Name: ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של Ex-Vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-CT (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: למד הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של רקמות ביולוגיות ex-vivo באמצעות מיקרו-CT. שיטה זו מאפשרת חקר מבנים פנימיים ללא הרס בדגימות מינרליות ולא מינרליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקרים נערכו ב אירווינג וצ&#39;רנה מוסקוביץ&#39; מרכז ננו Bio-Imaging ננו במכון ויצמן למדע. אנו אסירי תודה אורנה Yeger על עזרתה בעיצוב פועל בפרוטוקול זה.

1. לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חילוץ רקמות אשר יש לבחון, רקמות mineralized ניתן למקם במכשיר הדמיה. כדי תמונה אחת הירך העכבר צריך לבצע את השלבים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של פוסט מורטם רגל מעובר C57/Bl6 18.5 ימים postceutus (E18.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצה הצר של טיפ פוליסטירן פיפטה (2-20 μl) באמצעות שרף אפוקסי או דבק אחר, ולמלא את קצה למאגר עם עובד (PBS או אחר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fit בחוזקה את הרגל לתוך קצה וסוגרים את הקצה השני עם סדין parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו את קצה פיפטה לתוך המחזק מתאים ובצע את פרוטוקול מן הפרק 3. בשביל לדמיין את עצם הירך של העובר רגל עכבר, המכשיר מוגדר 40 ו 200 KV μA. עבור 1000 תמונות ברזולוציה 8μ הקרנה עם הגדלה 4x להיות נרכשת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Non-mineralized רקמות צריך להיות קבוע בתחילה ומוכתמת על מנת להגדיל את הנחתה רנטגן של רקמת עניין באמצעות אחד הפרוטוקולים הזמינים רבים 8,9. עבור לריאות עכברוש דגימות דומה, פרוטוקול הכנה היא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשתלה Orthotopical הלא סרטן ריאות קטנים (NSCLC) NCI-H460 על הריאות עכברוש בעירום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרטן ריאות גושים להתחיל להיות לגילוי 4 שבועות מן ההשתלה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן עכברוש ומיד להחדיר אותו עם תמיסת מלח מעורבב עם הפרין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את זה עם פתרון מדוללת של Microfil (Flowtech), (2 מ"ל של תמיסת התרכובת, 3 מ"ל של diluent ו 0.3 מ"ל של סוכן ריפוי) לתוך החדר השמאלי להכתים את זרימת הסימפונות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את הריאות והלב של החולדה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשתק את המדגם (ראה פרק 2 של הפרוטוקול) על ידי הולם בחוזקה לתוך שפופרת 50 מ"ל מבחן פלסטיק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת אווירה אתנול רווי ידי הצבת על החלק התחתון של הצינור מטלית דיכא באתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק או בורג המחזיק את הצינורית של המכשיר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם הגדרת הפרמטרים הדמיה (פרק 3). עבור הדמיה מלאה של הריאות עכברוש מקור מוגדר 40KV ו 100 μA. כדי להגיע לפתרון 16μ יש לרכוש 2500 הקרנת תמונות בהגדלה של 0.5x. </li></ol></li></ol> 2. לדוגמה immobilization ברזולוציה גבוהה, חשוב להימנע מכל שינוי בעמדה מדגם במהלך המדידה. לשם כך, המדגם הוא קבוע בחוזקה אל הנמען פלסטיק שמתאים לגודלה. פיפטה פוליסטירן טיפים, פלסטיק pipettes פסטר או מחזיקי הפלסטיק שנבנה במיוחד משמשים בהקשר זה. על פי דרישות הניסוי, המדגם ניתן לבדוק באוויר או שקועים פתרונות אתנול או בולם. Immobilization אופיינית והמיקום הסופי של הרגל של העובר העכבר המכשיר מוצג באיור 1. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. המיקום הסופי של הרגל עכבר עובריים במכשיר מיקרו CT. 3. הגדרת פרמטרים הרכישה: רנטגן המתח והזרם, CCD זמן חשיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים בעל, המדגם הוא לשים בשלב סיבוב של המכשיר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה ראשונה רנטגן הוא נלקח עם המתח והזרם לקבוע באופן שרירותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התמונה כהה מדי, צריך להגדיל את מספר הפוטונים הראשונה, כך להגדיל קצת הנוכחית. אם זה לא מספיק, צריך להגדיל קצת את האנרגיה של קרינת רנטגן פוטונים, כלומר מתח על שפופרת רנטגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התמונה היא בהירה מדי, אחד צריך קודם להקטין את המתח, ואז הנוכחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבהירות של התמונה ניתן להגדיל על ידי binning. Binning של 1 לוקח בחשבון את האינטנסיביות של כל פיקסל בתמונה, בעוד binning של 2 לוקח את הסכום של כל מטריצה ​​של 2x2 פיקסלים. התמונה יהיה כ 4 פעמים בהירים יותר במקרה של binning 1, אבל תהיה במחצית החלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הגדרת הבהירות האופטימלית, צריך לייעל את זמן החשיפה של המצלמה כדי פשרה בין הניגוד הטוב בצד אחד משך זמן סביר של הניסוי בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניגוד של תמונות, במיוחד של דגימות קליטת נמוכה, ניתן לשפר באמצעות מסננים, אשר להפחית את השטף פוטון, בעיקר זו של פוטונים אנרגיה נמוכה יותר. </li></ol> 