PGS אלסטומרי פיגומים להנדסת רקמות העורקים
8 באפריל 2011
PGS אלסטומרי פיגומים עם כלי הדם לתאי שריר חלק בתרבית bioreactor זרימה pulsatile עלול להוביל בקוטר קטן בונה מבטיח עורקי עם ייצור ECM יליד בתקופה התרבות קצר יחסית.
סרטון זה מראה כיצד לייצר פיגומים צינוריים נקבוביים ולהכפיף אותם למיזוג מכני דינמי להנדסת רקמות עורקים. זה מושג על ידי ייצור הפיגומים תחילה באמצעות אלסטומר מתכלה ושיטת היתוך תקיפה. לאחר מכן מכינים את הפיגומים לזריעת תאים ומורכבים למערכת ביו-ריאקטור.
בביו-ריאקטור תאי שריר חלק בכלי הדם זורעים את הפיגומים ומתורבתים. שבועות לאחר מכן, הרקמה נקצרת ומנותחת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, צביעת h ו-e ואוטופלואורסצנטיות אלסטין. השריר החלק המתקבל הוא רב שכבתי ומכוון בניצב.
היתרון העיקרי של טכניקה זו, הקיימת כמו הלבנת חלקיקים, הוא השימוש בתבנית הזכוכית כדי לייצר אותה פיגום צינורי נקבובי וחומצה היאלורונית. כאשר תבנית מוחקת, תבנית הפיגומים מוכנה מחתיכת צינור זכוכית. הכניסו את הצינור למחזיק ושפכו תמיסת חומצה היאלורונית שהוכנה יום קודם לתוך הצינור.
החומצה ההיאלורונית זורמת לאט לאורך הדופן הפנימית. כשהוא מגיע לתחתית התבנית, הופכים את התבנית. חזור על שלב זה עד שהקיר הפנימי של התבנית מצופה באופן שווה בתמיסה.
לאחר הציפוי יש לייבש את כל תבניות הזכוכית המוכנות בתנור ואקום בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. בדרך כלל, מכינים ארבע תבניות במקביל בזמן שתבניות הזכוכית מתייבשות. הכן את חלקיקי המלח יוצקים, טוחנים וחלקיקי מלח SVE ל -25 עד 32 מיקרומטר.
למחרת, הרכיבו את שדרת תבנית הזכוכית המוכנה, צינורות PTFE, שרוול מתכווץ בחום וטבעת PTFE. ראשית, טען את השדרה באורכים של 65 מילימטר של צינורות PTFE ואפה אותם בחום של 120 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. כדי לכווץ את ה-PTFE בזמן ההמתנה לפני המלחמה, חממת הכלאה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
לאחר שהצינור עטף את השדרות, דחוף את שרוול כיווץ החום על השדרה כך שהוא ינוע בחופשיות. לאחר מכן הניחו את השדרה בתוך תבנית הזכוכית והצמידו את טבעת A-P-T-F-E לתחתית השדרה. בדוק שטבעת ה-PTFE מתאימה היטב לתחתית תבנית הזכוכית.
לאחר מכן, בעזרת מרית ומשפך גומי סיליקון, הוסיפו דייסות חלקיקי מלח לתבנית הזכוכית. לאחר מכן הקש על התבנית בעדינות בעזרת המרית לפיזור חלקיקים אחיד וגרד את עודפי המלח. כעת כבו את החממה המחוממת וטענו אותה במהירות עם התבניות הארוזות במלח, המלח יתמזג במהלך 30 הדקות הבאות, ולאחר מכן יבש את התבניות בתנור ואקום בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
למחרת לאחר הקירור, הסר את ציר הנירוסטה מהתבניות על ידי דחיפתו החוצה תוך אבטחת טבעת ה-PTFE. במידת הצורך, השתמש בצבת אף מחט. לאחר מכן הסר את טבעת ה-PTFE מתחתית התבנית.
לאחר מכן, אופים את התבניות כדי לכווץ את השרוול ולהסיר את השרוולים המכווצים מהתבניות. הניחו לתבניות להתקרר עד לשימוש ואחסנו אותן בחומר ייבוש במכסה המנוע. באמצעות טפטפת apo זווית את תבניות הזכוכית ב-45 מעלות וזרקה תמיסת PGS לתוך הלומן הפנימי שלהן תוך סיבוב איטי של התבנית.
בדוק אם תמיסת ה-PGS זורמת מטה לאורך דופן התבנית. אם יש נקודה יבשה, הוסף עוד PGS עכשיו אפשר ל-THF להתאדות במכסה המנוע למשך 30 דקות לפחות. לאחר שה-THF נעלם, רפאו את התבניות בתנור ואקום.
לאחר ריפוי של יום אחד, מצננים את התבניות לטמפרטורת החדר וטובלים אותן לאט ואנכית במים נטולי יונים בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס. הטיה מהירה מדי יוצרת בועות אוויר, שקורעות את הפיגום. העבירו בזהירות את התבניות לאמבט המים.
