Name: Pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים לחקר פגיעה מוחית טראומטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: חקור מנגנוני פציעת מוח טראומטי באמצעות לחץ אימפולסיבי מבוקר בתאים עצביים תרבתיים. השיטה מאפשרת לחקור את סף מוות התאים ותגובות מולקולריות לפציעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות למקורות המימון: מרכז הצבא-UNL למכניקת טראומה (DoD / נרו, # W911NF-11-1-0033, PI: ד&quot;ר Namas צ&#39;אנדרה), פרס ההדיוט UNL (26-1110-0033 -001 , PI: לים).

1. תא תרבות עצבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי מוח בין תאי עצב, האסטרוציטים, ושיתוף תרבותם עשויים לשמש כמודל לתא. כהדגמת היתכנות, pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים תא השורה מוצג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי neuroblastoma אדם SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) שנמצאים בתרבית על coverslips זכוכית בקוטר 18 מ"מ. תאי הזרע בצפיפות של 3 × 10 3 תאים / 2 סנטימטר באמצעות תקשורת הצמיחה המורכבת מDMEM בתוספת סרום 10% שור עוברי ו1% פניצילין סטרפטומיצין. שקופיות זכוכית תרבית תאים נשמרות בCO 2 חממה 5% humidified ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג את התמיינות התאים העצבית של תאי SH-SY5Y, תאים שטופלו באמצעי תקשורת נוספת עם תוספת חומצה רטינואית מיקרומטר 10 (ע"ר) למשך 7 ימים עם תקשורת השתנה בכל ימים. ביום 7, תאים מוכנים להיות בלחץ. </li></ol> 2. ציוד לחץ קבוע: Kolsky בר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בר Kolsky, דהveloped על ידי 1 Kolsky בשנת 1949, נעשה שימוש כדי למדוד את המאפיין המכאני של חומר בקצב טעינה גבוהה מאוד. המנגנון מורכב משני ברים עם מדגם דגש על קשר בין הסורגים. גל לחץ, יצר בשורת האירוע, מתפשט לדוגמא שבו הגל מתפצל לגל משתקף ומשודר. המתח במדגם פרופורציונלי לגל המשודר. במחקר זה, אנו מנצלים קאמריים pressurization תא כדי להיות ממוקם בין שתי חפיסות Kolsky הגדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני ברי מסגסוגת האלומיניום (כל 6-מ 'אורך) מושעים על ידי מסבי נחושת מיושרת, ובתא לחץ קבוע תא מבחנה היא דחוק בין הסורגים. בר מעלה הזרם הוא בשורת התקרית עם מסת £ 130 נצמדה אל קצה אחד. מהדק חיכוך ממוקם במקום כזה שייתן את משך הדופק הרצוי. על ידי העוסק במהדק והידוק שקע מספריים בין המסה ותמיכת טעינה, סעיף מהדק המסה של בר האירוע הוא ג מראשompressed לרמה הרצויה. מכריח את בורג מחורצים הנועל את התפס להפסקה פתאומית במערכת הידראולית משחרר דחיסה מראש מאוחסנת במהירות ובכך יוצר לחץ דופק. זה מתפשט דרך סרגל האירוע, כונני הבוכנה הקאמרית הבדיקה, וpressurizes הנוזל ותאים בתוך התא אימפולסיבית. על הלחץ הקאמרי בתור יוזם דופק לחץ מתפשט במורד הבר המשודר. המתחים הקשורים בפולסים הלחץ בברים נמדדים במדדים מתחמים גבוהים התנגדות מתח נרגשים עד 45 וולט. אותות המד נרשמים עם אוסצילוסקופ דיגיטלי בתדר MHz 1 כהיסטורית טעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתא על לחץ תא מבחנה מורכבת מבוכנת צילינדרים. הצילינדר יש קוטר 2.6 סנטימטר וסנטימטר קוטר פנימי 3.8 חיצוני, ויש לו חור קטן טפח בבסיס של החלל. החור משמש כאוויר ואוורור נוזלים עודף במהלך התקנת מדגם תא. הבוכנה ארוכה 7.5 סנטימטריםוהוא עשוי מאותו חומר בר. הבוכנה היא עטופה עם שתיים או שלוש שכבות של הקלטת של השרברב (טפלון), המשמשות כחותם חיכוך נמוך. הכובע הסופי הוא 32 מ"מ ארוך ויש לו שני ברגי נירוסטה קטנות שמהדקים את coverslips הזכוכית (שבתאים בתרבית) במהלך הטעינה. </li></ol> 3. Pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל החלקים הקאמריים pressurization מעוקרים באמצעות החיטוי ונשמרים תחת אור UV. ההרכבה של התא מתבצעת בתוך מכסה מנוע תרבית