4. לדוגמא מיצוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ההגדלה עובד. בחירות אפשריות הן 0.5x, 4x, 10x, 20x ו 40X. שדה הראיה יורדת עם הגדלת הגדלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל את ההחלטה בתחום אופטימלי של השקפה על ידי קביעת המרחק בין מקור קרני רנטגן לבין מדגם בין המדגם גלאי. הגדלת המרחק מדגם מקור מקטין את שדה הראיה ומגדיל את הרזולוציה. לדוגמה למרחק גלאי יש השפעה הפוכה. </li></ol> שדה שלם כדי לצפות ב-3D ​​צריך להיות נוכחהקרנת תמונה בכל הזוויות. אחד צריך לבדוק זאת על ידי החלפה של מדגם בזוויות שונות ועל ידי הבאת מדגם קרוב ככל האפשר לציר הסיבוב. לשם כך, יש לבצע את השלבים הבאים: <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה ב 0 מעלות, ולאחר מכן לסובב את המדגם ב -20 מעלות. אם עוצמת השמע הרצויה השתנה רוחבית, יש לתקן את מעמדה על ידי למקם מחדש את ציר הסיבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תיקון, המדגם הוא לסובב בזווית אחרת בעמדה תיקן שוב, עד השדה של הריבית בתוך התמונה בכלל זוויות מ -90 עד 90 מעלות. </li></ol> 5. ברזולוציה גבוהה tomogram <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך המדידה, המדגם הוא מסובב בזווית קטנה בכל פעם, כל אחד על התמונה זווית ההקרנה היא נלקחה. המספר הכולל של תמונות היא תמיד פשרה בין הרזולוציה הרצויה מצד אחד הזמן של המדידה ואת גודל הקובץ בצד אחר. כפי שמוצג Fig.2, כל הקרנת כוללת את כל פרוסות במדגם superposed אחת על פני אחרת, ולכן לא ניתן לחשוף את מבנה 3D של המדגם. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. הקרנת תמונות של ריאות של חולדה ב 0 ° (א), 45 ° (ב) ו - ° 90 (ג) זווית הסיבוב. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לאחר לקיחת תמונות הקרנת לפחות בין 90 ו -90 מעלות, אפשר להמשיך מחדש של היקף המדגם. השיקום לוקח בין 10 דקות ו - 2 שעות, תלוי של התוכנה בשימוש של מספר תחזיות. שוב, איכות התמונה הסופית של 3D הוא פשרה בין הרזולוציה הרצויה הזמן אחד לא רוצה לבלות את גודל הקובץ שהתקבל. </li></ol> 6. סולם תמונה וכיול רמת פיקסל (ערך) של התמונה המשוחזרת היא ייחודית עבור התמונה. על מנת להשוות שתי תמונות שונות, סולם עוצמת ייחודי צריך להיות מוטל על כל תמונה. בשביל זה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל טומוגרפיה עם רוח רפאים תקן באמצעות תנאי הניסוי זהה למדגם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל מחדש את התמונה מדגם באמצעות הערכים שהתקבלו הפנטום. קנה המידה הנפוץ ביותר הוא סולם (או CT) Hounsfield. עבור הגדלה 4x הערך הרקע של 15,000 (מים או PBS) הוחלף 0 ואת הערך המרבי של 35,000 עבור העצם הוחלף הערך Hounsfield הסטנדרטי של 3000. ערכים פיקסל אחרים נבעה אינטרפולציה אקסטרפולציה ליניארית או על בסיס גבולות אלה. </li></ol> 7. תמונה עיבוד וניתוח לאחר קבלת תמונות ברזולוציה גבוהה, צריך לחלץ מידע רלוונטי באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. חבילת התוכנה כדי לשמש צריך להיות מתוכנן לעבוד עם קבצים גדולים מאוד (עד 20GB). 8. נציג תוצאות ייצוג של עצם הירך של העכבר C57/Bl6 ביום עובריים 18.5 (E18.5) - ארבעה ימים לאחר תחילת תהליך מינרליזציה מוצג באיור 3. שכבות מינרלים גלויים לעין (לבן), בעוד הרקמות הרכות אינם גלויים כהכנה זה. לקחנו 1000 הקרנת תמונות עם הגדלה ליניארי של 4x. ההחלטה הסופית היא 8 מיקרון. ניתוח זהיר של טיוח נפח שמוצג תמונה 1, עולה כי נפח העצם חלק (החלק היחסי של נפח העצם כי היא נכבשה על ידי רקמת mineralized) הוא 0.18, ואת צפיפות העצם היא 723 מ"ג / ס"מ 3. ערכים אלה מאפשרים לנו להשוות את המבנה הזה עם העצמות בשלבים אחרים של פיתוח. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. ייצוגים שונים של דימוי 3D של עובר הירך העכבר. (חתך) משוכל (א), בסעיף sagital (מדיו, לרוחב) (ב ') תמונה של טיוח נפח (ג) מוצגים. איור 4 מראה תמונה 3D של הריאות של עכברוש עירום נשי (RNU), 12 שבועות, מושתל orthotopically עם סרטן ריאות שאינם קטנים (NSCLC) NCI-H460. 2500 הקרנת תמונות צולמו עם הגדלה של 0.5x ליניארי, הבטחת החלטה סופית של 16 מיקרון. התמונה מראה את כלי הדם Microfil מוכתם (עד קוטר 20 מיקרון). ניתוח התמונה עולה כי 4 שבועות לאחר ההשתלה, גושים סרטניים רבים נוצרים. הם כיסוי חלק משמעותי של נפח ריאות (17%). רוב מכתים הריאה נמצא בפריפריה של גידולים. באופן מובהק, כפי שמוצג 4B תאנה, כלי הדם נמצאים גם כמה בתוך גושים, מכסה, על פי ניתוח ראשוני של 3% כמה נפח שלהם. <img src="/files/ftp_upload/2688/2688fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. תמונת 3D של גושים סרטניים הגדלים חולדההריאות. תמונה של טיוח נפח (א) ו - קטע דרך נפח (B) מוצגים. גושים סרטניים מסומנים בחיצים. סרט 1. טיוח נפח של עצם הירך העכבר באיור 1. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie1.mpg">לחץ כאן כדי לראות את הסרט.</a> סרט 2. טיוח נפח הריאות עכברוש באיור 2. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie2.mpg">לחץ כאן כדי לראות את הסרט.</a> סרט 3. סעיפים Serial דרך הריאות. גושים להופיע באזורים האפורים ביותר של הפרוסות. <a href="/files/ftp_upload/2688/2688movie3.mpeg">לחץ כאן כדי לראות את הסרט.</a>

