נדיפים חיידקית משנית אפיון באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS)
8 ביוני 2011
משני יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS) מאפשרת זיהוי של תרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) ללא צורך המקדים כל המדגם. פרוטוקול זה מספק הוראות לאפיון (בתוך דקות) המהירה של VOCs חיידקי באמצעות SESI-MS.
יינון אלקטרו ריסוס משני, ספקטרומטריית מסה או CS EMS מאפשר ניתוח של נדיפים חיידקיים ללא צורך בדגימה כלשהי. טיפול מקדים. חלל הראש של תרבית החיידקים נעקר על ידי פחמן דו חמצני לתוך תא התגובה cssi. כאשר הנדיפים חוצים את תא התגובה SSI, הם עוברים דרך ענן הריסוס האלקטרו והופכים מיוננים.
לאחר היינון, החומרים הנדיפים נמשכים לתוך ספקטרומטר המסה לצורך ניתוח. עודף גז נשא ונדיפים חיידקיים לא מגיבים מועברים דרך מסנן של 0.22 מיקרון כדי להסיר כל גורם חיידקי כאמצעי הגנה נוסף למכסה המנוע הכימי. בסופו של דבר, פרוטוקול CSI MS זה מציע טביעות אצבע נדיפות חיידקיות תוך דקות.
אנו צופים שניתן יהיה להשתמש בטכנולוגיה זו ביישומים רבים, כולל נשיפה, ניתוח נשימה למחלות זיהומיות, או אפילו ליישם במערכות מזון שבהן נוכל לזהות במהירות פתוגנים שנמצאים על המזון שלנו. ישנם מספר יתרונות עיקריים לטכניקה זו. בשיטות קיימות כמו ניפוי GCMS, MS ו-PT, RM S תחילה, החומרים הנדיפים אינם דורשים שום טיפול מקדים לפני הניתוח.
שנית, ניתן לפצל יונים ספציפיים בתערובת הנדיפה, מה שמקל על זיהוי התרכובות. ושלישית, זה מהיר. זה בדרך כלל לוקח פחות מחמש דקות.
כדי לנתח כל דגימה, בחר את הכלי המתאים לגידול התרבות שלך, בהתחשב בדרישות הגידול של המין, כמו גם באספקה יעילה של חומרים נדיפים לספקטרומטר המסה. בהדגמה זו, בחרנו בקבוקי מדיה סטנדרטיים של 100 מיליליטר. הנדיפים החיידקיים מועברים לספקטרומטר המסה על ידי זרם של גז נשא להרכבת הנשא.
קווי גז מתאימים לבקבוקי התרבות עם מכסי הברגה שיש להם לפחות שתי יציאות פיתוי. הכנס קווי כניסת ויציאת גז דרך יציאות הפיתוי, וחבר את כל היציאות הנוספות לפני גידול הדגימות שלך. לחץ על הכלים וטבול במים כדי לבדוק אם יש נזילות.
דליפות גז הן הגורם העיקרי לתוצאות לא טיפוסיות בצורה של חלש או נעדר. אותות יונים נדיפים גדלים בן לילה. תרביות של אי קולי, K 12, ו-pseudomonas aerogen, PAO אחד ב-LB Lennox מכין שני שכפולים ביולוגיים לכל מין.
הכן תשעה בקבוקי תרבית סטריליים המכילים 50 מיליליטר LB Lennox ובקבוק אחד לא מחוסן שישמש כחיסון ריק כל תרבית לילה לשני בקבוקי דגימה. יצירת שכפולים טכניים, דגירה על התרביות והריק למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. מכיוון שה-CEMS תוכנן במיוחד לדגימת חומרים נדיפים, הגבל את השימוש במוצרי טיפוח אישי ריחניים לפני השימוש הדוק במכשיר.
כסה את כל הכימיקלים הנדיפים במעבדה ושלוט בטיוטות האוויר ככל האפשר במהלך הבדיקה כדי למנוע זיהום של המכשיר שלך וקווי העברת הגז. עם חומרים ביולוגיים ברי קיימא, התקן מסננים בגודל הנקבוביות המתאים בקו הגז המוביל. המסננים לא יפריעו להעברת חומרים נדיפים לתא התגובה של ה-sesi, אך עשויים להשפיע מעט על יעילות העברת האירוסול.
על מנת לוודא שאספקת המתח כבויה ושהמערכת משוחררת מחשמל, בדוק את נוריות החיווי בספק המתח כבויות. ודא שהמתח במולטימטר הוא אפס והארקה את מובילי החשמל. בשלב זה, התקן את תמיסת הריסוס האלקטרו לניתוח.
