Name: קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: למדו לבצע הדמיית פלואורסצניה חיה של נוירונים קורטיקליים בחולדה כדי למדוד פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי ורמות חמצן ריאקטיבי באמצעות TMRM ו-H2D CFDA. שיטה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של תהליכים תאיים חיוניים במחקר נוירוביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (K22NS050137 כדי JCB).

1. תא תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוירונים בקליפת המוח הם מבודדים גדל תוך שימוש בטכניקות שתוארו קודם לכן, מצופה על מנות תרבות עם תחתית זכוכית (MatTek Corporation, אשלנד, MA) מצופה פולי-D-ליזין laminin 1. </li></ol> 2. הכנת פתרונות מניות עבור בדיקות ניאון TMRM ו-H 2 DCF-DA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 10 מ"מ מניות של TMRM ידי המסת 5.0 מ"ג TMRM ב 1 מ"ל של dimethylsulfoxide נטול מים. זה וורטקס דקות 1. ואז, לעשות aliquots ולאחסן אותם ב -20 ° C, להגן מפני אור, להשתמש בתוך חודש אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להכין פתרון 10 מ"מ מניות של H 2 DCF-DA ידי המסת 4.87 מ"ג של H 2 DCF-DA ב 1 מ"ל של DMSO נטול מים. באופן דומה, זה מערבולת דקות 1. ואז, לעשות aliquots ולאחסן אותם ב -20 ° C, להגן מפני אור, להשתמש בתוך שבוע. </li></ol> 3. עכברוש נוירונים בקליפת המוח Loading עם TMRM ו-H 2 DCF-DA TMRM הוא פוטנציומטרית, התא חדיר חיווי ניאון שמצטבר בפנים הטעונה שלילית של המיטוכונדריה. חשוב להשתמש בריכוזים נמוכים (10-50 טווח ננומטר) של TMRM להימנע אוטומטי של מרווה TMRM המיטוכונדריה. ואז, את האות פלואורסצנציה של TMRM ניתן ישירות שיתוף הקשורים ΔΨm על פני קרום המיטוכונדריה הפנימית. אובדן ΔΨm גורם TMRM לדלוף מן המיטוכונדריה שגורם לאובדן של עוצמת הקרינה. H 2 DCF-DA הוא התא חדיר בדיקה להמרה DCF-DA ידי esterases תאיים, והתוצאות חמצון שלה DCF ניאון. הריכוז הסופי של H 2 DCF-DA נע בין 2-10 מיקרומטר ואת זה צריך להיבדק באופן אמפירי בנוירונים נגזר אזורי מוח שונים מאז ריכוזים טעינה גבוה יכול לגרום הרוויה של DCF הקרינה גם בהעדר של H 2 O 2. הנוכחות של חמצון אנדוגני או אקסוגני כלשהו (למשל, תחמוצת החנקן, חמצן) יגדיל DFC עוצמת הקרינה. להלן, אנו מספקים פרוטוקול לטעינת נוירונים בקליפת המוח עכברוש עם TMRM ו-H 2 DCF-DA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון את הנוירונים עכברוש קליפת המוח עם TMRM, ראשית, לשטוף את נוירונים בתרבית 3 פעמים עם המאגר של Tyrode (שכבת טקסט: שחפת: 145 mM NaCl, 5 מ"מ KCl, 10 גלוקוז מ"מ, 1.5 מ"מ CaCl 2, 1 mM MgCl 2, ו - 10 HEPES מ"מ; להתאים את pH עד 7.4 עם NaOH). לאחר מכן, להכין 20 ננומטר של TMRM על ידי דילול המניה 10 TMRM mM 1 / 1000 פעמים שחפת ולאחר מכן להוסיף 2 μl של TMRM המדולל מ"ל 1 של שחפת. דגירה הנוירונים עם TMRM 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר 45 דקות, הר צלחת התרבות על הבמה של המיקרוסקופ ולהתחיל הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון את החולדה הנוירונים בקליפת המוח עם H 2 DCF-DA, לשטוף את נוירונים בתרבית 3 פעמים עם שחפת. בשלב הבא, להכין 2 מיקרומטר של