מקמו אותם בזווית באמצעות צינור סיליקון, והניחו לחומצה ההיאלורונית להתמוסס במשך שעה. אם לאחר שעה החומצה ההיאלורונית לא השתחררה מהתבנית, אז כשהתבנית עדיין שקועה, השתמשו במרית כדי לדחוף לאט את החומצה ההיאלורונית משני הקצוות, ולאחר מכן נערו לאט את התבנית. כעת, בדקו שהפיגומים לא זזו בתוך תבנית הזכוכית, ואם כן, משכו את הפיגום לאט בעזרת מלקחיים כדי לשחרר אותו מהתבנית.
לאחר מכן, שטפו את חלקיקי המלח על ידי העברת הפיגומים העדינים בזהירות לאמבט מים נטול יונים תוך ערבוב עדין. זה ייקח לפחות שלושה ימים ודורש החלפת מים מדי יום לאחר שכל המלח נשטף החוצה, העבירו כל פיגום לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר מלא במים נטולי יונים והקפיאו אותם בקופסת קרח יבשה למשך שעה. הכניסו את צינורות הצנטריפוגה הקפואים לתוך ליופילייזר למשך שלושה ימים כשהפקקים פתוחים.
לאחר ייבוש בהקפאה, אחסן את הפיגומים בחומר ייבוש עד לשימוש. התחל בחיתוך הפיגומים באורכים של 25 עד 30 מילימטר. לאחר מכן, הכינו שני פקקי גומי סיליקון על ידי הזנת צינורות PTFE דרך החורים האמצעיים של כל פקק.
לאחר מכן חותכים אורכי מילימטר וחצי של טבעת hs ומחליקים אורך על קצה אחד של הפיגום. דחוף צינור PTFE אחד המחובר לפקק לאותו קצה של הפיגום עם חפיפה מספיקה כדי להיות מתחת לטבעת ה-HS כדי לחבר היטב את הפיגום לצינור, לכווץ את טבעת ה-HS בתנור ולאפשר למכלול להתקרר לטמפרטורת החדר. כעת, צינור פוליקרבונט בגודל 50 מילימטר, המתפקד כתא הביוריאקטור מחליק מעל הפיגום ומאובטח במשטח הפנימי של פקק גומי הסיליקון.
בדיוק כמו קודם, צינור PTFE ופקק נוספים מאובטחים בקצה השני של הפיגום עם טבעת hs להשלמת החדר. הפקק השני מחובר לקצה השני של צינור הפוליקרבונט. לאחר מכן, המשטחים החיצוניים של הפקקים מחוברים לשתי לוחות סגסוגת אלומיניום.
הזינו שני מוטות הברגה לתוך החור הצדדי בכל צלחת ואבטחו את הצלחות באמצעות ברגי אגודל. חבר פיגום לביו-ריאקטור. כעת מדוד את האורך הנראה של כל פיגום, שהוא המרחק בין שתי טבעות hs, וחשב את שטחי הפנים הפנימיים שלהן.
לזריעת תאים. בחיטוי, יש לעקר את התאים שכל אחד מהם עטוף בנפרד בנייר כסף יחד עם כל חלק ביחידת הביוריאקטור. לאחר העיקור, הרכיבו את הביוריאקטור בתוך מכסה מנוע של תרבית תאים.
טפל מראש ושטוף את הפיגום בסדרה של זלוף באמצעות משאבה פריסטלטית במהירות של מילימטר לדקה במעגל הזרימה. התחל בשטיפה עם 70% אתנול, 50% אתנול ולאחר מכן 25% אתנול למשך שעה כל אחד. עקוב אחר שלוש שטיפות האתנול עם שטיפה של שעתיים PBS.
לבסוף, יש להחדיר את הביוריאקטור במדיום תרבית SMC למשך 24 שעות ולאחר מכן הוא מוכן לזריעת תאים ולניסויים. כעת, בהתאם להוראות בכתב היד המצורף, זרעו את הביוריאקטור עם 2 מיליון תאים לסנטימטר בריבוע ובמהלך 21 הימים הבאים, החליפו את אמצעי הצינורות ובצעו התאמות למהירות המשאבה. בהדרגה, הלחץ במבנה יגדל מכארבעה מילימטר כספית ביום הראשון של התרבית ליותר מ-100 מילימטר כספית לאחר שבועיים בתרבית, לאחר שלושה שבועות בתרבית, קצרו את התאים והכינו אותם לניתוח כמפורט בכתב היד המצורף.
פיגומי PGS צינוריים אלה יוצרו בשיטת היתוך המלח. סריקת מיקרוגרפים אלקטרוניים הראתה שלכל הפיגומים יש עובי דופן הומוגני ולא היו פגמים חלקיים בחתכים שלהם. מאקרו ומיקרו-נקבוביות מפוזרות באופן אקראי נצפו על פני השטח הלומינליים של כל הפיגומים.