במצב יונים חיובי, אנו משתמשים בתמיסת ריסוס אלקטרו של 0.1% חומצה פורמית, 5% מתנול ו-94.9% מים על מנת להשיג עוצמת אות ויציבות אופטימלית, הפעל את הגז הנושא פחמן דו חמצני והגדר את קצב הזרימה לשני ליטר לדקה. הפעל לחץ על מאגר הריסוס האלקטרו כדי ליזום את אספקת תמיסת הריסוס האלקטרו לתא התגובה בקצב זרימה של חמישה ננוליטר לשנייה. לאחר מכן, הפעל את אספקת המתח והתאם את המתח ל -2.5 קילו-וולט.
המתח המופעל משפיע על עוצמת יוני האות ועל יציבות חרוט הריסוס האלקטרו למתחי המערכת שלנו בין שניים לחמישה קילו-וולט. ספק את התוצאות הטובות ביותר בתרגיל במצב יונים חיובי זהירות מכיוון שבשלב זה משטחי המתכת של מקור היינון מסוגלים לספק זעזוע מסוכן. כעת הגדר שיטת כוונון לניטור ספקטרום SEMS.
נקה את תיבת הסימון רכישת ערוצים מרובים או MCA. הגדר את זמן הרכישה ל-10 עד 15 דקות והתחל ברכישת נתונים. התבונן בספקטרום של רקע הגז הנשא ובצע התאמות מכווננות עדינות למתח המופעל כדי לקבל כרומטוגרמה של יונים כוללת יציבה וסריקות הניתנות לשחזור.
המשך לאסוף ספקטרום ו-TIC למשך חמש דקות כדי להבטיח שהמכשיר מיוצב עם המכשיר המבוטח. הזן את פרמטרי הרכישה בהתאם לניסוי שלך. הקלט ספקטרום רקע של גז נושא לניסויים עתידיים.
כדי לאסוף ספקטרום ריק. כוון את זרימת הגז המוביל דרך קווי העוקף, ולאחר מכן חבר את הדגימה הריקה כשהשסתומים סגורים לקווי ההעברה של המכשיר. פתח את השסתומים לבקבוק הדגימה וסגור את שסתומי קווי העוקף.
לספקטרום הניתן לשחזור. אפשר למערכת להתאזן למשך 30 שניות ובמהלכן הלחות בתא התגובה מתייצבת. כדי להבטיח שהמערכת תהיה מאוזנת, עקוב אחר ה-TIC, שישתנה במהלך תקופת שיווי המשקל ולאחריה ייצוב.
לאחר שהמערכת מאוזנת, התחל איסוף ספקטרום. לאחר איסוף הספקטרום, הסר את בקבוק הדגימה על ידי פתיחת קווי מעקף הגז המוביל. ואז סוגרים את שסתומי הדגימה.
ולבסוף, הסרת בקבוק הדגימה. שטוף את המערכת עם הגז המוביל למשך שתיים עד ארבע דקות כדי להסיר את הלחות והנדיפים הנספגים מקווי ההעברה ולמנוע מהדגימה להעביר דגימה. אסוף נתוני טביעות אצבע נדיפות עבור כל דגימת חיידקים לסירוגין ואסף ספקטרום ריק נוסף כדי להבטיח חיסור ריק יסודי.
טביעות האצבע הנדיפות של מצב היונים החיובי עבור e coli ו-p aerogen. גדל באופן אירובי ב- LB Lennox במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס נבדלים. הספקטרום הנדיף של אי קולי נשלט על ידי אינדו ביחס מסה למטען של 118, בעוד שהספקטרום של פסאודומונס אירוגן מכיל מגוון גדול יותר של פסגות הניתנות להוספת חלבון.
תוך כדי ניסיון הליך זה, חשוב שתתעד את הפרמטרים האינסטרומנטליים שביצעת אופטימיזציה לניתוח שלך, כגון המתח המופעל, הרכב תמיסת הריסוס האלקטרו וקצב זרימת הגז המוביל. חשוב גם לשמור רשומות של הספקטרום המייצג שלך כדי שתוכל לשחזר את הניתוחים שלך בעתיד. אל תשכח שעבודה עם חיידקי פתוגן ומתח גבוה עלולה להיות מסוכנת ביותר.
לכן, תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון הגבלת הגישה ל-css CMS במהלך הניסוי. אז עכשיו אתה אמור להיות מסוגל להשיג באופן שחזורי ספקטרום CSS, EMS עבור החיידקים הנדיפים במערכת שלך. בהצלחה.
סקירה כללית
ספקטרומטריית מסה באמצעות יינון אלקטרוספריי משני (SESI-MS) מאפשרת זיהוי מהיר של תרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) מתרביות חיידקים ללא טיפול מקדים בדגימה. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לאפיון יעיל של VOCs מחיידקים באמצעות SESI-MS.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ספקטרומטריית מסות
- מיקרוביולוגיה
- תרכובות אורגניות נדיפות
רקע
- SESI-MS היא טכניקה המאפשרת ניתוח של חומרים נדיפים חיידקיים.
- השיטה מבטלת את הצורך בהכנה מוקדמת של הדגימה.
