תרמודינמיקה של קיפול חלבונים ממברנה נמדד על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא למדוד את התרמודינמיקה הקשורה לקיפול של חלבוני ממברנה. זאת מושג תחילה על ידי הרכבת וזיקולות LAR קטנות כדי לספק סביבת קיפול עבור חלבון הממברנה. לאחר בנייתן, הוזיקולות משמשות להכנת דגימות המכילות חלבון וריכוזים משתנים באופן שיטתי של urea.

בשלב הבא, נמדד ספקטרום הפלואורסצנציה של הטריפטופאן בכל דגימה. כדי לאסוף את הנתונים הדרושים להפקת עקומת פתיחה (unfolding curve) של חלבון ממברנה, מתקבלות תוצאות המראות כיצד ניתן לחשב את האנרגיה החופשית של גיבס (Gibbs free energy) של פתיחת חלבון ממברנה על בסיס עקומות פתיחה שהופקו מספקטרומי פלואורסצנציה של טריפטופאן. שלום, שמי ג'ודי קים. אני מרצה בשירות המילואים באוניברסיטה של קליפורניה בסן דייגו.

השיטה שאתם עומדים לצפות בה חושפת תכונה חשובה של חלבוני ממברנה. באופן ספציפי, נראה לכם כיצד למדוד את היציבות של חלבון מקופל ומוחדר לשכבה ליפידית כפולה. שמי דיאנה אוטינגר, ואני סטודנטית לתואר מתקדם במחלקה לכימיה ב-uc, San Diego.

היום נדגים את השיטה הזו על חלבון ממברנה מייצג. עם זאת, טכניקה זו היא כללית וניתן ליישמה על מערכות ביולוגיות אחרות, כגון פפטידים הקשורים לממברנה וחלבונים מסיסים. אז בואו נתחיל.

לפני תחילת פרוטוקול זה, רכשו תמיסה של one two DME oil, SN glycerol, three phosphocholine או DMPC, ליפיד בתוך כלורופורם והעבירו אותה לבקבוקוני זכוכית נקיים. בכמויות של 20 milligram לבקבוקון, הוסיפו שכבה של גז חנקן לכל בקבוקון כדי למנוע חמצון של הליפיד וסגרו את הבקבוקונים. בכל ניסוי נעשה שימוש בבקבוקון בודד המכיל 20 milligrams של ליפיד בכלורופורם.

להכנת תמיסת הוריקולות (vesicles) הריכוזית, התחילו בייבוש תכולת הבקבוקון תחת זרם של גז חנקן למשך שעה אחת, באמצעות ספטום טפלון ומחטים, עד להסרה מלאה של הממס. הוסיפו מיליליטר אחד של באפר פוטסיום פוספט בריכוז 20 millimolar, pH 7.3 לליפידים המיובשים, ובצעו רסוספנזיה במקלח מים למשך כ-30 שניות. העבירו את התוצאה, תמיסה עכורה, לשפופרת פלסטיק של 15 מיליליטר בעלת תחתית קונית באמצעות פיפטה.

הוסף מיליליטר אחד נוסף של באפר פוספאט לבקבוק הזכוכית הריק שהכיל במקור את הליפיד, וחזור על הסוניקציה. הוסף את התוךית שהתקבלה לאותה מבחנה של 15 מיליליטר. חזור על תהליך זה ארבע פעמים בסך הכל כדי להגיע לנפח סופי של ארבעה מיליליטרים ולריכוז ליפידים של חמישה מיליגרם למיליליטר.

הנח את תרחיף וסיקולות הליפידים בתוך אמבט מים חמים ובצע סוניקציה באמצעות מיקרו-טיפ של סוניקטור אולטרסוני למשך שעה אחת במחזור עבודה (duty cycle) של 50%. אמבט המים נועד למנוע מהתמיסה הליפידית להתחמם יתר על המידה ולשמור על טמפרטורת התמיסה הליפידית המימית מעל טמפרטורת המעבר של פאזת השכבה הכפולה במהלך הסוניקציה.

