Name: תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: למד שיטה מהירה ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים מדגימי תאים תלויי תרבית. טכניקת הטיפות התלויות מאפשרת חקר אינטראקציות תא-תא במהירות וביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר מבקש להודות לד&quot;ר Dongxuan ג&#39;יאה לקבלת סיוע טכני. חלק מן התמונות המופיעות במאמר זה היו בשיתוף עם ד&quot;ר מלקולם ש שטיינברג, המחלקה לביולוגיה מולקולרית, אוניברסיטת פרינסטון. המחבר רוצה גם להודות משרד הביטחון תוכנית סרטן הערמונית מחקר (מענקים-PC ו-PC 030,482 991,552) ו / NCI NIH (מענק R01CA118755) על תמיכתם הנדיבה.

1. הכנת תרחיף תא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתרביות תאים חסיד צריך להיות מבוגר כדי מפגש 90%, monolayers ואז יש לשטוף פעמיים עם PBS. לאחר ניקוז טוב, להוסיף 2 MLS (עבור 100 צלחות מ"מ) של 0.05% טריפסין-1 mM EDTA, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד תאים לנתק. עצור trypsinization ידי הוספת 2 MLS של המדיום להשלים בעדינות להשתמש פיפטה 5 מ"ל ל triturate את התערובת עד התאים בתרחיף. העברת התאים צינור חרוטי 15 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של 10 מ"ג / מ"ל ​​DNAse מניות דגירה במשך 5 דקות ב RT. וורטקס בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף עם גלולה 1 מ"ל להשלים בינוני רקמה תרבות. חזור, ואז התאים resuspend ב 2 MLS של המדיום רקמה שלמה תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemacytometer, או נגד תא אוטומטיות ולהתאים הריכוז 2.5 x 10 6 תאים / מ"ל. להדגמה זו מונה TC10 BioRad תא אוטומטי היה בשימוש. </li></ol> 2. כינונה של טיפות תלויות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מכסה צלחת 60 מ"מ רקמת תרבות מקום 5 MLS של PBS בתחתית הצלחת. זה ישמש חדר הידרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המכסה להשתמש pipettor 20 μl להפקיד 10 טיפות μl על החלק התחתון של המכסה. ודא כי טיפות ממוקמים מספיק מזה כדי לא לגעת. אפשר במקום לפחות 20 טיפות לכל מנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המכסה על חדר-PBS מלא התחתונה לדגור על 37 ° CO 5 / 2% / 95% לחות, לעקוב אחר טיפות יומי לדגור עד או יריעות התא או אגרגטים יצרו. מיקרוסקופ סטריאופוני ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות המצרפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בצורת יריעות, הם יכולים להיות מועברים מסביב לתחתית הכוס שייקר צלוחיות המכילות 3 של ה-MLS בינוני מלא מודגרות באמבט מים רועד ב 37 ° C ו 5% CO 2 עד טופס spheroids. </li></ol> 3. הערות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לגודל התא, ריכוז ייתכן שיהיה צורך להתאים למעלה או למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים יכולים להיות מוכתמים קרום intercalating צבעי ניאון לפני היווצרות טיפת תלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני סוגי תאים שונים יכול להיות מוכתם דיפרנציאלי מעורב ביחס 1:1 (או אחר) לפני היווצרות של טיפות תלויות. אלו יכולים להיות סרטן סטרומה תאים, רקמות עובריים או תאים מהונדסים גנטית יש חתימות דבק ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים יכולים להיות מנותקת מן הכלים התרבות רקמות באמצעות טריפסין 0.05% / 2 mM סידן כדי לשמור על תפקוד cadherin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם הניסוי, בגדלים גיליון יכול להימדד, או אגרגטים יכול לשמש לבדיקות מכניות או לצורך ניתוח ביוכימי או המולקולרית. </li></ol> 4. נציג תוצאות: גיליון או היווצרות spheroid מתרחשת בדרך כלל תוך 24 שעות, אך עשוי להימשך זמן רב יותר, תלוי בסוג התא. איור 1 מייצג את התמונות שנתפסו לאחר 18 שעות של דגירה של מטופל הערמונית MAT-LyLu סרטן (MLL) התאים תלוי תרבות טיפה (איור 1A) או תאים שטופלו 25 מיקרומטר MEK מעכב PD98059. שים לב כי תוצאות הטיפול ב MEKi דחיסה ניכרת של גיליון התא. דחיסת ניתן לכמת על ידי מדידת גודל של 10-20 (או יותר) תלוי טיפות השוואת הגודל הממוצע בין קבוצות הטיפול. אנחנו בדרך