מדידה מדויקת ופשוטה 1β-IL Pro-ציטוקין דלקתי באמצעות גירוי Assay Whole Blood

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד ציטוקינים פרו-דלקתיים המופקים במבחן גירוי של דם מלא. ראשית, הרכיבים התאיים של דם מלא מבודלים מהפלסמה באמצעות סנטריפוגציה, ותאי הדם הלבנים נספרים באמצעות צביעה ב-aine orange. לאחר מכן, התאים נזרעים ומגורים באמצעות LPS ואחריו TP כדי לעורר ייצור ציטוקינים על ידי תאים הנושאים קולטני זיהוי תבניות מיקרוביאליות; לאחר מכן נאספים על-נוזלי תרבית בנקודות זמן ספציפיות לאחר תחילת הגירוי.

לבסוף, ריכוזי הציטוקינים בתעלילים נמדדים באמצעות בדיקת multiplex בלוחית של 96 בארות. באמצעות שיטה פשוטה זו, ניתן להעריך במהירות וריאציות בריכוזים של ציטוקינים פרו-דלקתיים המופקים על ידי תאים שעברו גירוי מתורמים שונים. שיטה זו שימושית במיוחד לזיהוי מחלה דלקתית המתווכת על ידי I one בחולה המציג ביטויים אנטי-דלקתיים פתולוגיים, במיוחד בנסיבות שבהן נפח הדם שניתן להשיג הוא מוגבל.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות במדידת ריכוזי ציטוקינים הוא שהטכנולוגיה המבוססת על Luminex מאפשרת מדידה סימולטנית של מספר ציטוקינים תוך שימוש בנפח דגימה קטן בלבד. השג דגימות המכילות 10 milliliters או יותר של דם ורידי מאנשים נפגעים, וכן מקבוצות ביקורת בריאות התואמות להם בגיל ובמין. ודא כי הדגימות נאספות במבחנות איסוף דם מסוג vacutainer המכילות sodium heparin, ושלא הוספו EDTA או נוגדי קרישה אחרים, שכן אלו יפריעו לבדיקה. עיבד את הדגימות בהקדם האפשרי לאחר האיסוף. במידת הצורך, ניתן לאחסן את הדגימות עד 24 שעות בטמפרטורת החדר בתנאי תאורה עמומה.

סבב את דגימות הדם בצנטריפוגה ב-3000 RPM למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כאשר הבלם (break) כבוי. לאחר סבב הדגימות, הסר את הפלסמה מהחלק העליון של המבחנות, תוך הקפדה לא להפריע לשכבת ה-buffy coat המכילה תאים חד-גרעיניים. השהה מחדש את ה-buffy coat ואת משקע תאי הדם האדומים שמתחתיו בתוך מצע RPMI ללא סרום בטמפרטורת החדר, כדי לשטוף את התאים באמצעות פיפטור עדין של התערובת.

לאחר מכן, העבירו את התאים ממבחנת האיסוף למבחנה קונית של 50 מיליליטר. השלימו את הנפח ל-50 מיליליטר באמצעות RPMI והפכו בעדינות כל מבחנה כדי לערבב. סבבו את התאים בצנטריפוגה פעם נוספת במהירות של 3000 RPM למשך 10 דקות.

לאחר מכן, שאבו את העל-מיתמר (supernatant), תוך הקפדה לא להפריע למשב התאים. חזרו על שלב שטיפה זה פעמיים עד ארבע פעמים כדי להסיר מזהמים ולסלק ציטוקינים הקשורים לתאים. לאחר שטיפת התאים, השקיפו אותם ב-RPMI ללא סרום לנפח סופי של 20 milliliters. לספירת התאים, העמיסו 20 microliters של תערובת ביחס של 1:1 של הדגימה ו-acridine orange לתוך תא ראייה (vision chamber) חד-פעמי. acridine orange בריכוז סופי של 1 microgram per milliliter יצבע רק תאי דם לבנים בעלי גרעין, מה שיאפשר להבחין ביניהם לבין תאי דם אדומים.

ספור רק את התאים החיוביים ל-D לאחר קבלת ספירת התאים הכוללת. השהה מחדש את הדגימות ב-RPMI ללא סרום כדי להגיע לריכוז סופי של 2 מיליון תאים למילליליטר. עבור כל דגימה, סמן בארות כפולות בלוח של 24 בארות עם התנאים הניסיוניים שייבחנו.

במקרה זה, התנאים הם: ללא גירוי, LPS בלבד, A TP בלבד, ו-LPS בתוספת A TP. הוסף מיליליטר אחד של תאים מדוללים לכל באר, והוסף LPS לבארה המתאימה בריכוז סופי של 1 µg/mL. דגור את הדגימות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם 5% CO2 למשך שעתיים ו-40 דקות. לאחר תקופת דגירה ראשונית זו, הוסף A TP בריכוז סופי של 2 mM לבארי ה-A TP בלבד וה-LPS בתוספת A TP. לאחר מכן, דגור את הפלטות למשך 20 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 °C.

עם השלמת הדגירה השנייה, העבירו את התאים מכל באר לשפרועת מיקרו-צנטריפוגה נפרדת ומסומנת מראש בנפח 1.5 milliliter, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 10, 000 RRP M למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן העבירו את supernatant מכל שפרועת לתוך שפרועת EOR חדשה ומסומנת מראש. ניתן לבחון את ה-supernatant לנוכחות ציטוקינים באופן מיידי, או להקפיאו לצורך הערכת ריכוזי IL one beta או ציטוקינים אחרים. בדגימות אלו, השתמשנו ב-bio plex pro, human cytokine X plex עם מערכת Bio Plex 200.

בהתאם להוראות היצרן. בניתוח דמות זו של ייצור IL one beta בעקבות גרייה של תאי דם מלאים נורמליים באמצעות L-P-S-A-T-P או שני הגורים יחד, נראה מענה ל-LPS פלוס A TP, שגודלו תלוי במספר התאים המגורים. בניגוד לבקרה בריאה, בדיקות דם מלאים ממטופלים עם פתולוגיות אוטואינפלמטוריות חושפות ייצור מוגבר של IL one beta בעקבות גריית LPS בהיעדר a TP שהוסף באופן אקסוגני. אין לשכוח שעבודה עם נוזלי גוף אנושיים כגון דם עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות אוניברסליים בעת ביצוע הליך זה.