לאחר תרבית תאים, SMCs רב-שכבתיים גדלו עם אוריינטציה מאונכת לכיוון הזרימה. יתר על כן, התאים וחלבוני ה-DCM כיסו לחלוטין את הלומן של כל מבני ה-PGS. אוטופלואורסצנציה של אלסטין הראתה גם סיבים אלסטיים מאורגנים היקפיים על פני השטח הלומינליים של המבנה.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין כיצד להכין פיגום צינורי נקבובי, לראות את התאים ופיגום התרבית באמצעות ביו-ריאקטור שתוכנן מראש.
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את ייצורם של רשתות צינוריות נקבובית לצורך הנדסת רקמות עורקים באמצעות אלסטומרים מתכלים. הרשתות תרביות עם תאי שריר חלק כלי דם בתוך ביו-ריאקטור בעל זרימה פולסטילית, מה שמוביל לייצור של מטריצה חוץ תאית טבעית בתקופת תרבות קצרה.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- הנדסת רקמות
- חומרים ביולוגיים
- ביולוגיה של כלי דם
רקע
- רשתות אלסטומריות חיוניות ליצירת מבנים עורקיים בעלי קוטר קטן.
- מיזוג מכני דינמי משפר את התפתחות הרקמות.
- תאי שריר חלק כלי דם ממלאים תפקיד מכריע בשילוב הרשתות.
- ייצור ECM טבעי הוא חיוני להנדסת רקמות תפקודית.
מטרת המחקר
- לייצר ולהתנות רשתות צינוריות נקבובית ליישומי עורקים.
- להעריך את הקיימות והפונקציונליות של תאי שריר חלק כלי דם במבנים מהונדסים.
- להעריך את ייצור ECM טבעי בסביבת ביו-ריאקטור.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ייצור של רשתות באמצעות אלסטומרים מתכלים והמסת חלקיקי מלח.
- מיזוג מכני דינמי בביו-ריאקטור בעל זרימה פולסטילית.
- זריעת תאים עם תאי שריר חלק כלי דם.
- ניתוח של רקמות שנקטפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק וצביעה היסטולוגית.
תוצאות עיקריות
- הופקו בהצלחה רקמות שריר חלק מרובדות ומכוונות.
- הוכחה אינטגרציה יעילה של תאים בתוך הרשתות.
- הופקו רשתות עם מאפיינים משמעותיים של ECM טבעי.
- הוקמה שיטה אמינה ליצירת מבנים עורקיים בעלי קוטר קטן.
מסקנות
- המחקר מציג גישה מבטיחה להנדסת רקמות עורקיות.
- מיזוג דינמי משפר משמעותית את התפתחות הרקמות.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול תרגום קליני עבור גרפטים כלי דם.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Elastomeric scaffold technologies address critical limitations in small-diameter arterial graft development by improving compliance and reducing thrombotic risk. This approach supports predictive confidence in preclinical vascular models through enhanced extracellular matrix deposition and cellular alignment under physiological mechanical conditioning. The method enables mechanistic de-risking of arterial tissue constructs prior to lead identification stages in cardiovascular therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular smooth muscle cell responses to elastomeric substrates and dynamic mechanical cues.
- Operational Value: Provides reproducible porous tubular scaffolds with consistent wall thickness for standardized preclinical testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable extracellular matrix outputs including elastin autofluorescence and collagen deposition for assay readiness.
- Operational Value: Supports scalable scaffold fabrication via salt fusion method for multi-well or bioreactor-integrated screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates perfusion-conditioned smooth muscle alignment and multilayered tissue formation relevant to native artery morphology.
- Operational Value: Establishes a bioreactor-compatible workflow for longitudinal assessment of graft maturation and mechanical stability.
Pipeline & Workflow Integration
The scaffold fabrication and conditioning process integrates into early discovery workflows by providing compliant, thromboresistant vascular models for target validation and lead optimization in arterial disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of elastomeric biomaterials on vascular cell phenotype and extracellular matrix production.
- Screening: Enables standardized assessment of scaffold-cell interactions under pulsatile flow conditions for assay reproducibility.
- Analytics: Delivers quantitative readouts including elastin deposition, cell orientation, and scaffold porosity for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-stage scaffold maturation to preclinical continuity through native-like tissue development under mechanical conditioning.
- Enterprise Reuse: Positions the salt fusion and bioreactor conditioning method as a reusable platform for multiple vascular tissue engineering initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in graft performance through compliance-matched elastomeric scaffolds and physiological conditioning.
- Operational Value: Standardized, reproducible scaffold fabrication with tunable porosity and thickness for cross-team consistency.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk via early identification of non-thrombogenic, elastogenic vascular constructs.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of arterial graft candidates based on preclinical extracellular matrix maturation and cellular alignment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial synthesis, scaffold fabrication, and bioreactor operation.
- Depends on vacuum ovens, perfusion systems, and histological analysis infrastructure.
- Necessitates standardization of salt particle size, PGS solution concentration, and conditioning duration across laboratories.
- Involves adaptation considerations for different cell types or vessel diameters beyond baboon smooth muscle cells.
- Practical limitations include multi-day salt leaching and lyophilization steps affecting throughput.
