernatants דם כל מתורם בריא על גירוי עם LPS בריכוזים הגדלת התא. דוגמאות היו assayed בשלושה עותקים. <img src="/files/ftp_upload/2662/2662fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. תוצאות נציג הפרשת IL-1β נמדד supernatants דם שלם שני פקדים נורמליים ובריאים, כמו גם שני חולים עם הצגת IL-1β הקשורים ביטויים autoinflammatory.

<ol><li>Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasomes%3A+guardians+of+the+body%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammasomes: guardians of the body.</a> Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).</li>
<li>Thurm, C. W., Halsey, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytokine+production+using+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytokine production using whole blood.</a> Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.</li>
<li>Mariathasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopyrin+activates+the+inflammasome+in+response+to+toxins+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP.</a> Nature. 440, 228-232 (2006).</li>
<li>Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1+pathways+in+inflammation+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">IL-1 pathways in inflammation and human diseases.</a> Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).</li>
<li>Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).</li>
<li>Sims, J. E., Smith, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-1+family%3A+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The IL-1 family: regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).</li>
<li>Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+production+and+pattern+recognition+receptor+%28PRR%29+expression+in+whole+blood+stimulated+with+pathogen-associated+molecular+patterns+%28PAMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs.</a> Cytokine. 32, 304-315 (2005).</li>
<li>Netea, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+the+activation+of+the+inflammasome+for+processing+and+release+of+IL-1bin+monocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages.</a> Blood. 113, 2324-2335 (2009).</li>
<li>Latz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasomes%3A+mechanisms+of+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immnol%22%5BJournal%5D)">The inflammasomes: mechanisms of activation and function.</a> Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).</li>
<li>Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horror+autoinflammaticus%3A+the+molecular+pathophysiology+of+autoinflammtory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease.</a> Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Assay דם כל המתואר היא שיטה פשוטה יותר מקרוב מחקה מצבים פיזיולוגיים לעומת טכניקות אחרות, כי ידרוש בידוד תא ועיבוד מניפולציה מדגם נרחב. שיטה זו מנצלת את חזון Cellometer עם AO לספור בתאי הדם הלבנים בדם כולו, ולכן מספק דרך במדויק לתקנן דגימות מבוסס על מספרים סלולריים. יש לציין כי עבור assay זה, דם כל צריך להיגרר הפרין צינורות נתרן אוסף כמו נוגדי קרישה אחרים ידועים chelators סידן ולכן יכול להשפיע על תוצאות assay. תקש...

<table><tbody><tr><td>מבחנות לאיסוף דם עם Sodium Heparin</td><td>BD Biosciences</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>מדיום RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21870-100</td><td></td></tr><tr><td>Acridine Orange</td><td>Invitrogen</td><td>A3568</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Vision</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td>יש ליצור קשר עם החברה לקבלת מידע על המכשיר</td></tr><tr><td>תאי ספירת תאים של Cellometer</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100</td><td></td></tr><tr><td>פלטת תרבית רקמה בעלת 24 בארות</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; K12 LPS</td><td>Invitrogen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;#180;-tripohasphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>מערכת Bio-plex 200</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>יש ליצור קשר עם החברה לקבלת מידע על המכשיר</td></tr><tr><td>בדיקת Bio-Plex Pro human cytokine x-plex</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>בדיקות x-plex מיוצרות בהתאמה אישית בהתאם לציטוקינים ספציפיים שנבחרו</td></tr></tbody></table>