התאים. בורג האוורור בתא עוסק באופן רופף בפתח האוורור בבסיס של החלל. טרום התחמם (37 ° C) תקשורת צמיחה הטריה pipetted לתוך התא בלי בועות. ואז, שקופית זכוכית תא תרבותית היא הרים, וממוקמת על המכסה של הבוכנה (תאים פונים החוצה). הברגים שהחזיקו קטנים הדקו למטה על השקופית כדי להחזיקו במקום. הבוכנה עם שקופית זכוכית תא תרבותית מוכנסת מעט אניn בחלל של החדר, וההרכבה מוטה עם האוורור להיות בנקודה הגבוהה ביותר. בורג האוורור מוסר והבוכנה דחפה לתוך החלל מאלץ את הראשון בועות אוויר, ואז נוזלים העודפים. כך או סימון הפניה או לנענע משמש כמדריך על מנת להבטיח את אותו נפח תקשורת התרבות לכל מבחן. הממד הצירי של התקשורת בחדר הוא כ 6 מ"מ. לטהר את בורג האוורור ולהחליף אותו כדי להפוך את המים הקאמריים הדוק. הקאמרי לא צריך לדלוף תחת עומס סטטי זו, אם כן, הטפלון לעטוף צריך להיות מוחלף או מחוזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, מערכת בר Kolsky מתאפסת. המסה הכבדה תועבר חזרה למיקום המקורי ובורג נעילה חדשה מחליף את שימוש (שבור). לעסוק בורג הנעילה החדש עם הידראוליקה לכ 200 psi. השתמש במספרי השקע כדי לדחוס את חלק הטעינה מראש של בר האירוע ללחץ קצת יותר גבוה מהערך הרצוי, ולאחר מכן לגבות אותו לעסוק חיכוך מלאבורגו של ג'ק. רכישת הנתונים כעת חמושה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקאמרי pressurization התא התאסף הוא רכוב לתוך המערכת. הוא ממוקם בבלוק V הנתמך על ידי מעבדת שקע מספריים קטן ומיושר עם שני הפסים. משמנים כל ממשק עם שכבת גריז אור ולשפשף את המשטחים הנדחפים יחד כדי לחסל את כל מרווחי אוויר שביניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המבחן עכשיו הוא מוכן להמשיך. בורג נעילת המהדק הוא נאלץ לשבור על ידי שאיבת נהג המהדק ההידראולי במהירות. המהדק יפריד ורכישת הנתונים צריכה להציג את התוצאות. היסטורית pressurization התא נקבעה מהמדידות של המד הבר המשודר. אם הבר מועבר משמש הוא מספיק זמן, זה אמור להיות רק מההפרעה הראשונה שהנקודה שבה המדידות מראות לחץ שלילי. משך הדופק מועבר עשוי להיות קצר יותר מדופק האירוע אם בועה היא לכוד. הגודל לא יכול להגיע לזה של דופק האירוע, אבל זה צריך להיות מספיק לוןגרם מישור לפני הפריקה. אחרת, או בועת אוויר גדולה בתא האטום או חוסר תיאום בין ההרכבה וברה אולי התרחשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז קאמרי pressurization התא מוסר ומפורק בתוך ברדס תרבות התא. בורג האוורור מוסר והבוכנה נחלצה מהתא. שקופית זכוכית תא התרבותית נלקחת מהקצה של הבוכנה. </li></ol> 4. הערכת התנהגות תא לחץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר על לחץ, התאים ניתן יהיו לבדוק באופן מיידי או מודגרות נוסף לבדיקה מאוחר יותר. עם תהליכי תפעול אספטיים נאותים, לטווח ארוך לאחר הדגירה אפשרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי לחץ יכולים לבדוק את כל טכניקות הביולוגיה המולקולריות ותאיות. באופן ספציפי לתא על לחץ עצבי, כדי לחקור את הפיסיולוגיה התאית ומולקולרית בתנאי TBI, מבחני הערכת שינויים בלחץ מושרה בתולדת neurite, שינוי microtubule cytoskeletal, expre גן העצביssion, אפופטוזיס, וכו ', ניתן לבצע. כדגימות בקרה סלולרית, תאים שהם בתרבית באותו זמן, בתוך חדר pressurization לאותה תקופת זמן, אבל לא בלחץ משמשים (מה שנקרא, חדר בקרה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכת השינויים בתולדת neurite, תאי בקרת לחץ וקאמריים נבחנים על ידי מיקרוסקופ אופטי מייד לאחר pressurization וh 1 ו 24 שלאחר הדגירה. דוגמה לתמונות תא עצביות מוצגת בחלק 'נציג התוצאות' (איור 2). שינוי האורך neurite ניתן לכמת מכתים immunofluorescent יקטין וניתוח תמונה. תאים קבועים עם 4% פתרון w / v paraformaldehyde, נשטף עם 0.05% חיץ v / v Tween-20 רחצה, וpermeabilized עם 0.1% X-100 פתרון