<ol><li>Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+micro-CT+in+small+animal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of micro-CT in small animal imaging.</a> Methods. 50, 2-13 (2010).</li>
<li>Bauer, J. S., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoporosis+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoporosis imaging.</a> Eur J Radiol. 71, 440-449 (2009).</li>
<li>Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+insight+bone+measurements+by+histomorphometry+and+microCT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT.</a> J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).</li>
<li>Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+human+bone+biopsies%3A+a+quantitative+structural+comparison+of+histological+sections+and+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography.</a> Bone. 23, 59-66 (1998).</li>
<li>Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-Aliased+3D+Cone-Beam+Reconstruction+Of+Low-Contrast+Objects+With+Algebraic+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Medical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods.</a> IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).</li>
<li>Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+single-slice+rebinning+in+cone-beam+spiral+CT%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT.</a> Med Phys. 27, 754-772 (2000).</li>
<li>Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination-weighted+Feldkamp-based+reconstruction+algorithm+for+cone-beam+CT%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT.</a> Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).</li>
<li>Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+scanner+performance+and+considerations+for+vascular+specimen+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Phys%22%5BJournal%5D)">MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging.</a> Med Phys. 31, 305-313 (2004).</li>
<li>Plouraboué, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+high-resolution+vascular+network+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">X-ray high-resolution vascular network imaging.</a> J Microsc. 215, 139-148 (2004).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