H 2 DCF-DA על ידי דילול 10 מ"מ H 2 DCF-DA המניה 1 / 10 פעמים שחפת ולאחר מכן להוסיף 2 μl של בדילול H 2 DCF-DA לכל 1 מ"ל של שחפת. ואז, דגירה הנוירונים עם H 2 DCF-DA 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר 45 דקות, לשטוף את הנוירונים 4 פעמים עם שחפת להסיר אינדיקטור ניאון עודף לפני קבלת תמונות. </li></ol> 4. הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם TMRM לקבוע ΔΨm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם TMRM, לייזר confocal מיקרוסקופיית (שכבת טקסט: LSM 510, Carl Zeiss Inc), עם יישום התוכנית בזמן סדרת לחיות, משמש. החל ברזולוציה נמוכה ו נחלש כוח לייזר (שכבת טקסט: רזולוציה נמוכה: 256 x 256; כוח לייזר: 1%) כדי לצמצם את הזמן הדרוש כדי להשיג תמונות ולהימנע photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . בשלב הבא, לכוון את הפוקוס של הנוירונים רכוב עמוסה TMRM באמצעות האור המוחזר. בדוק את הקרינה TMRM על ידי תאורה ב 514 ננומטר וזיהוי ב 570 ננומטר. קבע את הרווח זיהוי של מצלמה מתחת לרמת רוויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל הפרמטרים אשר כוללים רזולוציה, כוח לייזר, להשיג זיהוי של מצלמה, זמן לשגות מרווח כדי להשיג תמונות מוגדרות, אין לשנות הגדרות אלה בין הניסויים. בשלב הבא, לשנות את השדה. התחל באיסוף התמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחון את השינויים ΔΨm, גירויים כגון 1 מיקרומטר של FCCP או 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של oligomycin, יכול להיות מיושם, אשר ישפר משמעותית depolarize או hyperpolarize פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, בהתאמה. שינויים אלה יבואו לידי ביטוי על ידי ירידה בעוצמת הקרינה TMRM לעומת עוצמת הקרינה הבסיס במקרה של FCCP, או עלייה בעוצמת הקרינה TMRM במקרה של oligomycin. </li></ol> 5. הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם H 2 DCF-DA לקבוע ROS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע הדמיה חיה של נוירונים מודגרות עם H 2 DCF-DA, הראשון, הר צלחת התרבות על הבמה של מיקרוסקופ. התאם את המיקוד של התאים לנוing משתקף האור. בדוק DCF הקרינה על ידי עירור ב 488 ננומטר ופליטה ב 515 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להתאים את כוח לייזר 5-7%, עלייה גלאי, ברזולוציה של 256 x 256. אין לשנות הגדרות אלה בין הניסויים. לאחר מכן, קבע את תדר לקבלת תמונות חיות באמצעות תוכנית סדרת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שדה חדש ולהתחיל לרכוש תמונות. כדי לזהות שינויים ברמות ROS, לטפל בתאים עם 100-200 מיקרומטר של H 2 O 2. זה יבוא לידי ביטוי על ידי עלייה בעוצמת הקרינה DCF, לעומת רמת הבסיס. </li></ol> 6. