תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

מטרת ניסוי זה היא להפיק מבני רקמה תלת-ממדיים דמויי סטרואידים. הדבר מושג תחילה על ידי קציר של תאים מתרבית, ולאחר מכן יצירת תרחיף של תאים בודדים. לאחר מכן, טיפות מהתרחיף התאי מונחות על הצד התחתון של המכסה ההפוכה מתוך צלח לתרבית רקמה.

לאחר מכן, הופכים את המכסה על תא ההידרטציה. השלב האחרון הוא דגירה של הטיפות התלויות למשך 24 עד 48 שעות כדי לאפשר היווצרות של אגרגטים. אלו ניתנים להעברה למקש רטט (shaking water bath) ודגירה למשך חמישה ימים נוספים.

בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות הבדלים בקוהזיה של אגרגטים או במיון תאים באמצעות בדיקות דחיסה, סימטריה של פני השטח של הרקמה או מיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפיגנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרביות רקמה דו-ממדיות (2D) קונבנציונליות, הוא שתאים הגדלים בתלת-ממד (3D) מדמים באופן הדוק יותר את האינטראקציות התאיות המתרחשות בסביבת רקמה. אני אדגים שיטה זו כדי להראות לכם שהיא כה פשוטה, שגם חוקר ראשי (PI) יכול לבצע אותה.

כדי להתחיל בניסוי זה, קצרו תאי היצמדות ב-90% fluency. ראשית, שאבו את מצע התרבית ושטפו את שכבת התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS והעבירו בפיפט שני מיליליטר של תמיסת 0.05% tripsin EDTA על השכבה החד-שכבתית.

הניחו את הצלחת באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C והדגירו עד להDetach של התאים. לאחר מכן, הוציאו את הצלחת מהאינקובטור ועצרו את התהליך. הוסיפו 2 mL של מצע גידול מלא.

השתמשו בפיפט של 5 ml כדי לערבב את התערובת עד שהתאים יהיו בסספנזיה מלאה. לאחר מכן, העבירו את סספנזיית התאים למבחנה קונית של 15 ml. פפטו 40 µl של תמיסת DNA בריכוז 10 mg/mL אל סספנזיית התאים, והדגירו אותה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לאחר ההדגרה.

ערבבו את תרחיף התאים ב-Vortex לזמן קצר ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך חמש דקות. עם סיום הסבוב, שאבו את ה-S supernatant והשליכו אותו, ולאחר מכן השעיקו מחדש את המשקע ב-1 mL של מצע גידול מלא לצורך שטיפה. חזרו על הסבוב בצנטריפוגה והשעיקו מחדש את המשקע ב-1 mL של מצע גידול מלא.

לאחר מכן, בצעו ספירת תאים באמצעות סופר תאים אוטומטי או המו-ציטומטר. כווננו את תרחיף התאים באמצעות מצע גידול לריכוז סופי של 2.5 times 10 to the six תאים למילליטר. לאחר מכן, המשיכו ליצירת טיפות תלויות.

הכינו תא לחות על ידי הסרת המכסה ממעטפת תרבית רקמות של 60 מילימטר והעברת 5 מיליליטר של PBS לתחתית המעטפת. הפכו את המכסה של הפיתה והעבירו עד 20-10 טיפות של 1 מיקרוליטר של תרחיף תאים לצדו התחתון של המכסה. ודאו כי הטיפות ממוקמות במרחק מספיק זו מזו כדי שלא ייגעו אחת בשנייה.

החזירו בעדינות את המכסה המכיל את תרביות הטיפות אל תחתית הכלי המכיל PBS. הכניסו את פלטת התרבית למדגרת תרביות רקמה. הגדירו את התנאים ל-37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide ו-95% humidity, והדגירו למשך הלילה.