v / v טריטון. לאחר חסימה עם 1% פתרון w / v שור אלבומין, תאים מודגרת עם isothiocyanate tetramethylrhodamine (TRITC)-מצומדות phalloidin. תמונות Immunofluorescent של התאים נלקחות באמצעות ניאוןמיקרוסקופ ואורכי neurites לתאים דחוסים ובקרה לכמת באמצעות ImageJ התוכנה (NIH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את neurites יכול להיות מזוהה כאקסונים או דנדריטים. על מנת להעריך את השינויים מורפולוגיים באקסונים או דנדריטים, הניסויים שתוארו לעיל ניתן לחזור באמצעות נוגדני גילוי כל מבנה, כלומר, neurofilament נוגדן (NF) לאקסונים וחלבון נוגדני microtubule המשויך (MAP2) לדנדריטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microtubules הוא אחד ממרכיבי המפתח של cytoskeletal נוירונים, והניזק לmicrotubules שמש כסמן של פגיעה עצבית. 2 microtubule ניתן דמיין immunofluorescently באמצעות נוגדני β-טובולין. תאים הם קבועים לאחר שעות 0 ו 24 של פוסט על לחץ, מוכתמים בנוגדן β-טובולין, ונצפו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את ההשפעה על לחץ אימפולסיבית על ביטוי גנים עצבי ואפופטוטיים, הסך RNA מופק מתאי לחץ ושליטה. Genביטוי דואר ניתן לבדוק על ידי ביצוע כמותית RT-PCR או בזמן אמת RT-PCR, בדומה לפרוטוקולים שפורסמו. 3 </li></ol> 5. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1. דוגמה של פרופיל לחץ מוחל על התאים בתוך תא לחץ הקבוע. מנגנון בר Kolsky יוצר הצלחת רמת מגפ"ס 2, pressurization אימפולסיבית הסוג יחיד דופק עם משך זמן של כ -0.7 אלפיות שני. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. דוגמה של תגובה עצבית לתא על לחץ אימפולסיבית. תאי SH-SY5Y חשוף ללחץ קבוע אימפולסיבית בהתמוטטות 2 מגפ"ס תכנית ברורה neurite / האקסון יחסית לתאי בקרה קאמרית. 6. קשיים ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשכת איטום הוא אחד המכשולים העיקריים שיש להתגבר עליהם. זה foאונד שדיסקים רחבים עם o-טבעות יש לך בעיה של ניקור וחיכוך מוגבר. על מנת להסיר את השפעות החיכוך, כמו גם למנוע ניקור, שיטה פשוטה של ​​מקליטת בוכנה עם הקלטת של שרברב הטפלון משמש. זה פותר את הבעיות ומייצר רמה ומשך לחץ רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התנהגות תא לחץ עצבית, במיוחד כשבוחן את מנגנון TBI משני או השפעות לטווח ארוך יותר, יש לבחון לאחר זמן רב לאחר דגירה. תא תא המכיל חשוף לפוטנציאל לא סטרילי תנאים תוך מעבר לבר Kolsky, pressurizing, ועל חזרה למכסת מנוע תרבית התאים. עם עיקור מראש של חלקים הקאמריים ותפעול תקין בהרכבה / פירוק של שקופית תא התרבותי ותא בתוך מכסה מנוע תרבית התאים, בטווח ארוך יותר לאחר הדגירה אפשרית עד מספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השחזור של הנתונים הוא פרמטר חשוב בניסויי גירוי מכאניים סלולריים. למכשיר שלנו, reproducibility בתגובת תאים עצביות נקבע כיצד רצוי פרופיל pressurization אימפולסיבית, היא ברמת לחץ ומשך, מתקבל שוב ושוב. מכיוון שאנו להקליט את פרופיל הלחץ התקבל לכל על לחץ, את הנתונים מפרופיל תגובת תא לחץ לא רצוי ניתן לשלול באופן ידני לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים השלמים pressurization, כולל קאמרית הרכבה, העברה ולעלות בKolsky הבר, על לחץ, העברת גב, וקאמרי פירוק, לוקחים פחות מ 10 דקות. השקופית תרבותי התא הבאה ניתן בלחץ מייד לאחר pressurization הקודם. לפיכך, מספר מספיק של ניסויי pressurization ניתן להשלים ביעילות. ההגדרה שלנו מנצלת 18 coverslips זכוכית בקוטר מ"מ. ניסוי pressurization אחד לא מספק מספיק חלבונים למערב immunoblotting בשל גודל מצע (וגם בין שאר משום שחלק מתאי הלחץ הם מת). שלושה ניסויים חוזרים ונשנים אודות pressurization לספק כמות חלבון הדרושה לimmunoblotting. שוב, השחזור נבדק כל זמן עם פרופיל הלחץ. </li></ol>