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזור של עניין (שכבת טקסט: ROI) כלי מהתוכנית LSM כדי לבחור את אזורי. לאחר מכן, מודדים את TMRM או ROS עוצמות הקרינה. בחר ROIs מאזורים המיטוכונדריה או ROIs מגוף התא כולו בתאים הדמיה כדי למדוד את עוצמות הקרינה של TMRM או ROS, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את עוצמות הקרינה הממוצעת ROIs כל תא עבור TMRM או מגופים תא שלם עבור כל התאים הדמיה עבור ROS לכל נקודת זמן. בחר באזורים ליד התאים כדי לחשב את עוצמת הקרינה רקע. קח כמה מדידות ולחשב את עוצמת רקע הממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הרקע ממוצע עוצמת הקרינה של עוצמות הקרינה הממוצעת של ROIs בכל תא עבור כל נקודת זמן באמצעות Microsoft Excel. לאחר הפחתת עוצמת רקע, לנרמל את עוצמת TMRM או DCF פלואורסצנטי הקרינה הבסיס באמצעות הנוסחה (שכבת טקסט: ΔF FF = o / F o x 100, שם F = עוצמת הקרינה בכל נקודת זמן, במשך = הבסיס הקרינה). ואז, להשתמש בתוכנית מגרש Sigma כדי ליצור את העלילה מראה את השינויים בעוצמת הקרינה לאורך זמן. </li></ol> 7. נציג תוצאות איור 1 א מציג תמונה הקרינה של נוירונים בקליפת המוח עכברוש מודגרות עם TMRM. הוספת FCCP, uncoupler המיטוכונדריה, מוביל שלילת קוטביות המיטוכונדריה לבין הפסד של עוצמת הקרינה TMRM (איור 1B). הרמה הבסיסית TMRM הקרינה נותר יציב לפני תוספת של FCCP (הראשון 350 שניות;. איור 1C). ניתוח כמותי של שינויים TMRM הקרינה לאורך זמן מראה ירידה משמעותית הקרינה TMRM לאחר תוספת של FCCP (איור 1C). 1D איור מראה את התמונה פלואורסצנציה של נוירונים בקליפת המוח עכברוש עמוסה DCF. תוספת של H 2 O 2 תוצאות מוגברת עוצמת הקרינה DCF בגוף התא (איור 1E). הרמה הבסיסית DCF הקרינה היא ללא שינוי (הראשון 120 שניות) לפני היישום של H 2 O 2. זמן לשגות מדידות של הקרינה DCF להראות רמת סוכר קבועה שלה, להגדיל לאחר הטיפול H 2 O 2 (איור 1F). <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הערכת פוטנציאל קרום המיטוכונדריה ורמות ROS בנוירונים חולדה חיה קליפת המוח. (א) נציג תמונה הקרינה של נוירונים בקליפת המוח עמוסה TMRM. לאחר הסריקה הבסיסית TMRM פלואורסצנטי, הנוירונים טופלו FCCP protonophore (1 מיקרומטר). מימין הוא סרגל עוצמת הקרינה של pseudocolor TMRM עם מקסימום בהיר המייצג צהוב ושחור ואת עוצמת המינימום, בהתאמה. ההפסד של הקרינה TMRM מאזורי המיטוכונדריה מצביע על קריסת ΔΨm על FCCP הטיפול (לוח ב '). ייצוג כמותי של שינוי בעוצמת הקרינה TMRM בנקודות זמן שונות לפני ואחרי הטיפול FCCP מוצגת בלוח ג (ד) תמונה פלואורסצנטי של נוירונים בקליפת המוח עכברוש עמוסה H2DCF-DA. לאחר קביעת הבסיס DCF פלואורסצנטי, בתאים שטופלו 200 מיקרומטר H 2 O 2, והשינוי DCF הקרינה הוערך. גידול הקרינה DCF משקף את העלייה ברמות ROS על טיפול 2 H 2 O (E). ניתוח כמותי של שינוי DCF פלואורסצנטי, לפני ואחרי הטיפול H 2 O 2, מוצג בשורת פאנל סולם פ = 10 מיקרומטר Video.7.1 - labmedia 2704_Joshi.avi הדמיה של תא חי TMRM בתוך הנוירונים בקליפת המוח לפני ואחרי בנוסף FCCP באמצעות המטרה 40X. עוצמת pseudocolor מראה (צהוב בהיר, לפני כן FCCP) המרבי וירידה (צבע אדום, לאחר תוספת FCCP) עוצמת הקרינה לאחר TMRM בנוסף FCCP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">לחץ כאן כדי להציג וידאו</a> וידאו. 7.5 - labmedia 2704_Joshi.avi הדמיה של תא חי DCF בתוך הנוירונים בקליפת המוח לפני ואחרי בנוסף 2 H 2 O באמצעות המטרה 40X. הבסיס DCF הקרינה יש צבע ירוק בהיר בגוף התא H2O2 בנוסף מגדיל את הבירהF עוצמת הקרינה לצבע ירוק בהיר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">לחץ כאן כדי להציג וידאו</a>