כלל לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ ידי thresholding כל תמונה אז המרת תמונות מצב בינארי, ואז אנחנו מיישמים ניתוח החלקיקים כדי לחשוף את אזור התמונה הכוללת פיקסלים. לאחר מכן ניתן להמיר בקלות מיקרון מרובע. תרשים 2 מייצג השוואה גודל התאים MLL מטופלים ו MEKi שטופלו. כאמור, הטיפול MEKi מפחית באופן משמעותי את גודל גיליון בהשוואה ידי הסטודנטים של מבחן t (p &lt;0.0001). לשם השוואה זו, 10 מצרפי עבור כל אחד בתאים שלא טופלו ומטופלים נמדדו. איור 3 מייצג כבד עובריים חומוס spheroid נוצרו לאחר 24 שעות תלוי תרבות ירידה ו 2 ימים באמבטיה שייקר. Assay הירידה תלוי גם יכול להיות שונה כדי לכלול יותר מסוג אחד לתא כדי לחשוף את המיקום המרחבי מאומץ. לדוגמה, תאים עובריים חומוס כבד יכול להיות בודד, מוכתמת צבע קרום intercalating פלורסנט מעורבב עם חומוס תאים עובריים לב, כי כבר מוכתם פלורסנט סמן שונים. מראה איור 4A כי במקום הנותרים intermixed, בתאי הכבד והלב נוטים "מחוץ למיין" מתוך אחד אחר ולאמץ כדור, בתוך-a-כדור תצורה בה לתאי לב אפופים בתאי הכבד. תצורה זו ניתן להסביר את ההבדלים בין הידבקות אינטר הכבד ותאי לב. תפיסה זו היא קודיפיקציה של השערה ההפרש הידבקות אשר שימש להסביר תא מיון התנהגות בין רקמות נבט עובריים שכבת דוחי 3 ו 4 teleost עוברים, עבור הארגון איון תא לבלב 5 ועבור התא מיון בין שתי אוכלוסיות תאים זהים in כל הכבוד אחר מאשר עבור רמות ביטוי של אותו סוג של cadherin (6 ואיור 4B). תוצאה זו חשובה במיוחד עבור המדגים כיצד הנדסה הבדל פשוט הידבקות בין אוכלוסיות תאים עלול לגרום לדור של מבנה האיבר, למשל, לבלב 5. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תמונות של תאים מודגרות ב תלוי תרבות ירידה במשך 18 שעות או בהעדר (א) או נוכחות (B) של 25 מיקרומטר של מעכב ה-MEK PD98059. תמונות שנתפסו באמצעות Eclipse Nikon TE 300 מיקרוסקופ epifluorescence ו CoolSnap Photometrics ES מצלמה דיגיטלית. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. כימות הדחיסה MEKi-Induced של עכברוש הערמונית תאים סרטניים MLL. תרבויות ירידה התלויים של תאים MLL מטופלים ו MEKi שטופלו הודגרו במשך 18 שעות ואז גודל מצטבר נקבע כפי שתואר לעיל. ניתוח סטטיסטי של גודל המצרפי היה על ידי סטודנטים של t-test. כוכבית מייצג הבדל משמעותי סטטיסטית בגודל המצרפי (P &lt;0.0001) בין תאים שלא טופלו ו MEKi שטופלו ומציע MEKi טיפול תוצאות אגרגטים קטנים משמעותית וקומפקטי יותר. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Spheroid שהוקמה על ידי דוגרים תאים עובריים חומוס כבד תלוי תרבות ירידה במשך 18 שעות לאחר מכן באינקובטור / רועד באמבטיה במשך 48 שעות. תמונה זו נתפס באמצעות מיקרוסקופ SMZ800 Nikon סטריאו מצלמה Sony CCD שחור. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. התלויים בתרבות ירידה מגלה מיון החוצה התנהגות בין סוגי תאים שונים. בפאנל, תאים עובריים חומוס כבד הוכתמו לצבוע intercalating PKH-2 קרום מעורב בשיעורים שווים עם PKH-26 תאים עובריים מוכתם חומוס לב. בלוח ב ', שני N-cadherin-transfected תא L שיבוטים (LN4 ו LN2a), מביע N-CAD על השטח שלהם ביחס של 2.4:1, הוכתמו גם עם צבעי ניאון קרום intercalating PKH-2 ו PKH-26 , (סיגמא אולדריץ '), מעורבות בשיעורים שווים ותרבותיים כמו תלויים 7 טיפות. לאחר 18 שעות בתרבות, סדינים תא הועברו צלוחיות רועד מודגרות לעוד 48 שעות. המצרפים היו קבועים paraformaldehyde 2% פוספט שנאגרו מלוחים וראו עם BioRad MRC600 סריקת מערכת לייזר confocal מיקרוסקופ המחובר למיקרוסקופ Nikon Optiphot-2. סעיפים אופטי מערוצים הן ירוק ואדום נאספו Graphix הסיליקון Crimson עבודה VGX מצויד תמונות ויטל Voxel צפה תוכנה Ultra הדמיה נעשה שימוש כדי להקצות צבע שווא לשני ערוצים למזג את התמונות, חושף את תצורות אנטומי שנוצר. (א) סעיף אופטי Confocal באמצעות כיתור הוכחת המצרפי של תאים לב (כאן צבע פסאודו צהוב) על ידי תאים בכבד pseudocolor כחול (מתוך 8). (ב) בסעיף אופטי Confocal באמצעות כיתור הוכחת המצרפי של תאים גבוה N-cadherin להביע (ירוק) על ידי אלה להביע רמות נמוכות יותר של N-cadherin (אדום) (מתוך 6).