<ol><li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Prec.+Phys.+Soc.+London%22%5BJournal%5D)">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity%2C+microtubule+disassembly%2C+and+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li>
<li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li>
<li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li>
<li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosive+blast+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li>
<li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+percussion+barotrauma+chamber%3A+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li>
<li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li>
<li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li>
<li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Lat.+Am.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

רבים בטכניקות מבחנה ניסיונית כבר ניסינו לחקר ניזק לתאי מוח בתנאי TBI. אלה כוללים נוירון / מתיחת זרימה מושרה מתח astrocyte, גזירה, ירידה במשקל, חתך חרט, ליזר חיתוך רוחב, lithotripsy, וכו &#39;4,5 זה כבר להניח שoverpressure בזמן קצר הוא גורם פיזי דומיננטי לTBI. 6,7 במיוחד , שוקווייב של פיצוץ TBI יש משך פעימה של סדר אלפיות שניים. 4 מבוססים על הנחה ותצפית זו, קאמרית הברומטר מסוגל pressurization החולף פותח ומשמש להערכת התנהגות תא מוח בתנאי TBI. לדוגמה, בהקשת barotrauma הקאמרי נוזל דופק לחץ עם משך 20-30 אלפיות ארוכים ולחץ שיא של עד 0.5 מגפ&quot;ס שבו בודק את התנהגות תא גלייה האנושית תחת TBI. 6 לאחרונה, VandeVord et al. 7 מתכת המשמשת קאמרי הברומטר כדור הפוגע לבחון את תא astrocyteהתנהגות תחת TBI אבל כדור המתכת בולטת פיק פולסים לחץ מרובים. במחקר זה, פתח מכשיר סלולרי על לחץ שיוצר רומן pressurization אימפולסיבית הסוג יחיד דופק. המכשיר פותח על בסיס הגדרת בר Kolsky, אשר שמש כמנגנון בדיקת חומר ב8 והשני של המחקרים שלנו. 1,9 יכולת בדיקת החומר של Kolsky הבר בקצב טעינה גבוה מאוד שונתה כדי שתוכל תחול overpressure סוג היחיד דופק לתאים בתרבית בתוך תא לחץ הקבוע (איור 1). אנחנו יכולים לשלוט בהצלחה את העצמה ומשך overpressure אימפולסיבית. כתגובת תא נציג, הראינו כי ב2 תאי לחץ MPA SH-SY5Y עצביים להציג neurite משמעותי ואובדן אקסונלית בהשוואה לתאי בקרה קאמרי ללא לחץ. לסיכום, אנו פתחנו מנגנון רומן אימפולסיבי תא לחץ קבוע באמצעות Kolsky תוכנן במיוחדמכשיר בר והפגין שימוש הפוטנציאל שלו בחקירת תגובת תא עצבית בתנאי TBI. אנחנו גם לציין כי טכניקה זו היא מאוד תכליתית שביכול להיות חשוף לכל סוג של תאים ללחצים אימפולסיביות ברמה ומשך שונים. לכן, מכשיר יכול לשמש כדי לחקור את ההתנהגות אימפולסיבית mechanotransduction הסלולרית לחץ המושרית, לא רק לפגיעה בתאים, אלא גם להמרצת התאים חיוביים בתפקודם ונחישות גורל.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) תאי neuroblastoma אדם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 18 coverslips זכוכית בקוטר מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת סלולרית תרבות: DMEM, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין סטרפטומיצין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצה רטינואית (10 מיקרומטר) לneurogenesis התרמה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר pressurization אימפולסיבית Kolsky בר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קאמרי pressurization תא בוכנת צילינדרים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגי נירוסטה לאבטחת coverslip התרבותי תא על הבוכנה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גריז לממשקים בין תא התא וKolsky הבר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אספקת ביולוגיה מולקולרית כללית להערכת תגובת תא לpressurization (מקבע, נוגדנים, צבע זרחני, אספקת PCR, וכו &#39;) </li></ul>

pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים לחקר פגיעה מוחית טראומטי

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

ניסוי pressurization רומן אימפולסיבי תא פותח באמצעות מכשיר בר Kolsky לחקור פגיעה מוחית טראומטית פיצוץ מושרה (TBI). אנו מראים במאמר זה וידאו איך pressurization אימפולסיבית TBI-רלוונטי הפיצוץ מוחל על תאי העצב במבחנה. זו מושגת על ידי שימוש בדופק לחץ מבוקר היטב שנוצר על ידי מכשיר בר Kolsky מיוחד, עם היסטוריה של לחץ מלאה בתוך התא על לחץ התא המוקלט. תאים עצביים לחץ נבדקים מייד לאחר pressurization, או יותר מודגרות לבחון את ההשפעות ארוכות הטווח של לחץ קבוע על אימפולסיבית תולדה neurite / אקסונלית, ביטוי גנים עצבי, אפופטוזיס, וכו &#39;אנחנו נצפינו שpressurization אימפולסיבית בסביבות 2 מגפ&quot;ס גורם יחסי אובדן neurite מובחן לתאים ללא לחץ. הטכניקה שלנו מספקת שיטה חדשה לחקור את המנגנונים מולקולריים / סלולריים של פיצוץ TBI, דרך pressurization אימפולסיבית של תאי מוח ביחסי הציבור מבוקרים היטבessure עצמה ומשך זמן.

ניסוי pressurization רומן אימפולסיבי תא פותח באמצעות מכשיר בר Kolsky לחקור את המנגנונים מולקולריים / סלולריים של פגיעה בפיצוץ גרם מוח הטראומתית.

Pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים לחקר פגיעה מוחית טראומטי