<ol><li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li>
<li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+%28AICD%29+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li>
<li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%3A+implication+for+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הצגנו הליך צעד אחר צעד מתאר כיצד לקבוע ΔΨm ו ROS ב נוירונים בקליפת המוח עכברוש באמצעות אינדיקטורים פלורסנט TMRM ו-H 2 DCF-DA, בהתאמה. עבור סוגי תאים אחרים, חשוב לקבוע באופן אמפירי את הריכוז הסופי זמן טעינה עבור TMRM או H 2 DCF-DA. באופן כללי, טווח הריכוזים TMRM 2-20 ננומטר, ואת זמן הדגירה תא עם TMRM משתנה בין 20 ל 60 דקות. הריכוז הסופי של H 2 DCF-DA טווחי 2-10 מיקרומטר, ו הדגירה של תאים בתמיסה המכילה טעינת זה סמן משתנה בין 30-45 דקות. זה חשוב כדי לייעל את כוח לייזר מהירות סריקה של לקיחת התמונות להימנע הן צילום רעילות לתאי שינויים בעוצמת הקרינה (למשל הבהוב של TMRM פלואורסצנטי) בהעדר גירוי כלשהו. ההגדרות אופטי אופטימיזציה צריך להביא אות הקרינה כי הוא לא מעל או מתחת רווי (סף) בהיעדר גירוי. תנאים אופטימליים כדי לאסוף את התמונות משדה שנבחר בהספק לייזר בפרט מהירות סריקה מושגות כאשר אין שינויים בעוצמת הקרינה של החללית בהעדר גירוי כלשהו עבור 10-15 דקות של הדמיה לחיות. בדיקות הקרינה אחרים כדי לקבוע ΔΨm כוללים rhodamine 123 ו טטרה מתיל אתיל אסתר rhodamine (TMRE). עם זאת, הם נמצאו לעכב את תהליכי הנשימה 2 המיטוכונדריה מבודד. חשוב לציין, TMRM אין כל השפעה על הנשימה המיטוכונדריאלי בריכוזים נמוכים 2 ויש לו phototoxicity נמוך photobleaching 3 לעומת בדיקות אחרות. H 2 DCF-DA הוא אינדיקטור טוב עבור ROS כפי שהיא נשמרת גם בתאים ומזהה מינים חמצון שונים, כגון peroxides, תחמוצות סופר, ו תחמוצת החנקן 4.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> תחתית זכוכית תרבות צלחת </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G-1.5-14-C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF-DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> סיגמא </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> סיגמא </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td> סיגמא </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6 שעות 2 O </td><td> סיגמא </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> סיגמא </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