<ol><li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+extracellular+matrix%2C+scaffolds%2C+and+signaling%3A+tissue+architecture+regulates+development%2C+homeostasis%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).</li>
<li>Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-layer+surface+tensions+and+%26quot%3Btissue+affinities%26quot%3B+in+Rana+pipiens+gastrulae%3A+quantitative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ-layer surface tensions and &quot;tissue affinities&quot; in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements.</a> Dev Biol. 192, 630-644 (1997).</li>
<li>Schotz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP J. 2, 42-56 (2008).</li>
<li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li>
<li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+adhesion+hypothesis%3A+a+direct+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation.</a> Dev Biol. 278, 255-263 (2005).</li>
<li>Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+casein+kinase+2+subunits+in+Chinese+hamster+ovary+and+3T3+L1+cells+provides+information+on+the+role+of+the+enzyme+in+cell+proliferation+and+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle.</a> J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).</li>
<li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+and+bottlenecks+of+bioreactors+in+3D+cell+culture+and+tissue+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing.</a> Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).</li>
<li>Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+wound+contraction%3A+collagen+organization%2C+fibroblasts%2C+and+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts.</a> Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+biology+in+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices.</a> Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).</li>
<li>Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+beta1-integrin+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+three-dimensional+basement+membrane+breast+cultures%3A+a+different+perspective+in+epithelial+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).</li>
<li>Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+apoptosis+by+basement+membrane+requires+three-+dimensional+tissue+organization+and+withdrawal+from+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).</li>
<li>Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+by+hyaluronidase+of+adhesion-dependent+multicellular+drug+resistance+in+mammary+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells.</a> J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).</li>
<li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+structure%2C+nuclear+organization%2C+and+gene+expression+in+normal+and+malignant+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast.</a> Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).</li>
<li>Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+tumor+spheroid+in+a+microgravity+environment+as+a+3D+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).</li>
<li>Napolitano, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+three-dimensional+cell+culture+utilizing+micromolded+nonadhesive+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Biotechniques. 43, 494-496 (2007).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מחקרים הראו כי תאי culturing בהקשר תלת ממדי (3D) מייצרת מורפולוגיה הסלולר איתות מובהק בהשוואה מערכת נוקשה (2D) דו מימדי התרבות 9. לדוגמה, פיברובלסטים המאוכלסים ג&#39;ל קולגן להוכיח כי מורפולוגיה פיברובלסטים ב-3D ​​הוא שונה לגמרי מזו שנצפתה 2D 10,11. באופן דומה, תרבות 3D יכול לגרום לרקמות ספציפיות התמיינות של תאים אפיתל החלב. מערכות 3D תרבות שימשו להבחין בין תאים נורמליים ממאיר הוכחו לתמוך חזרה של תאים כדי להפוך פנוטיפ נורמלי, בהינתן הגירוי המתאים 12,13.<...