- היא מספקת תוצאות מהירות, בדרך כלל בתוך חמש דקות.
- היישומים כוללים ניתוח נשימה למחלות זיהומיות וזיהוי פתוגנים במערכות מזון.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לאפיון מהיר של VOCs חיידקיים.
- הדגמת היתרונות של SESI-MS על פני שיטות מסורתיות.
- סיוע בזיהוי טביעות אצבע נדיפות של חיידקים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת תרביות חיידקים במצע סטרילי.
- שימוש בפחמן דו-חמצני לדחיקת חומרים נדיפים מהחלל העליון אל תוך תא ה-SESI.
- יינון של חומרים נדיפים בתא התגובה של ה-SESI.
- ניתוח בספקטרומטריית מסות של החומרים הנדיפים המיוננים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של טביעות אצבע נדיפות של חיידקים.
- זמן ניתוח מהיר של פחות מחמש דקות.
- יכולת לפרק יונים ספציפיים לצורך זיהוי קל יותר של תרכובות.
- אמינות והדירות מוכחות של התוצאות.
מסקנות
- SESI-MS היא כלי בעל ערך לניתוח חומרים נדיפים בקטריאליים.
- הטכניקה מציעה יתרונות משמעותיים על פני שיטות קיימות.
- יישומים פוטנציאליים משתרעים לתחומי הבטיחות של מזון ותחומים קליניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מהיר וללא סימון (label-free) של טביעות אצבע נדיפות של חיידקים באמצעות SESI-MS מאפשר אפיון מיקרוביאלי בתפוקה גבוהה ללא טיפול מקדים בדגימות, ובכך מאיץ את שלבי הגילוי והסינון המוקדמים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בזיהוי מיקרוביאלי ומפחיתה סיכונים בתהליכי עבודה תרגומיים (translational workflows) במורד הזרם, על ידי אספקת פרופילים נדיפים חסונים וניתנים לשחזור. שילוב של SESI-MS בצינורות מו"פ משפר את קבלת ההחלטות לגבי תיק הפיתוח, על ידי מתן אפשרות להבחנה כמותית ומהירה בין מיני חיידקים לבין תרביות מעורבות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מהירה של מסלולים מטבוליים מיקרוביאליים באמצעות פרופיל של חומרים נדיפים.
- תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות על ידי הבחנה בין סוגים ומינים של חיידקים על בסיס חתימות נדיפות.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידות כמותיות ושחזירות של חומרים נדיפים.
- משפר את רמת הביטחון בחיזוי לבחירה ומיון של מטרות מיקרוביאליות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק טביעות אצבע נדיפות שעברו תיקוף לצורך סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה.
- מספק תוצאות כמותיות המתאימות לסריקה בתופעת של תרביות מיקרוביאליות.
- מאפשר הערכה מהירה וניתנת להרחבה של השפעות תרכובות על מטבוליזם בקטריאלי.
- תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מערכות מיקרוביאליות מגוונות ללא טיפול מקדים בדגימה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פרופילי סמנים ביולוגיים נדיפים למערכות מיקרוביאליות הרלוונטיות למחלה, במידת הרלוונטיות.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות שמירה על קריאות חסונות של חומרים נדיפים.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי אספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך השוואות בין מחקרים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על בידול טביעות אצבע תנודתיות.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
טביעת אצבע נדיפה באמצעות SESI-MS משתלבת במפגש שבין גילוי מוקדם, סקירה ומחקר תרגומי, ומאפשרת מעבר חלק מבדיקת השערות לוולידציה פרה-קלינית.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות ניתוח מהיר של חומרים נדיפים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הדירות של חומרים נדיפים לצורך הערכת תרכובים ומוכנות של בדיקות.
- אנליטיקה: מספקת ספקטרום מס ברזולוציה גבוהה ובידול סטטיסטי של דגימות חיידקים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רציפות של נתוני סמנים ביולוגיים נדיפים לאורך שלבי הגילוי והשלבים הפרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר לניתוח חומרים נדיפים מיקרוביאליים בתוכניות מו"פ שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בזיהוי מיקרוביאלי.
- ערך תפעולי: מייעל את תהליכי העבודה באמצעות אנליזה של חומרים נדיפים שהיא מהירה, הדירה וניתנת לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בסדרי עדיפויות מותאמי סיכון ובקידום של מטרות ובדיקות מיקרוביאליות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בספקטרומטריית מסות ובטיפול בתרביות מיקרוביאליות.
- נדרשת גישה למכשור ותשתיות אנליטיות של SESI-MS.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של פרמטרים מכשירים ותיעוד נתונים.
- ניתן להתאים למיני חיידקים ומצעי גידול שונים, תוך מתן תשומת לב לבקרת זיהומים.
- נקיטת אמצעי בטיחות למכשיר ובטיחות ביולוגית היא חיונית בשל מתח גבוה וגורמים פתוגניים.