C57/Bl6 עכבר ביום עובריים 18.5 (E18.5) הוא ארבעה ימים לאחר תחילת תהליך מינרליזציה. בשלב זה של הפיתוח, עצם את העתיד עשוי שכבות רבות של osteoids mineralized, לראות בבירור באיור 3. בשלב זה, יש להדגיש כי רקמות mineralized ניתן דמיינו ברזולוציה נמוכה יותר עם מכשירים שונים אשר דורשים טיפול מדגם פחות. הפרוטוקול הנוכחי (ואת מכשיר ה-CT מיקרו להשתמש בו) מלבד מתן רזולוציה גבוהה יותר, מציע את הגמישות הגבוהה ביותר עבור המשתמש לבחור את הפרמטרים גיאומטריות הטוב ביותר עבור המדידה. תוצאות באיור 4 מראים כי סרטן הדגמים orthotopic ריאה מן החי, האדם ריאות שאינם קטנים סרטן תאים יכול לגרום גיוס של כלי הדם neovascularization. אנו רואים כי רקמת הריאה לא התרגש, וגם יש לו את צורתו השתנתה במהלך המדידה. המשתמש צריך לנקוט באמצעי זהירות מיוחדים כדי למנוע שינויים כאלה במהלך טומוגרפיה. לקבלת דוגמיות מסוימים, במיוחד ברקמה רכה, יש לבנות מכשירים מחזיק מיוחד לשתק לחלוטין את המדגם במהלך המדידה. למרבה הצער הנוכחות של דליפות גבוהות של חומר ניגוד בסביבה של גידולים מנעו כימות אמין של כלי הדם ההיקפיים. כתוצאה מכך התמונות נגועים על ידי סוכן כמה מכתים במיוחד בקצוות, וזו ללא ספק מתנה בסרטים 2 ו -3. לא יכולנו למנוע את זה לשפוך, אבל מידע שימושי על גושים סרטן, כולל הגודל, הצורה ואת הנוכחות של כלי הדם הפנימית לא נפגעה. אנחנו יכולים להסיק בבירור כי לפחות במחזור הסימפונות אשר נחקרה כאן, אספקת הדם ההיקפיים משתתף זלוף הגידול, עם טפטוף כמה נוכח גם בתוך הגידול.