מדידה מדויקת ופשוטה 1β-il pro-ציטוקין דלקתי באמצעות גירוי assay whole blood

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

תהליכים דלקתיים הנובעים הפרשה של מתווכים מסיסים על ידי תאים חיסוניים, להוביל ביטוייה השונים בעור, במפרקים וברקמות אחרות, כמו גם הומאוסטזיס ציטוקינים משתנה. מערכת החיסון המולדת ממלא תפקיד מכריע בזיהוי פתוגנים אחרים גירויים סכנה אנדוגני. אחד הציטוקינים העיקריים שפורסמו על ידי תאים חיסוניים מולדים הוא אינטרלויקין (IL) -1. לכן, אנו מנצלים assay כל גירוי דם כדי למדוד את הפרשת ציטוקינים דלקתיים, ובמיוחד של הפרו דלקתי ציטוקינים IL-1β 1, 2, 3. חולים עם תפקוד גנטיות של מערכת החיסון המולדת גרימת תסמונות autoinflammatory להראות שחרור מוגזם של בוגרת IL-1β על גירוי עם LPS לבד. כדי להעריך את מרכיב החיסון המולדת של חולים עם דלקת להציג הקשורים פתולוגיות, אנו משתמשים immunoassay ספציפיים כדי לזהות התגובה החיסונית התאית הפתוגן הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs), כגון רעלן פנימי גרם שליליים של החיידק, lipopolysaccharide (LPS ). PAMPs אלה מוכרים על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן (PRRs), הנמצאים על תאים של מערכת החיסון המולדת 4, 5, 6, 7. האות הראשוני, LPS, בשיתוף עם האות המשני, ה-ATP, הוא הכרחי עבור הפעלת inflammasome, מורכבת multiprotein כי תהליכים תומכי IL-1β כדי ליצור בוגרת, ביו שלה 4, 5, 6, 8, 9, 10. Assay דם שלם דורש מניפולציה מדגם מינימלי כדי להעריך ייצור ציטוקינים בהשוואה לשיטות אחרות הדורשות בידוד culturing עבודה אינטנסיבית של אוכלוסיות תאים ספציפיים. שיטה זו שונה מן האחרים מבחני גירוי כולו דם, ולא דילול דגימות עם יחס של RPMI התקשורת, אנו מבצעים תא דם לבן לספור ישירות מן הדם כולו מדולל ולכן, לעורר מספר ידוע של כדוריות הדם הלבנות בתרבות 2. תוצאות assay דם בפרט הזה להפגין טכניקה חדשנית שימושי הבהרת המחזורים המטופל עם הצגת pathophysiologies autoinflammatory.

אנו מתארים immunoassay פשוט למדוד את הייצור של ציטוקינים דלקתיים הפרו, כגון ייצור IL-1 בטא, בחולים עם הצגת פנוטיפים autoinflammatory. על ידי הפעלת התאים בתרביות דם שלם עם הפתוגן הקשורים דפוסי מולקולרית, במיוחד עם lipopolysaccharide, הפרשת ציטוקינים ניתן להעריך בנוחות supernatants הדם כולו.