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא דלפק אוטומטי (BioRad TC10) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רועד אמבט מים עם דגם ה-CO 2 גמלון לכסות 3540 (Lab-line) </li></ul>

תא פשוט תלוי תרבות drop פרוטוקול הדור של spheroids 3d

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

מחקרים על לכידות התא התא התא תשתית הידבקות יש היסטורית שבוצעה על תרבויות monolayer חסיד מצעים נוקשה. תאים בתוך הרקמה, עם זאת, הם בדרך כלל עטוף בתוך מסת רקמת וצפופים שבו תאים ליצור חיבורים אינטימיים עם כמעט שכנים רבים עם רכיבים תאי מטריקס. לפיכך, המילייה כימיים כוחות פיזיים שחווים תאים בתוך רקמה 3D שונות באופן מהותי מאלה שחוו התאים גדל בתרבות monolayer. זה הוכח במידה ניכרת השפעה מורפולוגיה איתות הסלולר. כמה שיטות כבר המציאו כדי ליצור תרביות תאים 3D כולל אנקפסולציה של תאים ג&#39;ל קולגן 1 או ביולוגי פיגומים 2. שיטות כאלה, בעוד שימושי, לא לשחזר את האדריכלות אינטימי ישיר תאים תאים הידבקות למצוא רקמות נורמליות. במקום זאת, הם יותר מקרוב מערכות תרבות המשוער שבו תאים בודדים מפוזרים באופן רופף בתוך meshwork 3D של מוצרי ECM. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה שבה תאים ממוקמים תלוי תרבות טיפה מודגרות בתנאים פיסיולוגיים עד שהם יוצרים spheroids 3D אמיתי שבו תאים נמצאים בקשר ישיר אחד עם השני עם רכיבים תאי מטריקס. השיטה אינה דורשת ציוד מיוחד והוא יכול להיות מותאם כוללים תוספת של כל סוכן ביולוגי בכמויות קטנות מאוד, כי יכול להיות עניין הבהרת השפעות על תאים תאים או תאים ECM אינטראקציה. השיטה יכולה לשמש גם לתרבות שיתוף שני (או יותר) אוכלוסיות תאים שונות על מנת להבהיר את התפקיד של אינטראקציות תאים תאים או תאים ECM של ציון יחסים מרחביים בין תאים. Cell-cell לכידות התא ECM הידבקות הם אבני היסוד של מחקרים של אינטראקציה עובריים, התפתחות תאים סרטניים, סטרומה בפלישה ממאיר, ריפוי פצעים, ועבור יישומים הנדסת רקמות. זו שיטה פשוטה תספק אמצעי ליצירת רקמות כמו אגרגטים הסלולר למדידת נכסים biomechanical או לניתוח מולקולרית ביוכימיים במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה של הפקת 3D רקמה דמוית spheroids יישום הפוטנציאל שלהם לכמת הבדלים תאים תאים אינטראקציות.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

מחקרים על לכידות בין-תאית והיצמדות של תאים לתשתית בוצעו היסטורית על תרביות של שכבה אחת (monolayer) ההיצמדות למצעים קשיחים. תאים...

