קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים

מטרת הליך זה היא לקבוע את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות מיני החמצן הפעילים בתאי עצב ראשוניים בקליפת המוח באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות, TMRM ו-H 2D CFD בהתאמה. זה מושג על ידי הכנת מלאי וריכוזי עבודה של TMRM ו-H 2D CFDA. השלב השני הוא לדגור על תאי העצב בקליפת המוח עם TMRM ו-H 2D CFDA בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות במאגר כבישים תאילנדי.

השלב השלישי הוא לדמות את עוצמת הקרינה של TMRM ו-DCF בתאי עצב חיים בקליפת המוח באמצעות פליטת עירור של 5 15 5 17 ננומטר ו-4 88 5 15 ננומטר בהתאמה. השינויים ב-TMR בקרינה ינוטרו בנוכחות ה-FCCP המיטוכונדריאלי, בעוד שהשינויים בקרינה DCF ינוטרו בנוכחות מי חמצן. השלב האחרון בהליך זה הוא איסוף, נורמליזציה וניתוח של נתונים.

בסופו של דבר, התוצאות מתקבלות על ידי שרטוט גרף המציג את הרמות היחסיות של עוצמת הקרינה TMRM ו-DCF לפני ואחרי טיפול ב-FCCP ומי חמצן בהתאמה. שלום, אני ג'ואנה קוסקה. ברוכים הבאים למעבדה שלי באוניברסיטת לויולה בשיקגו.

היום נראה לכם כיצד למדוד את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ומיני חמצן תגובתיים בנוירונים בקליפת המוח של חולדות. ההליך יודגם על ידי dhi. היי, אני דה דניס ג'וסי.

באמצעות הליך זה, ניתן למדוד את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בתווית מיטוכונדריאלית בודדת ומיני חמצן תגובתיים בתווית תא בודד. אז בואו נתחיל. הכן מלאי של 10 מילי-מולרי של TMRM על ידי המסת חמישה מיליגרם של TMRM במיליליטר אחד של מערבולת תחמוצת דימתיל סולף נטולת מים למשך דקה אחת.

לאחר מכן גרום לאליקוטים לאחסן את האליקוטים במינוס 20 מעלות צלזיוס. יש להגן מפני אור ולהשתמש תוך חודש אחד. לאחר מכן, הכינו מלאי של 10 מילי-מולרי של H 2D CFDA על ידי המסת 4.87 מיליגרם של H 2D CFDA במיליליטר אחד של תחמוצת דימתיל סולף נטולת מים.

באופן דומה, מערבולת למשך דקה אחת, ואז הכינו אליקוטים ואחסנו אותם במינוס 20 מעלות צלזיוס. יש להגן מפני אור ולהשתמש תוך שבוע כדי להעמיס תחילה את תאי העצב בקליפת המוח של החולדה. שטפו את הנוירונים המתורבתים שלוש פעמים עם המאגר של טירו.

לאחר מכן הכינו 20 ננו טוחנת TMRM על ידי דילול מלאי TMRM של 10 מילי-מולרי 1000 פעמים בשחפת. לאחר מכן הוסף שני מיקרוליטר של ה- TMRM המדולל לכל מיליליטר שחפת. דגרו על תאי העצב עם TMRM למשך 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.

לאחר 45 דקות, הרכיבו את צלחת התרבית על במת המיקרוסקופ והתחילו לדמות כדי להעמיס את הנוירונים בקליפת המוח של החולדה ב-H 2D CFDA, שטפו את הנוירונים המתורבתים שלוש פעמים בשחפת. לאחר מכן, הכינו שני מיקרוטולר של H 2D CFDA על ידי דילול מלאי H 2D CFDA 10 מילי-מולרי 10 פעמים בשחפת. ואז להוסיף שני מיקרוליטר של H 2D CFDA מדולל לכל מיליליטר שחפת.

לאחר מכן דגרו על הנוירונים עם H 2D CFDA למשך 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר לאחר 45 דקות. שטפו את הנוירונים ארבע פעמים עם שחפת כדי להסיר מחוון פלואורסצנטי עודף לפני קבלת תמונות לביצוע הדמיה חיה של נוירונים שהודגרו במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי TMRM עם יישום של תוכנית סדרת זמן חיה. הפעל רזולוציה נמוכה ועוצמת לייזר מוחלשת כדי למזער את הזמן הדרוש להשגת תמונות וכדי למנוע הלבנת תמונות.