פוטנציאל הממברנה מיטוכונדריאלי (ΔΨm) היא קריטית לשמירה על תפקוד פיזיולוגי של שרשרת הנשימה כדי ליצור ATP. באובדן משמעותי של תאים הופך ΔΨm מדולדל של אנרגיה עם המוות הבאים. מינים חמצן מגיב (ROS) הם מולקולות איתות חשוב, אך הצטברות שלהם במצבים פתולוגיים מוביל סטרס חמצוני. שני המקורות העיקריים של ROS בתאים הם רעלים סביבתיים בתהליך של זרחון חמצוני. תפקוד המיטוכונדריה לבין סטרס חמצוני היו מעורבים בפתופיזיולוגיה של מחלות רבות, ולכן היכולת לקבוע ΔΨm ו ROS יכולים לספק רמזים חשובים על מצב פיזיולוגי של התא ועל תפקידו של המיטוכונדריה. בדיקות ניאון כמה (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) ניתן להשתמש כדי לקבוע Δψm במגוון רחב של סוגי תאים, ואינדיקטורים רבים פלואורסצנטי (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H 2 DCF-DA) ניתן להשתמש כדי לקבוע ROS . כמעט כל בדיקות הקרינה זמין להערכת ΔΨm או ROS הם אחד האינדיקטורים גל, אשר להגדיל או להקטין את עוצמת הקרינה שלהם ביחס לגירוי אשר מגביר או מקטין את רמות ΔΨm או ROS. לכן, זה הכרחי למדוד את עוצמת הקרינה של בדיקות אלה ברמה בסיסית ואחרי היישום של גירוי מסוים. זה מאפשר לקבוע את אחוז השינוי בעוצמת הקרינה בין רמת המחקר ולאחר גירוי. השינוי בעוצמת הקרינה משקף את השינוי ברמות היחסי של ΔΨm או ROS. בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך ליישם את מחוון פלואורסצנטי, TMRM, ב נוירונים בקליפת המוח חולדה כדי לקבוע את אחוז השינוי בעוצמת הקרינה TMRM בין רמת המחקר ולאחר יישום FCCP, uncoupler המיטוכונדריה. רמות נמוכות של פלואורסצנציה TMRM כתוצאה מטיפול FCCP לשקף את שלילת קוטביות של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. כמו כן, אנו מראים כיצד ליישם את הקרינה בדיקה H 2 DCF-DA כדי להעריך את רמת ROS בתוך הנוירונים בקליפת המוח, הראשון בתחילת המחקר ולאחר מכן לאחר היישום של H 2 O 2. פרוטוקול זה (עם שינויים קלים) יכול לשמש גם כדי לקבוע שינויים ΔΨm ו ROS בסוגי תאים שונים בנוירונים מבודד מאזורים אחרים במוח.