מטרת ניסוי זה היא להפיק מבנים דמויי רקמה בתלת-ממד (3D). הדבר מושג תחילה על ידי קציר של תאים מתרבית, ולאחר מכן יצירת תליה של תאים בודדים. בשלב הבא, טיפות של תחתיית התאים מונחות על הצד התחתון של המכסה ההפוך של צלחת תרבית רקמה.לאחר מכן, הופכים את המכסה על תא ההידרטציה. השלב הסופי הוא דגירה של הטיפות התלויות למשך 24 עד 48 שעות כדי לאפשר היווצרות של אגרגטים. ניתן להעביר אותם לאחר מכן למקלח מים עם ניעור ולדגור למשך חמישה ימים נוספים.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות הבדלים בקוהזיה של אגרגטים או במיון תאים באמצעות בדיקות דחיסה (compaction assays), סימטריה של פני השטח של הרקמה או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (epi fluorescence microscopy). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית רקמות דו-ממדית (2D) קונבנציונלית, לדוגמה, הוא שתאים הגדלים בתלת-ממד (3D) מחקים בצורה מדויקת יותר את האינטראקציות התאיות שחווים תאים בסביבת רקמה. אני הדגים את השיטה הזו כדי להראות לכם שהיא כה פשוטה, שגם PI יכול לבצע אותה.כדי להתחיל בניסוי זה, קצרו תאי היצמדות בנשיאות של 90%. ראשית, שאבו את מצע התרבית ושטפו את שכבת התאים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS והעבירו בפיפט שני מיליליטרים של תמיסת 0.05%trypsin EDTA על שכבת התאים (monolayer).הנח את הצלחת באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degree Celsius והדגר עד להיפרדות התאים. לאחר מכן, הוצא את הצלחת מהאינקובטור ועצור את התהליך על ידי הוספת שני milliliters של מצע גידול מלא.השתמשו בפיפט של 5 mL כדי לטרטט את התערובת עד שהתאים יהיו בסוספנזיה מלאה. לאחר מכן, העבירו את סוספנזיית התאים למבחנה קונית של 15 mL. העבירו בפיפט 40 µL של תמיסת DNA בריכוז 10 mg/mL אל סוספנזיית התאים, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לאחר ההדגרה.ערבבו את תרחיף התאים ב-Vortex לזמן קצר ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך חמש דקות. עם סיום הסבוב, שאבו את ה-S supernatant והשליכו אותו, ולאחר מכן השעיקו מחדש את המשקע ב-1 ml של מצע גידול מלא לצורך שטיפה. חזרו על הסבוב בצנטריפוגה והשעיקו מחדש את המשקע ב-1 ml של מצע גידול מלא.בשלב הבא, בצעו ספירת תאים באמצעות סופר תאים אוטומטי או המוציטומטר. התאימו את תרחיף התאים באמצעות מצע גידול לריכוז סופי של 2.5 × 10⁶ תאים למילליליטר. לאחר מכן, המשיכו ליצירת טיפות תלויות.הכינו תא לחות על ידי הסרת המכסה מכלית תרבית רקמות של 60 מילימטר והטפת 5 milliliters של PBS לתחתית הכלית. הפכו את מכסה הכלית והטפילו עד 2010 microliter של תרחיף תאים על הצד התחתון של המכסה. ודאו כי הטיפות ממוקמות במרחק מספיק זו מזו כדי שלא ייגעו זו בזו.החזירו בעדינות את המכסה המכיל את תרביות הטיפות אל תחתית הצלחת המכילה PBS. הכניסו את צלחת התרבית לאינקובטור לתרביות רקמה. כווננו ל-37 °C, 5% carbon dioxide ו-95% humidity והדגירו למשך לילה.