לרכישת התמונה השתמשנו XCT-400 מיקרו מערכת microfocussed רנטגן טומוגרפית המיוצר על ידי Xradia, קונקורד, ארה&quot;ב. תמונות עובדו ונותחו באמצעות ImageJ (NIH, ארה&quot;ב), Avizo (VSG, צרפת) MicroView (ג&#39;נרל אלקטריק, ארה&quot;ב) חבילות התוכנה. כל תוכנה זמינה ניתוח התמונה יכול לשמש במקום

ברזולוציה גבוהה 3d הדמיה של ex-vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-ct

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-הרסני להדמיה נפח יכולה להיות מושגת רק על ידי טכניקות טומוגרפית, מתוכם היעילה ביותר היא טומוגרפיה רנטגן מיקרו ממוחשב (μCT). רזולוציה גבוהה μCT הוא מאוד תכליתי עדיין מדויק (1-2 מיקרון של רזולוציה) טכניקה לבדיקה 3D של ex-vivo דגימות ביולוגיות 1, 2. בניגוד האלקטרון טומוגרפיה, μCT מאפשר בחינה של עד 4 ס&quot;מ דגימות עבה. טכניקה זו דורשת שעות ספורות בלבד המדידה לעומת שבועות היסטולוגיה. בנוסף, μCT אינו מסתמך על מודלים stereologic 2D, ובכך היא עשויה להשלים ובמקרים מסוימים יכולים אפילו להחליף שיטות היסטולוגית 3, 4, אשר שניהם זמן רב והרסני. מיזוג לדוגמה ומיצוב ב μCT היא פשוטה ואינה דורשת ואקום גבוה או בטמפרטורות נמוכות, דבר שעלול להשפיע לרעה על המבנה. המדגם ממוקם וסובב 180 ° או 360 ° בין מקור רנטגן microfocused וגלאי, הכולל scintillator ומצלמה מדויק CCD, עבור כל זווית תמונה 2D נלקח, ולאחר מכן את עוצמת כולו משוחזר באמצעות אחד של אלגוריתמים שונים הזמינים 5-7. ההחלטה 3D עולה עם ירידה של שלב הרוטציה. פרוטוקול וידאו הנוכחית מציגה את הפעולות העיקריות immobilization הכנה, ואת המיקום של המדגם ואחריו הדמיה ברזולוציה גבוהה.

Non-הרסני להדמיה נפח יכולה להיות מושגת רק על ידי טכניקות טומוגרפית, מתוכם היעילה ביותר היא טומוגרפיה רנטגן מיקרו ממוחשבת (CT).

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של Ex-Vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-CT

ניתן להשיג ויזואליזציה של נפח שאינה הרסנית רק באמצעות טכניקות טומוגרפיות, שהיעילה שבהן היא מיקרו-CT (מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת) של קרני רנטגן...