ניסוי חדש להגשמה אימפולסיבית של תאי לחץ פותח באמצעות מכשיר Kolsky bar כדי לחקור פגיעות מוחית טראומטית (TBI) הנגרמת מהדף. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפעיל ולעקוב אחר לחץ אימפולסיבי של תאי מוח בתרבית לצורך מחקר של פגיעה מוחית טראומטית. דבר זה מושג תחילה על ידי השראה של דיפרנציאציה נוירונלית של תאים שגודלו באמצעות רטינואיק אסיד. לאחר מכן, תאים נוירונליים מונחים במכשיר להפעלת לחץ על תאים המבוסס על ksky bar ונחשפים ללחץ אימפולסיבי בעוצמה ובמשך זמן הרלוונטיים לפגיעה מוחית טראומטית הנגרמת מהדף.לבסוף, התאים נסמכים לבדיקות ביולוגיה מולקולרית כדי להעריך נזקים תאיים ומנגנונים אפשריים של פגיעה מוחית טראומטית. התוצאות מבדיקת המיקרוסקופיה מראות מוות של תאי עצב ואובדן מבני של אקסונים של נוריטים בלחץ דחפי בעוצמה של two megapascal ובמשך 0.7 millisecond. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון פגיעת נוזלים (fluid percussion), הוא היעדר מקטעים של לחץ שלילי והשליטה המדויקת במשך הזמן.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של פגיעות מוח טראומטית (TBI), כגון הסף למות תאי עצב או לפגיעה כת ফাנקציה של לחץ דחפי, עוצמה, משך וצורת העמסה. למרות ששיטה זו שימשה עד כה בקבוצה שלנו לחקר TBI הנגרמת מהדף, היא יכולה לשמש גם עבור סוגים אחרים של פגיעות מוח טראומטיות, כגון TBI הנגרמת מהבטחה. ההליך יודגם על ידי Matthew, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה של פרופסור Chen fang, ועל ידי li ha, טכנאי מהמעבדה שלי.ניסוי זה משתמש במוט Ksky המוגדר כמכשיר להפעלת לחץ על תאים. המכשיר מורכב משני מוטות סגסוגת אלומיניום באורך שישה מטרים התלויים על ידי מיסבי פליז מיושרים ומתא להפעלת לחץ על תאים in vitro. מתא הפעלת הלחץ על התאים, הממוקם בין שני המוטות, מורכב מבוכנה וגליל.בבסיס החלל של הגליל ישנו חור קטן מוברגה, המשמש לשחרור אוויר ונוזלים עודפים במהלך התקנת דגימת התאים. הבוכנה עשויה מאותו צינור שבו עשוי המוט, והיא עטופה בשתי או שלוש שכבות של סרט טפלון. מכסה הקצה מקבע את כיסויי הזכוכית באמצעות שני ברגי נירוסטה קטנים.הדגמה זו משתמשת בתאי נוירובלסטומה אנושיים מסוג SH SY 5Y. עם זאת, הפרוטוקול רלוונטי למודלים רבים של תרביות תאים. התאים נזרעים על לביות זכוכית בקוטר 18 מילימטר בצפיפות של 3000 תאים לסמ"ר.בזמן הדגרה ב-DMEM מועשר, עוררו את התמיינות התאים על ידי הוספת 10 micromolar של retinoic acid למצע למשך שבעה ימים, תוך החלפת המצע מדי יומיים. ביום השביעי, התאים יציגו מבנה אקסוני של נוריטים מפותח היטב ויהיו מוכנים להפעלת לחץ. סטריליזו את כל חלקי תא הלחץ באמצעות אוטוקלאב ואחסנו אותם תחת אור UV בזמן הרכבת התא.בתוך מנדף תרביות, ודא שבורג הפתח בתא מוברג באופן רופף לתוך פתח האוורור. בבסיס החלל, מלא את התא במצע גידול חמים שהוכן טרי. לאחר מכן, הברג זכוכית לכיסוי תרבית תאים על מכסה הבוכנה כאשר התאים פונים החוצה, והכנס בזהירות את הבוכנה לתוך חלל התא.הסר את בורג השחרור, הטה את פתח השחרור כלפי מעלה ודחף את הבוכנה לתוך התא עד לקו ייחוס שנקבע מראש. פעולה זו תותיר עומק נוזל של כשישה מילימטרים בתוך תא הלחץ של התא. הימנע מהחדרת בועות, חטא את בורג השחרור והחזר אותו למקומו כדי להפוך את התא לאטום למים.התא לא אמור לדלוף תחת העומס הסטטי. הגדירו מחדש את מערכת מוט ה-Ksky. העבירו את המסה הכבדה חזרה למיקומה המקורי והחזירו את בורג הנעילה.בור הנעילה שומר על כוח לחיצה המונע את תנועת מוט הפגיעה עד לשבירת הפינים. הדק את בור הנעילה החדש באמצעות ג'ק הידראולי עד ללחץ של כ-200 PSI. השתמש במגבה מספריים כדי לדחוס את חלק הטעינה המוקדמת של מוט הפגיעה ללחץ הגבוה מעט מהערך הרצוי, ולאחר מכן שחרר אותו מעט כדי להפעיל את כל החיכוך של בורג הג'ק. כעת הגדר את מערכת רכישת הנתונים, כיוון שתהליכי הלחצון נמשכים כמילישנייה אחת.הגדירו תדר דגימה של 1 MHz באמצעות מדי-מאמץ של 2000 ohm במעגל גשר ווייטסטון. יש להגדיר את המתח ל-45 volts במוט המעביר. התקינו את תא התא עם הבוכנה הפונה לכיוון המוט המעביר.הנח את תא התאים בתוך V block הנתמך על ידי ג'ק מעבדה קטן ומיושר עם שני המוטות. גרז קלות כל ממשק והסר כל בועת אוויר בין המשטחים הנצמדים על ידי שפשוף עדין שלהם זה בזה. כעת המערכת מוכנה.הפעילו את רכישת הנתונים ובצעו את הבדיקה על ידי שאיבה מהירה של מניע הסגור ההידראולי. פעולה זו גורמת לשבירת בורג הנעילה, מה שמוביל להפרדת הסגור ולהעברת גל לחץ לתאים. לאחר הבדיקה, הוציאו את הפסייה מהתא בתוך מנדף תרבית והמשיכו בהערכת התנהגות התאים.עם ניסיון, ניתן להשתמש במכשיר להפעלת לחץ על כ תשעה סליידים של תרביות תאים בשעה. בעת ניתוח הקריאה, עשויות להופיע שגיאות הנובעות מבועות אוויר בתחילת אות פס המעבר, אם כי אלו אינן נראות בהדגמה זו.אם פס הנבליות (transmittance bar) ארוך מספיק, אזי הנתונים החשובים ביותר צריכים להתחיל עם ההפרעה הראשונה ולהסתיים במקום שבו המדידות מראות לחץ שלילי; קריאת מתח זו פרופורציונלית למאמץ שחוו התאים באמצעות ניתוח מד-מאמץ (strain gauge). משך הפולס המועבר עשוי להיות קצר יותר מהפולס הפוגע. אם בועה קטנה נלכדה בנוזל בתוך תא ערכת הלחץ, עוצמת הפולס המועבר עשויה שלא לעלות על זו של הפולס הפוגע, אך עליה להיות בעלת מישור (plateau) ארוך מספיק לפני פריקת העומס.במידה ולא, ייתכן שבועת אוויר גדולה נלכדה בתא האטום, או שההרכבה והמוט אינם מיושרים. לאחר ההלחץ, ניתן לבחון את התאים באופן מיידי או להמשיך בדגירה לבדיקה מאוחרת יותר. השוו את התאים שהולחצו לתאי הביקורת בתא אשר טופלו באופן זהה אך לא הולחצו, כדי להעריך שינויים באורך הניוריטים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית בנקודות זמן שונות לאחר הדגירה.ניתן להשתמש בצביעה אימונופלואורסצנטית של אקטין כדי להעריך שינויים בשלד התא. כמו כן, ניתן להשתמש בנוגדן לחלבון המקושר למיקרוטובולי 2 (MAP2) כדי להדמיות שינויים באחד מהסמנים הנוירונליים המרכזיים.כדי להעריך את השפעת הלחץ האימפולסיבי על ביטוי גנים נוירונליים ואפופטוטיים, ניתן להשתמש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות כגון R-T-P-C-R במידת הצורך. ניתן לאסוף ליזאטים של תאים בכמות מספקת עבור immuno blotting מכמה דגימות תאים שהופעלו תחת לחץ זהה. בדוגמה זו, במערך הלחץ, מכשיר ה-ksky bar יישם בהצלחה לחץ אימפולסיבי מסוג פולס בודד בעוצמה של 2 megapascal ובמשך של כ-0.7 millisecond על התאים הנוירונליים המטופחים, כפי שניתן לראות בתמונות המיקרוסקופ האופטי; תאי עצב אנושיים מסוג SHSY five Y שהוכפפו ללחץ אימפולסיבי של 2 megapascal מראים פירוק בולט של אקסוני הנויריטים ביחס לתאי ביקורת שלא הופעלו תחת לחץ.בעת ביצוע פרוצדורה זו, יש להחזיק תמיד את תא לחץ הנוזלים בצורה זו ולעולם לא כך, שכן הדבר יחשוף את התאים ללחץ שלילי לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי העצבים לחקור את מנגנון התא בפגיעת ראש טראומטית תחת תנאי לחץ מבוקרים. אנו מודים על התמיכה במימון ממרכז Army UNL למכניקת טראומה.