מדידה מדויקת ופשוטה 1β-IL Pro-ציטוקין דלקתי באמצעות גירוי Assay Whole Blood

תהליכים דלקתיים הנובעים מהפרשה של מתווכים מסיסים על ידי תאי מערכת החיסון, מובילים למניפסטציות שונות בעור, במפרקים וברקמות אחרות...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד ציטוקינים פרו-דלקתיים המופקים במבחן גירוי של דם מלא. ראשית, הרכיבים התאיים של דם מלא מבודלים מהפלסמה באמצעות סנטריפוגציה, ותאי הדם הלבנים נספרים באמצעות צביעה ב-aine orange. לאחר מכן, התאים נזרעים ומגורים באמצעות LPS ואחריו TP כדי לעורר ייצור ציטוקינים על ידי תאים הנושאים קולטני זיהוי תבניות מיקרוביאליות; לאחר מכן נאספים על-נוזלי תרבית בנקודות זמן ספציפיות לאחר תחילת הגירוי.לבסוף, ריכוזי הציטוקינים בתעלילים נמדדים באמצעות בדיקת multiplex בלוחית של 96 בארות. באמצעות שיטה פשוטה זו, ניתן להעריך במהירות וריאציות בריכוזים של ציטוקינים פרו-דלקתיים המופקים על ידי תאים שעברו גירוי מתורמים שונים. שיטה זו שימושית במיוחד לזיהוי מחלה דלקתית המתווכת על ידי I one בחולה המציג ביטויים אנטי-דלקתיים פתולוגיים, במיוחד בנסיבות שבהן נפח הדם שניתן להשיג הוא מוגבל.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות במדידת ריכוזי ציטוקינים הוא שהטכנולוגיה המבוססת על Luminex מאפשרת מדידה סימולטנית של מספר ציטוקינים תוך שימוש בנפח דגימה קטן בלבד. השג דגימות המכילות 10 milliliters או יותר של דם ורידי מאנשים נפגעים, וכן מקבוצות ביקורת בריאות התואמות להם בגיל ובמין. ודא כי הדגימות נאספות במבחנות איסוף דם מסוג vacutainer המכילות sodium heparin, ושלא הוספו EDTA או נוגדי קרישה אחרים, שכן אלו יפריעו לבדיקה. עיבד את הדגימות בהקדם האפשרי לאחר האיסוף. במידת הצורך, ניתן לאחסן את הדגימות עד 24 שעות בטמפרטורת החדר בתנאי תאורה עמומה.סבב את דגימות הדם בצנטריפוגה ב-3000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כאשר הבלם (break) כבוי. לאחר סבב הדגימות, הסר את הפלסמה מהחלק העליון של המבחנות, תוך הקפדה לא להפריע לשכבת ה-buffy coat המכילה תאים חד-גרעיניים. השהה מחדש את ה-buffy coat ואת משקע תאי הדם האדומים שמתחתיו בתוך מצע RPMI ללא סרום בטמפרטורת החדר, כדי לשטוף את התאים באמצעות פיפטור עדין של התערובת.לאחר מכן, העבירו את התאים ממבחנת האיסוף למבחנה קונית של 50 מיליליטר. השלימו את הנפח ל-50 מיליליטר באמצעות RPMI והפכו בעדינות כל מבחנה כדי לערבב. סבבו את התאים בצנטריפוגה פעם נוספת במהירות של 3000 RPM למשך 10 דקות.לאחר מכן, שאבו את העל-מיתמר (supernatant), תוך הקפדה לא להפריע למשב התאים. חזרו על שלב שטיפה זה פעמיים עד ארבע פעמים כדי להסיר מזהמים ולסלק ציטוקינים הקשורים לתאים. לאחר שטיפת התאים, השקיפו אותם ב-RPMI ללא סרום לנפח סופי של 20 milliliters. לספירת התאים, העמיסו 20 microliters של תערובת ביחס של 1:1 של הדגימה ו-acridine orange לתוך תא ראייה (vision chamber) חד-פעמי. acridine orange בריכוז סופי של 1 microgram per milliliter יצבע רק תאי דם לבנים בעלי גרעין, מה שיאפשר להבחין ביניהם לבין תאי דם אדומים.ספור רק את התאים החיוביים ל-D לאחר קבלת ספירת התאים הכוללת. השהה מחדש את הדגימות ב-RPMI ללא סרום כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מיליון תאים למילליליטר. עבור כל דגימה, סמן בארות כפולות בלוח של 24 בארות עם התנאים הניסיוניים שייבחנו.במקרה זה, התנאים הם: ללא גירוי, LPS בלבד, A TP בלבד, ו-LPS בתוספת A TP. הוסף מיליליטר אחד של תאים מדוללים לכל באר, והוסף LPS לבארה המתאימה בריכוז סופי של 1 µg/mL. דגור את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% CO2 למשך שעתיים ו-40 דקות. לאחר תקופת דגירה ראשונית זו, הוסף A TP בריכוז סופי של 2 mM לבארי ה-A TP בלבד וה-LPS בתוספת A TP. לאחר מכן, דגור את הפלטות למשך 20 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 °C.עם השלמת הדגירה השנייה, העבירו את התאים מכל באר לשפרועת מיקרו-צנטריפוגה נפרדת ומסומנת מראש בנפח 1.5 milliliter, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 10, 000 RRP M למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן העבירו את supernatant מכל שפרועת לתוך שפרועת EOR חדשה ומסומנת מראש. ניתן לבחון את ה-supernatant לנוכחות ציטוקינים באופן מיידי, או להקפיאו לצורך הערכת ריכוזי IL one beta או ציטוקינים אחרים. בדגימות אלו, השתמשנו ב-bio plex pro, human cytokine X plex עם מערכת Bio Plex 200.בהתאם להוראות היצרן. בניתוח דמות זו של ייצור IL one beta בעקבות גרייה של תאי דם מלאים נורמליים באמצעות L-P-S-A-T-P או שני הגורים יחד, נראה מענה ל-LPS פלוס A TP, שגודלו תלוי במספר התאים המגורים. בניגוד לבקרה בריאה, בדיקות דם מלאים ממטופלים עם פתולוגיות אוטואינפלמטוריות חושפות ייצור מוגבר של IL one beta בעקבות גריית LPS בהיעדר a TP שהוסף באופן אקסוגני. אין לשכוח שעבודה עם נוזלי גוף אנושיים כגון דם עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות אוניברסליים בעת ביצוע הליך זה.

accurate-simple-measurement-pro-inflammatory-cytokine-il-1-using

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים את הכימות של מתווכי דלקת במהלך זיהום על ידי דגירה של תאי חיסון אנושיים שמקורם ברקמת ריאה אנושית עם המופילוס אינפלואנזה. ציטומטריית זרימה משמשת למדידת פלואורסצנטיות של ציטוקינים בלימפוציטים מסומנים, בקורלציה עם ייצור ציטוקינים מעודדי דלקת בתגובה לזיהום חיידקי.

כימות מתווכי דלקת בתאים נגועים ברקמה אנושית

סרטון זה מדגים את כימות רמות המתווך החיסוני בתמצית נוזל רירית האף האנושית בילוד. מערכת בדיקת מולטיפלקס מבוססת אלקטרוכימילומינסנציה מודדת מתווכים אלה על ידי הערכת עוצמת האור הנפלט כאשר הם מעוררים.