המטרה הכללית של הליך זה היא ביצוע מיקרו-טומוגרפיה של קרני רנטגן בתלת-ממד (3D x-ray micro tomography) של רקמות ממינרליות ובלתי ממינרליות. זאת מושג תחילה על ידי הפקת הדגימות לבדיקה, ולאחר מכן קיבוע ומיקום של הדגימות במכשיר ה-micro CT. השלב השלישי של ההליך הוא קביעת פרמטרי הרכישה עבור כל דגימה ואיסוף התמונות.בסופו של דבר, מתקבלת תמונה תלת-ממדית של הדגימה ברזולוציה גבוהה באמצעות CT בקרני X. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מתודולוגיות קיימות, כגון MRI, אולטרסאונד או מיקרוסקופיה אלקטרונית, הוא שהיא מספקת מידע על נפחי קרציות ברזולוציה של מיקרון אחד. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי רקמות ביולוגיות רבות. ניתן להשתמש בה גם באלקטרוניקה, במדעי החומרים ובארכאולוגיה.ההכנה שונה עבור רקמה ממינרלית ורקמה שאינה ממינרלית. יש לאטום רקמות ממינרליות במכלים עם התאמה הדוקה, כדי שמיקום הדגימה לא ישתנה. בעת ביצוע מדידות ברזולוציה גבוהה, צורת המכל תשתנה בהתאם למורפולוגיה של הרקמה.לדוגמה, עצם ירך של עכבר שהוצאה מעובר בן 18.5 D יכולה להיכנס לתוך טיפ של פיפטה. התחילו באיטום של הקצה הצר של טיפ פיפטה מפוליסטירן באמצעות דבק כמו שרף אפוקסי. לאחר מכן, מלאו את הטיפ בבופר עבודה.במקרה זה, התאם כעת את ה-PBS לרגל עם הפמור החשופה בתוך קצה הפ pipette והנח את קצה הפ pipette במחזיק מתאים ואטום את הקצה השני באמצעות יריעת para film; הקרב את בעל החיים ובצע פרפוזיה כפי שמתואר בכתב היד המצורף. לאחר מכן, הוצא את הריאות והלב הצבועים והעבר אותם למבחנה מוכנה של 50 milliliter. הנח את האיברים על פיסת נייר יבשה.הנח את הדגימות בתוך מבחנות המדידה הסופיות, כאשר בתחתית המבחנה נמצאת בד לחה באתנול. כדי ליצור סביבה רוויה באתנול, על הדגימה להיות מותאמת באופן הדוק למבחנה. אם הדגימה רופפת, הדק אותה באמצעות חוט וקבע אותה קרוב לתחתית המבחנה, ממש מעל הבד.בשלב הבא, הדביקו או הצמידו באמצעות בורג את המבחנה למחזיק של המכשיר והמשיכו בהגדרת פרמטרי רכישת התמונה. התחילו בהנחת מחזיק הדגימה במבמה המסתובבת של המכשיר.לאחר מכן, השתמש בערכי מתח וזרם שנבחרו באופן שרירותי כדי לצלם תמונת רנטגן. אם התמונה כהה מדי, בצע שינויים על ידי הגדלה הדרגתית של מספר הפוטונים.פעולה זו מבוצעת על ידי העלאה הדרגתית של הזרם. אם התמונה לא הפכה לבהירה יותר לאחר העלאת הזרם ל-200 microamps, יש להעלות בהדרגה ובמנות קטנות את האנרגיה של פוטוני ה-x-ray על ידי העלאת המתח. אם התמונה בהירה מדי, יש להפחית תחילה את המתח, ולאחר מכן להפחית את הזרם עד שהתמונה תהיה מספקת.ניתן להשתמש ב-Binning גם כדי להגביר את בהירות התמונה על חשבון הרזולוציה. ערך binning של שתיים יהפוך את התמונה לבהירה פי ארבעה בערך, אך במחצית מהרזולוציה. לאחר קביעת הבהירות האופטימלית, יש לבצע אופטימיזציה של זמן החשיפה של המצלמה כדי להשיג פשרה בין הניגודיות המיטבית שניתן להשיג לבין משך ניסוי סביר.