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגים את ההליך לגרימת פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת פתוחה בעכבר על ידי ביצוע חתך בגולגולת קו האמצע, קידוח דרך הגולגולת והסרת דש העצם כדי לחשוף את קליפת המוח, והפעלת לחץ גבוה כדי לגרום לטראומה. לאחר מכן תופרים את הפצע כדי להכין את מודל העכבר לניסויים הבאים.

יצירת מודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית באמצעות גשושית אימפקטור

במבחנה מודלים פגיעה מוחית טראומתיים מפותחים להתרבות בעיוות מוח vivo. פגיעה הנגרמת על מתיחה כבר מועסק להאסטרוציטים, נוירונים, תאי גלייה, אבי העורקים, ותאי האנדותל במוח. עם זאת, המערכת שלנו משתמשת במחסום דם מוח (BBB) ​​דגם בעל תכונות שמהוות מודל לגיטימי של BBB להקים במודל TBI מבחנה.

למתוח בתאי אנדותל כלי הדם במוח (cEND) כ<em&gt; במבחנה</em&gt; פגיעה מוחי טראומטי דגם של מחסום דם המוח

פגיעות מוח טראומטיות (TBI) נשארות בעיה בריאותית חמורה. באמצעות מודל ניתוח פגיעה מבוקרת בקליפת המוח, ניתן לבצע מחקר על ההשפעות של TBI ושיטות טיפול אפשריות.