אנו מדגימים יישום מחוון פלואורסצנטי, TMRM, ב נוירונים בקליפת המוח כדי לקבוע את השינויים יחסית בעוצמת הקרינה TMRM לפני ואחרי יישום של גירוי מסוים. אנחנו גם מראים יישום בדיקה הקרינה H<sub&gt; 2</sub&gt; DCF-DA להעריך את הרמה היחסית של מינים החמצן מגיב על נוירונים בקליפת המוח.

פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה (&Delta;&Psi;m) הוא קריטי לשמירה על התפקוד הפיזיולוגי של שרשרת הנשימה לצורך ייצור ATP. ...

מטרת פרוצדורה זו היא לקבוע את פוטנציאל ממבנה המיטוכונדריה ואת רמות רדיקלי החמצן בנורונים קורטיקליים ראשוניים, תוך שימוש בח probes הפלואורסצנטיים TMRM ו-H 2D CFD בהתאמה. דבר זה משיג תחילה על ידי הכנת תמיסות סטוק וריכוזי עבודה של TMRM ו-H 2D CFDA. השלב השני הוא דגירה של הנורונים הקורטיקליים עם TMRM ו-H 2D CFDA בטמפר Thai roads בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.השלב השלישי הוא הדמיית עוצמת הפלואורסצנציה של TMRM ו-DCF בנוירונים קורטיקליים חיים באמצעות עירור ופליטה של 515/517 ננומטר ו-488/515 ננומטר בהתאמה. השינויים בפלואורסצנציה של TMRM ינוטרו בנוכחות ה-uncoupler המיטוכונדריאלי FCCP, בעוד שהשינויים בפלואורסצנציה של DCF ינוטרו בנוכחות מימן פרוקסיד. השלב הסופי של פרוצדורה זו הוא איסוף הנתונים, נורמליזציה וניתוח שלהם.בסופו של דבר, התוצאות מתקבלות על ידי שרטוט גרף המציג את הרמות היחסיות של עוצמת הפלואורסצנציה של TMRM ו-DCF לפני ואחרי טיפול ב-FCCP ובמימן פרוקסיד, בהתאמה. שלום, אני ג'ואנה קוסקה. ברוכים הבאים למעבדה שלי באוניברסיטת לויולה בשיקגו.היום נראה לכם כיצד למדוד פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי ומינים חמצוניים ריאקטיביים בנוירונים קורטיקליים של חולדה. הפרוצדורה תודגם על ידי dhi. שלום, אני דניס ג'וסי.באמצעות פרוצדורה זו, ניתן למדוד את הפוטנציאל של ממברנת המיטוכונדריה בסימון של מיטוכונדריה בודדת, ואת רמות רדיקלי החמצן (ROS) בסימון של תא בודד. אם כן, נתחיל. הכינו תמיסת סטוק של TMRM בריכוז 10 millimolar על ידי המסה של five milligrams של TMRM ב-one milliliter של dimethyl sulf oxide אנहाइडרי, וערבבו ב-vortex למשך דקה אחת.לאחר מכן, הכינו מנות (aliquots) ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. יש להגן מהאור ולהשתמש תוך חודש אחד. בשלב הבא, הכינו תמיסת מלאי (stock) של H 2D CFDA בריכוז 10 millimolar על ידי המסה של 4.87 milligrams של H 2D CFDA בתוך one milliliter של dimethyl sulf oxide ללא מים (anhydrous).באופן דומה, ערבבו במערבל Vortex למשך דקה אחת, לאחר מכן חלקו למנות (aliquots) ואחסנו אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס. הגנו מהאור והשתמשו בתוך שבוע כדי להטעין תחילה את נוירוני קליפת המוח של החולדה ב-TMRM. שטפו את הנוירונים המטופחים שלוש פעמים עם בופר טיירו (tyro's buffer).לאחר מכן, הכין TMRM בריכוז 20 nano molar על ידי דילול של מלאי TMRM בריכוז 10 millimolar פי 1000 ב-tb. לאחר מכן, הוסף שני microliters של TMRM מדולל לכל milliliter אחד של tb. דגרי את הנוירונים עם TMRM למשך 45 דקות בחושך ובטמפרטורת החדר.לאחר 45 דקות, מקמו את צלחת התרבית עלבמת המיקרוסקופ והתחילו בדימות כדי להטעין את נוירוני קורטקס החולדה ב-H 2D CFDA, ושטפו את הנוירונים בתרבית שלוש פעמים ב-tb. לאחר מכן, הכינו תמיסת H 2D CFDA בריכוז 2 µM על ידי דילול של תמיסת הסטוק של H 2D CFDA בריכוז 10 mM פי 10 ב-tb. לאחר מכן, הוסיפו 2 µL של H 2D CFDA מדולל לכל 1 mL של tb.