יש לעקוב אחר הטיפות מדי יום ולהמשיך בדגירה עד להיווצרות של שכבות תאים או אגרגטים. לאחר היווצרות שכבות התאים או האגרגטים, העבר אותם לבקבוקי שייקר מזכוכית בעלי תחתית עגולה המכילים 3 mL של מצע מלא. דגור את הבקבוקים המכילים את שכבות התאים או האגרגטים במקלחית רטוטה.

יש לשמור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך כ-24 שעות, עד שניתן יהיה להבחין בהיווצרות הסטרואידים תחת מיקרוסקופ דיסקציוני. לאחר היווצרות הסטרואידים, ניתן לכמת את השפעת המניפולציות הניסוייות על היווצרות הסטרואידים בהתאם לנוהל המפורט בפרוטוקול הכתוב. כמו כן, ניתן כעת להבחין בהסתבכות (intercalation) של צבעים פלורסצנטיים שנוספו קודם לכן בממברנה באמצעות מיקרוסקופיה פלורסצנטית.

תמונה זו במיקרוסקופ שדה בהיר מדגימה את האגרגציה של תאי MLL של סרטן ערמונית של חולדה לאחר 18 שעות אינקובציה בשיטת הטיפה התלויה (hanging drop). תמונה זו מראה אגרגט שני של תאי MLL שנוצר לאחר 18 שעות תרבית בשיטת הטיפה התלויה. תאים אלו גודלו בנוכחות 25 micromolar של מעכב MEK מסוג PD 9 8 0 5 9, מה שהביא ליצירת אגרגט תאים דחוס באופן משמעותי יותר.

כאן מוצג ההבדל בגודל האגרגטים בין תרבית טיפות תלויות של MLL שעובדה עם מעכב MEK לבין גודל אגרגטים של ביקורת לא מעובדת. הכוכבית מייצגת הבדל מובהק סטטיסטית של P פחות מ-0.0001. כפי שנקבע באמצעות מבחן t של סטודנטים בין אגרגטים לא מעובדים לאגרגטים שעובדו עם מעכב MEK, התוצאות מרמזות כי טיפול במעכב MEK מוביל לאגרגטים קטנים ודחוסים יותר באופן מובהק.

תמונה זו צולמה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו Nikon Smz 800 וממחישה סטרואיד שנוצר על ידי הדגרה של תאי כבד עובריים של אפרוחים בתרבית טיפות תלויות (hanging drop culture) למשך 18 שעות, ולאחר מכן במכחול מים רועד בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות. תמונת מיקרוסקופ קונפוקאלי זו מדגימה את התנהגות המיון (sorting out) המתרחשת כאשר אוכלוסיות תאים מסוימות גודלות יחד (co-cultured) בשיטת הטיפות התלויות. לפני המעבר לתרבית טיפות תלויות, תאי כבד עובריים של אפרוחים צבעו בצבע ציפוי ממברנה pkh two ובאפרוחים עובריים.

תאי לב נצבעו ב-PKH 26. לאחר מכן, תרחיפי התאים עורבבו והועברו לשיטת טיפה תלויה. התרבית גודלה במשך 18 שעות, ולאחריהן בוצעה אינקובציה של 48 שעות במקלח מים רועד בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

ניתן לראות מהחתך האופטי שתאי הלב הצבועים בצהוב עטופים על ידי תאי כבד. צבועים בכחול מדומם כאן שני שבטים של תאי L שעברו טרנספקציה ומבטאים NCA על פניהם. ביחס של 2.4 ל-1, הם נצבעו בצבעי ממברנה פלואורסצנטיים, PKH 2 ו-PKH 26 המעורבבים בפרופורציות שוות, וגודלו כטיפות תלויות כפי שנעשה בעבר.

בדוגמה זו, התאים המבטאים רמות גבוהות של cadian, הצבועים באופן פסאודו-כרומטי בירוק, עטופים על ידי תאים המבטאים רמות נמוכות יותר של en cadian, הצבועים באופן פסאודו-כרומטי באדום. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ב-30 דקות או פחות, אם היא מבוצעת כהלכה.