יש לעקוב אחר הטיפות מדי יום ולהמשיך בדגירה עד להיווצרות שכבות תאים או אגרגטים. לאחר שהיווצרו שכבות תאים או אגרגטים, העבר אותם לבקבוקי שייקר מזכוכית בעלי תחתית עגולה המכילים 3 mL של מצע גידול מלא. דגער את הבקבוקים המכילים את שכבות התאים או האגרגטים במקלחית רטט.שמרו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך כ-24 שעות, עד שניתן יהיה להבחין בהיווצרות הסטרואידים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. לאחר היווצרות הסטרואידים, ניתן לכמת את השפעת המניפולציות הניסיוניות על היווצרות הסטרואידים בהתאם לנוהל המפורט בפרוטוקול הכתוב. כמו כן, ניתן כעת להבחין באינטרקלציה של צבעים פלואורסצנטיים שנכללו קודם לכן בממברנה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.תמונת מיקרוסקופ בשדה בהיר זו מדגימה את התקבצותם של תאי MLL של סרטן ערמונית של חולדה לאחר 18 שעות של אינקובציה בשיטת הטיפה התלויה (hanging drop). תמונה זו מראה אגרגט שני של תאי MLL שנוצר לאחר 18 שעות של תרבית בשיטת הטיפה התלויה. תאים אלו גודלו בנוכחות 25 micromolar של מעכב ה-MEK שנקרא PD 9 8 0 5 9, דבר שהוביל לאגרגט תאים דחוס משמעותית יותר.כאן מוצג ההבדל בין גודל האגרגטים בתרבית טיפות תלויות של MLL שטופלה במעכב MEK לבין גודל האגרגטים בקבוצת ביקורת שלא טופלה. הכוכבית מייצגת הבדל מובהק סטטיסטית של P פחות מ-0.0001. כפי שנקבע באמצעות מבחן t של סטודנט בין אגרגטים שלא טופלו לאלו שטופלו במעכב MEK, התוצאות מצביעות על כך שטיפול במעכב MEK מוביל לאגרגטים קטנים ודחוסים יותר באופן מובהק.תמונה זו צולמה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו Nikon Smz 800 ומדגימה סטרואיד שנוצר על ידי דגירה של תאי כבד מעוברים של אפרוחים בתרבית טיפות תלויות למשך 18 שעות, ולאחר מכן במקלח מים רוטט בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 48 שעות. תמונה זו מהמיקרוסקופ הקונפוקאלי מדגימה את התנהגות המיון (sorting out) המתרחשת כאשר אוכלוסיות תאים מסוימות גודלות בתרבית משותפת באמצעות שיטת הטיפות התלויות; לפני המעבר לתרבית טיפות תלויות, תאי כבד מעוברים של אפרוחים נצבעו בצבע PKH2 לצביעת ממברנה ובאפרוחים מעוברים.תאי לב נצבעו ב-PKH 26. לאחר מכן, תהויי התאים עורבבו והועברו לשיטת טיפה תלויה (hanging drop). התרבית גודלה במשך 18 שעות, ולאחר מכן עברה אינקובציה של 48 שעות במקבץ מים רוטט בטמפרטורה של 37 °C.ניתן לראות מהחתך האופטי שתאי הלב הצבועים בצהוב עטופים בתאי כבד. צבועים בכחול מדמה כאן, שני שיבוטים של תאי L רגילים ותאים שעברו טרנספקציה המבטאים NCA על פני השטח שלהם. ביחס של 2.4 ל-1, נצבעו עם צבעי ממברנה פלואורסצנטיים, PKH 2 ו-PK KH 26 שערבבו בפרופורציות שוות, ותורבדו כטיפות תלויות כפי שבוצע קודם לכן.בדוגמה זו, התאים המבטאים רמות גבוהות של cadian, הצבועים בצבע מדמה ירוק, עטופים על ידי תאים המבטאים רמות נמוכות יותר של en cadian, הצבועים בצבע מדמה אדום. לאחר שילטהו בטכניקה זו, ניתן לבצעה ב-30 דקות או פחות אם היא מבוצעת כראוי.