לאחר מכן, התאימו את המיקוד של תאי העצב המותקנים הטעונים ב-TMRM באמצעות אור מוחזר. בחן את הקרינה TMRM על ידי הארה בחמש 14 ננומטר וגילוי בחמישה 70 ננומטר. הגדר את רווח הזיהוי של המצלמה ממש מתחת לרמת הרוויה לאחר הגדרת כל הפרמטרים, הכוללים רזולוציה, זיהוי כוח לייזר, רווח המצלמה ומרווח זמן-lapse לקבלת תמונות.

אל תשנה הגדרות אלה בין ניסויים. לאחר מכן, שנה את השדה. התחל לאסוף תמונות כדי לבדוק שינויים בגירוי דלתא PSY M, כגון ניתן ליישם מיקרומולר אחד של FCCP או שני מיקרוגרם למיליליטר של אוליגו מיצין, אשר יגרום לדפולריזציה משמעותית או היפרפולריזציה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בהתאמה.

שינויים אלה יבואו לידי ביטוי בירידה בעוצמת הקרינה TMRM בהשוואה לעוצמת הקרינה הבסיסית במקרה של FCCP או עלייה בעוצמת הקרינה TMRM. במקרה של חטא LIGA myin לביצוע הדמיה חיה של נוירונים שהודגרו עם H 2D CFDA הרכיבו תחילה את צלחת התרבית על במת המיקרוסקופ, התאימו את מיקוד התאים באמצעות אור מוחזר. בחן את הקרינה DCF על ידי עירור ב-4 88 ננומטר ופליטה ב-5 15 ננומטר.

לאחר מכן, כוונן את עוצמת הלייזר לחמישה עד 7%זיהוי רווח ורזולוציה של 2 56 על 2 56. אל תשנה הגדרות אלה בין ניסויים. לאחר מכן הגדר את התדירות להשגת תמונות חיות.

באמצעות תוכנית סדרת הזמן, בחר שדה חדש והתחל לרכוש תמונות כדי לזהות שינויים ברמות R os. טפל בתאים עם 100 עד 200 מיקרומולר של מי חמצן. זה יבוא לידי ביטוי בעלייה בעוצמת הקרינה DCF בהשוואה לרמת הבסיס.

השתמש בכלי אזור העניין מתוכנית LSM כדי לבחור את האזורים. לאחר מכן בחר החזר ROI מאזורים מיטוכונדריאלים או ROIs מכל גוף התא בתאי תמונה. למדוד את עוצמות הקרינה של TMRM או ROS בהתאמה.

בחר/י אזורים לצד התאים. כדי לחשב את עוצמת הקרינה ברקע, בצע מספר מדידות וכדי לחשב את עוצמת הרקע הממוצעת, הפחת את עוצמת הקרינה הממוצעת ברקע מעוצמות הקרינה הממוצעת של אזורי עניין בכל תא עבור כל נקודת זמן באמצעות Microsoft Excel. לאחר הפחתת עוצמת הרקע, נרמל את עוצמת הקרינה TMRM או DCF לפלואורסצנטיות הבסיסית.

באמצעות נוסחה זו, השתמש בתוכנית תרשים סיגמא כדי ליצור את התרשים המציג את השינויים בעוצמת הקרינה לאורך זמן. הנה דוגמה לתמונה פלואורסצנטית של תאי עצב בקליפת המוח של חולדות שהודגרו באמצעות TMRM. התוספת של F-C-C-P-A unco מיטוכונדריאלי מובילה לדפולריזציה מיטוכונדריאלית ולאובדן עוצמת הקרינה של TMRM.

רמת הקרינה הבסיסית של TMRM נשארת יציבה לפני הוספת FCCP. ניתוח כמותי של שינויים פלואורסצנטיים ב-TMRM לאורך זמן מראה ירידה משמעותית בפלואורסצנטיות TMRM לאחר הוספת FCCP. הנה דוגמה לתמונה פלואורסצנטית של נוירונים בקליפת המוח של חולדות עמוסים ב-DCF.

רמת הקרינה הבסיסית של DCF נותרה ללא שינוי ב-120 השניות הראשונות לפני יישום מי חמצן. תוספת מי חמצן מביאה לעלייה בעוצמת הקרינה DCF בגופי התאים. מדידות זמן-lapse של פלואורסצנטיות DCF מראות את הרמות היציבות שלה שעלו לאחר טיפולי מי חמצן.

בהליך זה, חשוב לזכור להשתמש בעוצמת לייזר נמוכה ובמהירות סריקה מהירה כדי למנוע מהחפצים הלבנת תמונות ופוטוטוקסיות. שיהיה לך בהצלחה עם הניסוי שלך.