השפעת דגם קליפת המוח מבוקר לפגיעה מוחית טראומטית

מאמר זה מתאר מודל הרומן של פגיעה מוחית טראומטית פגיעה עיקריים. צינור אויר מונחה הלם משמש כדי לחשוף במבחנה בתרבויות פרוסה בהיפוקמפוס העכבר גל הלם יחיד. . זהו פרוטוקול פשוטה ומהירה ליצירת פגיעה ברקמות המוח לשחזור עם תפוקה גבוהה...

מודל הרומן במבחנה של פגיעה מוחית טראומטית הפיצוץ

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור שיטות ex-vivo תגובתיות וסקולרית נחישות בעקבות פציעת מוח טראומטית פגיעה עיקריים (bTBI) באמצעות המקטעים מבודדות, מווסת, מכרסם האמצעי מוחי עורקי (MCA). אינדוקציה bTBI מושגת באמצעות צינור הלם, הידוע גם בשם התקן סימולטור הפיצוץ מתקדם (ABS).

השפעות הפיצוץ-induced Neurotrauma על מכרסם מווסת המזרח התיכון העורקים המוחיים

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום TBI חמורה עם פציעה לרוחב הכלי נקישה (FPI) מודל בוגרים, גברים וויסטאר חולדות. אנו גם להדגים את השימוש של מערכת טלמטריה אלחוטית לאסוף רציפה הקלטות וידאו EEG ולפקח על אפילפטית בעקביות פוסט טראומטית epileptogenesis.

שימוש במערכת וידאו-EEG אלחוטית לניטור אפילפטית פולט בעקבות נוזל לרוחב-פגיעה מוחית טראומטית

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור האינדוקציה של פגיעה מוחית טראומטית מורמין באמצעות ראש פתוח השפעה בקליפת המוח.

מודל מורנה של השפעה בקליפת המוח הנשלטת על אינדוקציה של פגיעה מוחית טראומטית

אנו מציגים כאן פרוטוקול של מודל גל פיצוץ למכרסמים לחקור השפעות נוירוביולוגיות ופתולוגיות של פגיעה מוחית טראומטית קלה עד בינונית. הקמנו מערך מונע גז, ספסל עליון מצויד בחיישני לחץ המאפשרים דור אמין וניתן לשחזור של פגיעה מוחית קלה עד בינונית הנגרמת על ידי פיצוץ.

מודל גל פיצוץ בעצימות נמוכה להערכה פרה-קלינית של פגיעה מוחית טראומטית קלה בראש סגור במכרסמים

דימום אינטרפרנכימלי ודלקת עצבית המלווה בחבלה מוחית עלולים לגרום לפגיעה מוחית משנית חמורה. פרוטוקול זה מפרט מודל השפעה קליפתית מבוקרת עכבר (CCI) המאפשר לחוקרים לחקור דימום, קונטוזיה ותגובות חיסוניות פוסט-טראומטיות ולחקור טיפולים פוטנציאליים.

מודל השפעה קליפת המוח מבוקרת פרה-קלינית עבור דימום טראומטי, חבלה ודלקת עצבית

מוצגות כאן שיטות ליצירת חשיפות חוזרות ונשנות לפיצוץ בעוצמה נמוכה באמצעות עכברים.

מידול חשיפה חוזרת ונשנית מאוד לפיצוץ ברמה נמוכה בעכברים

פרוטוקול זה מתאר מערכת אוויר מותאמת אישית בלחץ יתר שנועדה לגרום לפציעות במערכת העצבים המרכזית (CNS) במערכת סגורה בעכברים, כולל טראומות עיניים, מוח וחוט השדרה. מטרת פרוטוקול זה היא לספק מסגרת לחוקרים להתאים ולהרחיב בקלות את המערכת למחקרי הטראומה הייחודיים שלהם במערכת העצבים המרכזית.

מערכת לפגיעה מוקדית וסגורה במערכת העצבים המרכזית

חקור מנגנוני פציעת מוח טראומטי באמצעות לחץ אימפולסיבי מבוקר בתאים עצביים תרבתיים. השיטה מאפשרת לחקור את סף מוות התאים ותגובות מולקולריות לפציעה.

Pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים לחקר פגיעה מוחית טראומטי

גלה סרטונים נוספים