לאחר מכן, דגרו את הנוירונים עם H 2D CFDA למשך 45 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. שטפו את הנוירונים ארבע פעמים עם TB כדי להסיר את עודפי האינדיקטור הפלואורסצנטי לפני קבלת התמונות לביצוע הדמיה חיה של נוירונים שדגרו עם TMRM באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקת לייזר, תוך שימוש בתוכנית לסדרות זמן חיות (live time series program). השתמשו ברזולוציה נמוכה ובעוצמת לייזר מוחלשת כדי למזער את הזמן הנדרש לקבלת התמונות וכדי למנוע פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching).בשלב הבא, כווננו את המיקוד של הנוירונים המותקנים והטעונים ב-TMRM באמצעות אור מוחזר. בחנו את הפלואורסצנציה של ה-TMRM על ידי הארה ב-540 ננומטר וגילוי ב-570 ננומטר. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, הכוללים רזולוציה, עוצמת לייזר, הגבר של המצלמה ומרווחי זמן לצילום (time-lapse), הגדירו את הגבר הגילוי של המצלמה לרמה הנמוכה ביותר מרף הרוויה.אין לשנות הגדרות אלו בין ניסויים. לאחר מכן, שנו את השדה. התחילו באיסוף תמונות כדי לבחון שינויים בגירוי ה-delta PSY M; ניתן להשתמש, למשל, ב-1 µM של FCCP או ב-2 µg/mL של oligomycin, אשר יגרמו לדה-פולריזציה או להיפר-פולריזציה משמעותית של פוטנציאל ממברנה המיטוכונדריאלית, בהתאמה.שינויים אלה יבואו לידי ביטוי בירידה בעוצמת הפלואורסצנציה של TMRM בהשוואה לעוצמת הפלואורסצנציה הבסיסית במקרה של FCCP, או בעלייה בעוצמת הפלואורסצנציה של TMRM. במקרה של LIGA myin sin לצורך ביצוע דימוי חי של נוירונים שהודגרו עם H 2D CFDA, ראשית מקבעו את צלחת התרבית עלבמתו של המיקרוסקופ, והתאימו את המיקוד של התאים באמצעות אור מוחזר. בחנו את פלואורסצנציית ה-DCF על ידי עירור ב-4 88 nanometers ופליטה ב-five 15 nanometers.בשלב הבא, כוון את עוצמת הלייזר ל-5% עד 7%, הגדר הגבר (gain) ורזולוציה של 256 על ידי 256. אין לשנות הגדרות אלו בין ניסויים. לאחר מכן, הגדר את התדירות לקבלת תמונות חיות.בעזרת תוכנית סדרות הזמן (Time series), בחרו שדה חדש והתחילו ברכישת תמונות כדי לזהות שינויים ברמות ה-R os. טפלו בתאים ב-100 עד 200 micromolar של מי חמצן. הדבר יבוא לידי ביטוי בעלייה בעוצמת הפלואורסצנציה של DCF בהשוואה לרמת הבסיס.השתמש בכלי הגדרת אזור העניין (region of interest) מתוכנת ה-LSM כדי לבחור את האזורים. לאחר מכן, בחר ROIs מאזורי מיטוכונדריה או ROIs מכל גוף התא בתאי הדמיя. זאת כדי למדוד את עצימיות הפלואורסצנציה של TMRM או ROS, בהתאמה.בחרו אזורים סמוכים לתאים. כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנציה של הרקע, בצעו מספר מדידות; כדי לחשב את עוצמת הרקע הממוצעת, הפחיתו את עוצמת פלואורסצנציית הרקע הממוצעת מעוצמות הפלואורסצנציה הממוצעות של אזורי העניין בכל תא עבור כל נקודת זמן באמצעות Microsoft Excel. לאחר הפחתת עוצמת הרקע, נרמלו את עוצמת הפלואורסצנציה של TMRM או DCF ביחס לפלואורסצנציית הבסיס.השתמשו בנוסחה זו, ולאחר מכן השתמשו בתוכנת Sigma plot כדי להפיק את הגרף המראה את השינויים בעוצמת הפלואורסצנציה לאורך זמן. להלן דוגמה לתמונת פלואורסצנציה של נוירונים קורטיקליים של חולדה שהודגרו עם TMRM. הוספת המפקיע המיטוכונדריאלי F-C-C-P-A מובילה לדפולריזציה מיטוכונדריאלית ולאובדן של עוצמת הפלואורסצנציה של TMRM.רמת הפלואורסצנציה הבסיסית של TMRM נותרת יציבה לפני הוספת FCCP. ניתוח כמותי של שינויים בפלואורסצנציית TMRM לאורך זמן מראה ירידה משמעותית בפלואורסצנציית TMRM לאחר הוספת FCCP. להלן דוגמה לתמונת פלואורסצנציה של נוירונים קורטיקליים של חולדה שנטענו ב-DCF.רמת הפלואורסצנציה הבסיסית של DCF נשארת ללא שינוי ב-120 השניות הראשונות לפני הוספת מי חמצן. הוספת מי חמצן מובילה לעלייה בעוצמת הפלואורסצנציה של DCF בגופי התאים. מדידות Time-lapse של פלואורסצנציית DCF מראות רמות יציבות שעלו לאחר טיפולים במי חמצן.בנוהל זה, חשוב לזכור להשתמש בהספק לייזר נמוך ובמהירות סריקה גבוהה כדי למנוע ארטיפקטים של דהייה פוטוכימית (photo bleaching) ורעילות פוטוית (phototoxicity). בהצלחה בניסוי שלכם.