ניתן לשפר את ניגודיות התמונה, במיוחד עבור דגימות בעלות בליעה גבוהה, באמצעות שימוש במסננים להפחתת שטף הפוטונים באנרגיה נמוכה. כעת, בחרו הגדלה עבודה בין 0.5 x ל-40 x והתאימו את שדה הראייה כך שיקיף את כל הדגימה תוך מקסום הרזולוציה. כדי להגביר את הרזולוציה, מקמו את מקור קרני ה-x קרוב יותר לדגימה.כדי להגדיל את שדה הראייה, מקמו את הגלאי קרוב יותר לדגימה. עבור דימוי בתלת-ממד, הדגימה חייבת להיכנס לשדה הראייה בכל זווית סיבוב, ולכן ציר הסיבוב חייב להיות ממורכז. התחילו בסיבוב הדגימה למינוס 20 מעלות.אם הנפח הרצוי זז הצידה, יש למקם מחדש את ציר הסיבוב. המשיכו בצילום תמונות בזוויות סיבוב נוספות והמשיכו בביצוע תיקונים עד שהדגימה תהיה גלויה לחלוטין מזווית של 90- מעלות עד 90+ מעלות, ולאחר מכן המשיכו במדידה בכל הזוויות שבין 90- ל-90 מעלות. הרצת תוכנית דימות עשויה להימשך זמן רב, לכן תכננו זאת בהתאם.לדוגמה, כדי להדגים עצם ירך בהגדלה של Forex וברזולוציה של 8 מיקרון, נדרשות 1000 תמונות היטל. פעולה זו אורכת שלוש שעות בלבד. עם זאת, איסוף 2,500 תמונות ההיטל הדרושות להדמיית ריאות של חולדה בהגדלה של 0.5x ורזולוציה של 16 מיקרון אורך 10 שעות.עבור השוואת תמונות עתידית, יש לכייל את התמונה על ידי צילום פנטום סטנדרטי העשוי מחומרים סינתטיים בעלי בליעת קרני רנטגן הדומה לזו של עצם ומים, תחת אותם תנאי ניסוי. באשר לדגימה, לאחר הקלטת כל תמונות ההיטל, משחזרים את הנפח המלא. כדי לכייל את התמונה המשוחזרת לערכים של הפנטום, השתמש בסולם Hounsfield או בסולם CT.לדוגמה, בהגדלה של Forex, הערך הדמוי-מים בפנטום נקבע לאפס והערך הדמוי-עצם נקבע ל-3000 מתוך טווח זה. כל שאר הערכים עוברים אינטרפולציה או אקסטרפולציה. כעת ניתן לנתח את התמונות באמצעות כל חבילת תוכנה התומכת בקבצים בנפח 20 ג'יגה-בייט, כגון תוכנות החינם image J או Fiji.רינדור נפח זה מציג את הירך של עכבר ארבעה ימים לאחר תחילת מינרליזציית העצם; החלק המינרלי חושב כ-18% וניתן להשוות את צפיפות המינרלים בעצם לעצמות בשלבי התפתחות אחרים. רינדור נפח טומוגרפי זה של ריאות מנקבת נקבה בת 12 שבועות ברזולוציה של 16 מיקרון. צביעה ריאתית משמשת לחשיפת כלי דם בקוטר 20 מיקרון.בניתוח של חתכים סדרתיים מאותן ריאות, ניתן לראות מודולי סרטן מרובים כצורות אפורות מוצקות בתוך ארבעה שבועות מהשתלת תאי הגידול. בריאות אלו, המודולים גדלו עד שכיסו 17% של נפח הריאות.רוב הצביעה הריאתית נמצאה באזורים ההיקפיים של הגידולים. כלי דם נמצאים אף הם בתוך הפסולות, ומכסים כ-3% מהנפח שלהן. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצע את מיקום הדגימות ב-15 עד 20 דקות אם הפעולה מבוצעת כראוי.זמן הדימות, הכולל שחזור נפחי אוטומטי שבדרך כלל אינו דורש נוכחות של מפעיל, תלוי בדגימה ועשוי להימשך עד 50 שעות. זכרו כי עבודה עם חומרי קיבוע וצביעה עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש להשתמש תמיד בכפפות מעבדה ולהימנע משאיפת אדים מהדגימות.