סננו את התמיסה שעברה SONICATION באמצעות מסנן מזרק של 0.22 micron כדי להסיר שאריות מקצה ה-ator, והניחו לתמיסה המסוננת להגיע לשיווי משקל למשך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. כדי להכין את הדגימה לפריסה פלואורסצנטית ראשונית, הכינו תמיסת מלאי של 10 molar urea בבופר פוספט של 20 millimolar ותמיסת בופר מלאי של 20 millimolar פוספט. בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש לקבוע את ריכוז ה-urea באופן ניסיוי על ידי מדידת מקדם השבירה באמצעות רפרקטומטר והשוואה לערכים ידועים.

בשלב הבא, הכינו תמיסת מלאי של חלבון פרוס בריכוז של כ-200 micromolar חלבון ב-8 molar urea ובבופר פוספאט 20 millimolar. בסרטון זה, נעשה שימוש בחלבון הממברנה OPA A כדי להדגים את הפרוטוקול. דגימות למחקרים פלואורסצנטיים מוכנות על ידי שילוב נפחים מתאימים של תמיסת מלאי החלבון, תמיסת מלאי הליפידים, תמיסת מלאי של 10 molar urea ובופר פוספאט ממלאי, כדי להכין דגימות המכילות כ-4 micromolar חלבון, 1 mg/mL ליפידים ו-0 עד 8 molar urea במרווחים של 1 molar, לנפח סופי של 200 µL. דגימות ביקורת (Blank) מוכנות באופן דומה.

עם זאת, ארבעה µL של תמיסת urea בריכוז 8 M מוחלפים במקום החלבון. בקרות אלו נועדו כדי להפחית פיזור ואותי רקע המופיעים בספקטרום הפלואורסצנציה של החלבון. דגרו את דגימות החלבון ואת הבקרות בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים לפחות לפני מדידת ספקטרומי הפלואורסצנציה.

כדי להבטיח קיפול מלא, הפעילו את הפלורימטר שעה אחת לפני המדידות. חלבוני ממברנה מקפלים בדרך כלל לתוך ליפידים סינתטיים רק כאשר הטמפרטורה גבוהה מטמפרטורת מעבר הפאזה של השכבה הכפולה. לכן, במקרה של DMPC, טמפרטורת תומך הדגימה בפלורימטר נקבעת ל-30 degrees Celsius.

הגדירו את ניסוי הפלואורסצנציה בפלואורימטר במצב יציב (steady state) ומדדו את פלואורסצנציית הטריפטופאן של כל דגימה ביחס לבלנק. יש להגדיר את אורך גל העירור ל-290 ננומטר כדי למנוע עירור של שאריות טירוזין, ולאסוף את הפליטה בטווח של 305 עד 500 ננומטר. השתמשו ברוחב פס (band pass) של 3 ננומטר בכניסה ובביציאה.

ניתן לבצע אופטימיזציה למרווח אורך הגל ולזמן האינטגרציה כדי לשפר את יחס אות לרעש. ערכים טיפוסיים למרווח אורך הגל ולזמן האינטגרציה הם 1 nm לצעד ו-0.5 seconds לצעד, בהתאמה. העבר באמצעות פיפט 200 µL מהדגימה לתוך Q Vet מסיליקה מותכת בנפח מיקרו עם קיבולת של 160 µL, והנח את ה-qve בתוך מחזיק ה-qve של המכשיר.

לבסוף, ניתן להתחיל במדידות פלואורסצנציה על ידי טעינת גיליון נתוני XY של ספקטרומי הפלואורסצנציה לתוך תוכנה כגון Igor Pro, MATLAB, Origin או Excel. לצורך הדגמה זו, יעשה שימוש ב-Igor Pro כדי להסיר את הרקע של ה-urea והוסיקולות השומניות, להכפיל את ספקטרום הפלואורסצנציה של דגימת הביקורת (blank) במקדם ה-S, ולהחסיר אותו מספקטרום הפלואורסצנציה הגולמי של תמיסת החלבון והשומן. עבור ריכוז ה-urea המתאים, יש לרשום בטבלה את אורך הגל של הפלואורסצנציה המקסימלית, או lambda max, מתוך הספקטרום המתוקן.

עבור כל ריכוז של urea. ערך טיפוסי עבור חלבון ממברנה פרוס לחלוטין הוא 350 nanometers. בעוד שערכו של חלבון מקפל הוא כ-330 nanometers, תרגמו את אורכי הגל המופיעים בטבלה לשבר של החלבון הפרוס על ידי המרת הטווח של ערכי lambda max לטווח שבין אפס לאחד, תוך התאמת ערך ה-lambda max לשבר של האוכלוסייה הפרוסה.