כימות רמות המתווך החיסוני בנוזל רירית האדם

תאים דנדריטים (DC) להפריש IL-1β בתגובה להכרה TLR8 של פורין הסינתטי, R848, ואחרי הפעלת inflammasome NLRP3 עם nigericin, ולכן, IL-1β יכולים לשמש למדידת פעילות inflammasome NLRP3. צביעה תאית ציטוקינים, immunoblotting, וELISA משמשים למדידת inflammasome NLRP3 תחול והפעלה באמצעות ביטוי IL-1β במדויק.

הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

ניתוח של הסרט מדמיע ציטוקינים מסייעת בלימוד עינית מחלות שונות. מבחני מולטיפלקס חרוז מבוסס הינם פשוטים רגיש ולאפשר בדיקה של מטרות מרובות בדגימות עם כמויות קטנות. כאן נתאר עבור מדמיע הסרט ציטוקין פרופיל של משתמש פרוטוקול חרוז מבוסס מולטיפלקס וזמינותו.

חרוז מבוסס Assay מולטיפלקס לניתוח של פרופילים ציטוקין דמעה

פרוטוקול זה מתאר כימות של מטרות ציטוקין מרובות בו-זמנית בתרביות רקמה supernatants שנאסף splenocytes העכבר מגורה באמצעות פלטפורמה המבוססת על חומרים חרוז מולטיפלקס cytometer זרימה.

מגה-פלקס ציטוקין פרופיל של העכבר מגורה Splenocytes באמצעות פלטפורמה מבוססת-חרוז Cytometric מתכלה

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לתאר את התפתחות ואימות מולקולה בודדת מערך דיגיטלי אליסה assay, אשר מאפשרת הזיהוי לאולטרה רגישות כל סוגי IFN-α בדגימות אנושי.

פיתוח ובדיקת של מולקולה בודדת העדינה מערך דיגיטלי מקושרים-אנזים Immunosorbent Assay עבור אינטרפרון אנושי-α

כאן נתאר בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד כדי להעריך את החיסון פנוטיפי ו פונקציונלי (ציטוקינים תאיים אינדוקציה) שינויים בדגימות דם היקפיים, נותחו באמצעות cytometry המוני.

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

השימוש בריאגנטים ייחוס לבדיקת שחרור ציטוקינים מאפשר פרופילי בטיחות במבחנה הניתנים לשחזור וסטנדרטיים יותר של נוגדנים חד-שבטיים אימונותרפיים. כאן אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש במבחני שחרור ציטוקינים לצד פאנל ריאגנטים ייחוס כדי לחזות את בטיחותם של כמה נוגדנים חד-שבטיים טיפוליים.

שימוש בריאגנטים ייחוס כדי לאשר את החוסן של מבחני שחרור ציטוקינים לחיזוי בטיחות נוגדנים חד-שבטיים

הפרוטוקול מתאר פלטפורמה מיקרופלואידית מתקדמת למדידה כמותית של דינמיקת הפרשת ציטוקינים של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים בודדים. הפלטפורמה מודדת עד שלושה ציטוקינים במקביל (IL-6, TNFα ו-IL-1β) עבור כל תא בודד המגורה באמצעות ליפופוליסכריד כדוגמה.

גישה מיקרופלואידית לפתרון הפרשת ציטוקינים סימולטנית ורציפה של תאים רב-תפקודיים בודדים 

בדיקות חיסוניות מבוססות דם מלא מספקות כלי קל וחסכוני במשאבים לניתוח חסינות ספציפית לאנטיגן למטרות אבחון ומחקר. מאמר זה מספק פרוטוקול אופטימלי מבוסס דם מלא עם גירוי משותף כפול לניתוח מקיף של חסינות המאכסן לפתוגנים פטרייתיים ונגיפיים, כולל גרסה בנפח נמוך עבור חולים ילדים ובעלי חיים קטנים.

בדיקת דם מלא עם גירוי משותף כפול לניתוח ספציפי לאנטיגן של חסינות המארח לפתוגנים פטרייתיים ונגיפיים

למד מדידת ציטוקינים דלקתיים בדם מלא באמצעות גירוי LPS לזיהוי מחלות אוטואימוניות. שיטה זו מאפשרת הערכה מהירה של רמות IL-1β בנפח דם מוגבל.

מדידה מדויקת ופשוטה 1β-IL Pro-ציטוקין דלקתי באמצעות גירוי Assay Whole Blood

גלה סרטונים נוספים