a-simple-hanging-drop-cell-culture-protocol-for-generation-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

ספרואידים הם סוג של מודל תרבית תאים תלת-ממדי המשמש לייצוג מדויק יותר של סביבת התא בהשוואה למודלים חד-שכבתיים של תרבית תאים דו-ממדית. בפרוטוקול לדוגמה, נראה מדענים מייצרים ספרואידים מקו תאים של סרטן המעי הגס ומיישמים הדמיה של תאים חיים כדי לעקוב אחר גדילת הספרואידים.

יצירת ספרואידים מקווי תאים: שיטת תרבית תאים תלת ממדית (3D)

סרטון זה מתאר את הטכניקה של יצירת ספרואידים תלת מימדיים בשיטת הטיפה התלויה באמצעות תאי מלנומה. המודל התלת-ממדי של מלנומה ספרואידית אורגנוטיפית (3D) שנוצר במבחנה יכול לתאר את ארכיטקטורת in vivo של מלנומה ממאירה ועשוי לספק תובנות לגבי אינטראקציות תוך-גידוליות.

שיטת Hanging Drop: טכניקה ליצירת ספרואידים תלת ממדיים למלנומה

שיטה זו מעריכה פלישת תאי סרטן מספרואידים למטריצה תלת מימדית מסביב.  ספרואידים נוצרים בשיטת תרבית טיפה תלויה ולאחר מכן מוטמעים במטריצה המורכבת מחומרי ממברנת הבסיס וקולגן מסוג I.  פלישת הספרואידים מנוטרת לאחר מכן.

תאי סרטן ספרואיד Assay להערכת פלישה בסביבת 3D

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של תאים באמצעות צבירת תאים. זה מותאם בקלות לסוגי תאים מרובים ומתאים לשימוש במגוון יישומים כולל נדידת תאים, פלישה או מבחני אנויקיס, ולהדמיה וכימות אינטראקציות בין תאים-מטריצות.

שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

פרוטוקול זה מתאר את הדור של מטופלים שמקורם בחולים, וניתוח במורד הזרם כולל כימות של התפשטות, בדיקות ציטורעילות, הזרמת cy, כתמים והדמיה מיקוד, על מנת להעריך את התרופה פוטנציאל המועמדים כtherapeutics אנטינאופלסטית. פרוטוקול זה תומך ברפואה מדויקת עם זיהוי תרופות ספציפיות לכל מטופל ולשלב המחלה.

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

כאן, אנו מציגים מספר שיטות פשוטות להערכת הכדאיות והמוות ב-3D הסרטן תאים spheroids, אשר לחקות את פיזיקאלית-כימיים מעברי הצבע של גידולים vivo הרבה יותר טוב מאשר תרבות דו-ממדית. מודל ספרואיד, לכן, מאפשר הערכה של יעילות התרופה לסרטן עם תרגום משופר בתנאים vivo.

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

אנחנו מציגים מכשיר מיקרופלואידיסי צנטריפוגלי מנוע שיכול לטפח את התאים הניידים. באמצעות התקן זה, הספרואידים של סוגי תא יחיד או מרובים יכול להיות בקלות מתורבת בתנאי כבידה גבוהה.

פלטפורמת מעבדה-על-CD ליצירת רב-תאיים תלת מימדי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה לייצור ספרואידים רקמתיים בקנה מידה גדול וחסכוניים באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת-ממד.

יצירת כדורי רקמות באמצעות מכשיר דמוי בול מודפס בתלת מימד

אנו מציגים פרוטוקול לגידול ספרואידים בעלי יכולת שחזור גבוהה ואפיונם הפנוטיפי באמצעות לכידת תמונה ופרוטאומיקה.

ניתוח פנוטיפי חצי אוטומטי של תרביות תאים ספרואידים תלת-ממדיים פונקציונליים

מחקר זה מציג מתודולוגיה חסכונית ויעילה ליצירת מבני תאים תלת מימדיים באמצעות מערכת מבוססת חותמת ליצירת מיקרו-בארות בתבניות אגרוז. המערכת מקדמת היווצרות של ספרואידים/אורגנואידים אחידים, ובכך משפרת את האינטראקציות בין התאים. גישה זו מפחיתה את השונות הניסויית ותומכת ביישומים בבדיקות תרופות והנדסת רקמות.

יצירת ספרואידים/אורגנואידים תלת מימדיים מתרביות תאים דו-ממדיות באמצעות מכשיר חותמת חדשני

למד שיטה מהירה ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים מדגימי תאים תלויי תרבית. טכניקת הטיפות התלויות מאפשרת חקר אינטראקציות תא-תא במהירות וביעילות.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

גלה סרטונים נוספים