לאחר מכן, שרטטו את חלק החלבון הלא-מקופל אל מול ריכוז urea. ניתן להתאים את הגרף של חלק החלבון הלא-מקופל F לעומת ריכוז urea‏ C למשוואה המניחה כי החלבון יכול להימצא במצב מקופל או במצב לא-מקופל. המקדם M תואם לקצב השינוי של האנרגיה החופשית ביחס לריכוז הדנטורנט, ו-CM תואם לריכוז ה-urea בנקודת האמצע שבה אוכלוסיית החלבונים המקופלים שווה לאוכלוסיית החלבונים הלא-מקופלים.

R הוא קבוע הגזים, ו-T היא הטמפרטורה, ביחידות קלווין. הליך ההתאמה (fitting) מניב ערכים עבור המקדמים m ו-cm.

מקדמים אלו מוכפלים כדי לקבוע את delta G, האנרגיה החופשית של גיבס (Gibbs free energy) של פריסה (unfolding) בהיעדר urea. עקומת הפריסה המתוארת חושפת את טווח ריכוזי ה-urea הגורמים לשינוי הגדול ביותר ב-lambda max. טווח זה הוא בדרך כלל קטן, ומרבית הפריסה מתרחשת בתוך טווח קטן זה כדי לקבוע במדויק את האנרגיה החופשית של הפריסה.

יש לנתח דגימות נוספות באזור זה כדי לקבל גרף המכיל את מספר נקודות הנתונים הרב הדרוש להתאמה אופטימלית בשיטת הריבועים הפחותים. לדוגמה, אם החלבון נפרש בין 2 ל-4 molar urea, ניתן להכין דגימות בריכוזי urea אלו במרווחים של 0.2 molar כדי לחשוף באופן מדויק יותר את צורתו של אזור חשוב זה בעקומת הפריסה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לכלול דגימת ביקורת (blank) לפחות בכל שלב של 0.5 molar ובכל שלב של 0.2 molar.

האנרגיה החופשית של פריסה שהתקבלה מגרף זה עשויה להיות שונה מעט מזו שהתקבלה בעקומת הפריסה המקורית, אך היא משקפת ערך מדויק יותר כפי שמוצג. להלן ספקטרומי פלואורסצנציה של טריפטופאן עבור חלבון הממברנה המייצג om a המכיל שארית טריפטופאן אחת. ספקטרום פלואורסצנציה גולמי של הביקורת (blank) הופחת מהספקטרומים הפלואורסצנטיים הגולמיים של החלבון כפי שמתואר בפרוטוקול, מה שהוביל לספקטרום המתוקן.

ספקטראי הפלואורסצנציה המתוקנים של טריפטופאן בחלבון ממברנה עבור ריכוזי urea רבים מוצגים כאן על פי השיטות שתוארו. בהדגמה זו, נוצר עקומת פריסה תחת ההנחה שהחלבון הוא או מקופל או פרוס, וכי אין מצב יציב ביניהם. הפרמטר M משקף את כמות הפוליפפטיד שנחשפת לממס בעת הפריסה, בעוד ש-CM הוא ערך חשוב המתאר את הריכוז של חומר הדנטורציה הדרוש להשגת אוכלוסיות שוות של חלבונים מקופלים ופרוסים.

ערכים גבוהים של CM ו-M מעידים על חלבון יציב. אנרגיית החיבור החופשית של גיבס (Gibbs free energy) של פריסה חושבה כ-6.2 kilo calories per mole עבור OPA a בעקביה אחרי נוהל זה. ניתן להשתמש בשיטות פריסה אחרות, כגון חום, pH ודנטורציה כימית אחרת, כדי לספק מידע מקביל על התרמודינמיקה של קיפול חלבונים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד את יציבותו של חלבון בהתבסס על תכונות פלואורסצנציה שונות של המצבים המקופל והפרוס. לחלופין, ניתן להפיק עקומת פריסה באמצעות שיטות אחרות כגון circular dichroism, כל עוד השיטה מדווחת על קונפורמציית החלבון, ללא קשר לכלי האנליטי שתבחרו. שיטת עקומות הפריסה היא ורסטילית וניתן להחילה על מגוון רחב של חלבונים מסיסים וחלבוני ממברנה.