determination-mitochondrial-membrane-potential-reactive-oxygen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Katsalifis, A., et al. הדמיה חיה של מצב חמצון חיזור גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות אינדיקטור רציומטרי. J. Vis. Exp. (2021)סרטון זה מדגים את ההדמיה של מצב חמצון חיזור מיטוכונדריאלי בתאי עצב ראשוניים באמצעות מחוון פלואורסצנטי רציומטרי. על ידי החלת שני אורכי גל עירור תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, נמדד יחס עוצמת הקרינה כדי להעריך חמצון מיטוכונדריאלי. הפרוטוקול כולל גירוי N-methyl-D-aspartate (NMDA) כדי לגרום לזרם סידן וייצור מיני חמצן תגובתיים (ROS), ולאחר מכן כיול באמצעות...

הדמיית מצב חמצון חיזור מיטוכונדריאלי בתאי עצב ראשוניים באמצעות אינדיקטור רציומטרי

השוואה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בין דגימות מניבה מידע רב ערך על מצב התא. מתוארים שלבים מפורטים לבידוד מיטוכונדריה והערכת תגובה למעכבים ומנתקים באמצעות פלואורסצנטיות. השיטה והתועלת של פרוטוקול זה מומחשות על ידי שימוש בתרבית תאים ומודל בעלי חיים של מתח תאי.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

מאמר זה מתאר את השיטה להדמיה מיטוכונדריאלית של תרביות אסטרוציטים המצוידות בביו-סנסור MitoTimer ואת הניתוח הרב-פרמטרי המתקבל של דינמיקה מיטוכונדריאלית, ניידות, מורפולוגיה, ביוגנזה, מצב אדום ומחזור.

הדמיה חיה של מערכת מיטוכונדריאלית באסטרוציטים מתורבתים

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לקבוע הבדלים במצב redox בזאלי ו redox תגובות perturbations חריפה בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח באמצעות מיקרוסקופיה חיה קונפוצלית. ניתן להחיל את הפרוטוקול על סוגי תאים ומיקרוסקופים אחרים עם שינויים מינימליים.

הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי

מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ"א מיטוכונדריאלי.

ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

נשימה ברזולוציה גבוהה המוצמדת לחיישנים פלואורסצנטיים קובעת את צריכת החמצן המיטוכונדריה ואת ייצור מיני החמצן הריאקטיבי (ROS). הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה להערכת שיעורי הנשימה המיטוכונדריאליים וייצור ROS בעצב הסיאטי החודר.

הערכת תפקוד המיטוכונדריה בעצב הסיאטי על ידי נשימה ברזולוציה גבוהה

טכניקה זו מתארת זרימת עבודה יעילה כדי להמחיש ולמדוד כמותית את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד בתוך תאי HeLa באמצעות הדמיה חיה מבוססת פלואורסצנטיות.

כימות מבוסס פלואורסצנטיות של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ורמות הסופראוקסיד באמצעות הדמיה חיה בתאי HeLa

הרשת המיטוכונדריאלית מורכבת ביותר, מה שהופך אותה למאתגרת מאוד לניתוח. כלי חדשני של MATLAB מנתח מיטוכונדריה עם תמונות קונפוקליות חיות בתמונות timelapse, אך התוצאה היא נפח פלט גדול הדורש תשומת לב ידנית אישית. כדי להתמודד עם בעיה זו, פותחה אופטימיזציה שגרתית, המאפשרת ניתוח קבצים מהיר.

ניתוח אוטומטי אופטימלי של אפנון הומאוסטזיס מיטוכונדריה עצבית חיה על ידי קולטני חומצה רטינואית ספציפיים לאיזופורם

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה להתפשטות, התמיינות וצביעה של תאי SH-SY5Y בתרבית ותאי עצב ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה לצורך הדמיה וניתוח של מבנה אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי באמצעות מיקרוסקופ דלדול פליטה מגורה (STED).

שימוש בדימות STED של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול שלב אחר שלב ומדגישים את הפרטים העיקריים לקביעת מאפיינים מורפולוגיים של מיטוכונדריה בתאים חיים, כולל הכנת דגימות, רכישת תמונה וניתוח נתונים. שיטה זו משמשת בדרך כלל לבחינת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית לחקר מצבים שונים.

קביעת מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

למדו לבצע הדמיית פלואורסצניה חיה של נוירונים קורטיקליים בחולדה כדי למדוד פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלי ורמות חמצן ריאקטיבי באמצעות TMRM ו-H2D CFDA. שיטה זו מאפשרת ניטור בזמן אמת של תהליכים תאיים חיוניים במחקר נוירוביולוגי.

קביעת מיטוכונדריאלי המינים ממברנה פוטנציאליים הריאקטיבי חמצן בנוירונים חולדה חיה קליפתיים

גלה סרטונים נוספים