high-resolution-3d-imaging-of-ex-vivo-biological-samples-by-micro-ct

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

ניגודיות משופרת כלי שיט קטן בעל חיים הדמיה על ידי microCT היא מהירה, חסכונית תפוקה גבוהה טכניקה...

כלי משופר ניגודיות הדמיה באמצעות MicroCT

אנו מתארים פרוטוקול מפורט המשתמש במיקרוסקופיה אפיסקופית ברזולוציה גבוהה כדי לרכוש תמונות תלת מימדיות (תלת מימד) של עוברי עכברים. פרוטוקול משופר זה משתמש בשיטת הכנת רקמות שונה כדי לשפר את חדירת הצבע הפלואורסצנטי, ובכך מאפשר ניתוח מורפומטרי של דגימות קטנות וגדולות כאחד.

ראפיד רכישת תמונות 3D באמצעות ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית episcopic

אנו מספקים פרוטוקולים פשוטים וחזקים לעיבוד חומר ביופסיה של מינים שונים, עוברים של אורגניזמים מודל ביו-רפואי ודגימות של רקמות אורגניות אחרות על מנת לאפשר דיגיטלי נפח נתונים הדור עם ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופית האפיסקופיים שיטה.

מיקרוסקופיה אפיסקופית ברזולוציה גבוהה (HREM) - פרוטוקולים פשוטים ורב-עוצמה לעיבוד והדמיה של חומרים אורגניים

אנחנו פיתח פרוטוקולים ועוצב מנגנון מותאם אישית כדי לאפשר הטבעה של מילימטר-סולם דגימות. אנו מציגים מדגם הכנת נהלים תוך שימת דגש על הטמעת שרף אקרילי, פוליאימיד אבובים להשיג הנייח נוקשה, אחסון לטווח ארוך של דגימות לחקירה הרקמה תא ואדריכלות מורפולוגיה של...

נוקשה ההטמעה של קבוע, צבעונית, ככלל, דגימות מילימטר-סולם עבור היסטולוגיה ללא סעיף תלת-ממד על-ידי מיקרו-שחושב טומוגרפיה

פרוטוקול להדמיה תלת-ממדית של מבני רקמה מיקרוסקופיים באמצעות שיטה מכתימת רנטגן ספציפית המיועדת לטומוגרפיה ממוחשבת של X-ray מוצגת.

3D הדמיה של דוגמאות רקמה רכה באמצעות רנטגן ספציפי שיטה מכתים וטומוגרפיה ממוחשבת Nanoscopic

פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

אנו מתארים את הכנת רצועות של מקטעים טוריים ואת האוסף שלהם על תמיכה בהעברה גדולה לשימוש כדגימות טומוגרפיה של מערך, יחד עם הליכי הדמיה אוטומטיים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. הפרוטוקול מאפשר סינון, אחזור והדמיה ממוקדת של אירועים מקומיים ונדירים ורכישת אמצעי אחסון גדולים של נתונים.

זרימת עבודה טומוגרפיה של מערך לרכישה ממוקדת של מידע אודות אמצעי אחסון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

כאן, אנו מציגים צינור לכרסם קרן יונים ממוקדת מתאם תלת-ממדי על הנחיית הכנת דגימות תאיות לטומוגרפיה קריו-אלקטרונית. המיקום התלת-ממדי של חלבונים בעלי תיוג פלואורסצנטי נקבע תחילה על ידי מיקרוסקופ קריו-פלואורסצנטי, ולאחר מכן מיועד לכרסום. הפרוטוקול מתאים לתאי יונקים, שמרים וחיידקים.

הכנת הדגימה על ידי כרסום קרן יונים ממוקדת תלת-ממדית לטומוגרפיית קריו-אלקטרונים ברזולוציה גבוהה

פרוטוקול פשוט ומקיף לרכישת פרטים תלת מימדיים של אתרי מגע ממברנה בין אברונים בהפטוציטים מהכבד או תאים ברקמות אחרות.

אפיון תלת מימדי של אתרי מגע בין-אורגניים בהפטוציטים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חתך טורי

טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.

הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

למד הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של רקמות ביולוגיות ex-vivo באמצעות מיקרו-CT. שיטה זו מאפשרת חקר מבנים פנימיים ללא הרס בדגימות מינרליות ולא מינרליות.

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של Ex-Vivo דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרו-CT

גלה סרטונים נוספים