Pressurization אימפולסיבית של תאים עצביים לחקר פגיעה מוחית טראומטי

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפעיל ולעקוב אחר לחץ אימפולסיבי של תאי מוח בתרבית לצורך מחקר של פגיעה מוחית טראומטית. דבר זה מושג תחילה על ידי השראה של דיפרנציאציה נוירונלית של תאים שגודלו באמצעות רטינואיק אסיד. לאחר מכן, תאים נוירונליים מונחים במכשיר להפעלת לחץ על תאים המבוסס על ksky bar ונחשפים ללחץ אימפולסיבי בעוצמה ובמשך זמן הרלוונטיים לפגיעה מוחית טראומטית הנגרמת מהדף.

לבסוף, התאים נסמכים לבדיקות ביולוגיה מולקולרית כדי להעריך נזקים תאיים ומנגנונים אפשריים של פגיעה מוחית טראומטית. התוצאות מבדיקת המיקרוסקופיה מראות מוות של תאי עצב ואובדן מבני של אקסונים של נוריטים בלחץ דחפי בעוצמה של two megapascal ובמשך 0.7 millisecond. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון פגיעת נוזלים (fluid percussion), הוא היעדר מקטעים של לחץ שלילי והשליטה המדויקת במשך הזמן.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של פגיעות מוח טראומטית (TBI), כגון הסף למות תאי עצב או לפגיעה כת ফাנקציה של לחץ דחפי, עוצמה, משך וצורת העמסה. למרות ששיטה זו שימשה עד כה בקבוצה שלנו לחקר TBI הנגרמת מהדף, היא יכולה לשמש גם עבור סוגים אחרים של פגיעות מוח טראומטיות, כגון TBI הנגרמת מהבטחה. ההליך יודגם על ידי Matthew, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה של פרופסור Chen fang, ועל ידי li ha, טכנאי מהמעבדה שלי.

ניסוי זה משתמש במוט Ksky המוגדר כמכשיר להפעלת לחץ על תאים. המכשיר מורכב משני מוטות סגסוגת אלומיניום באורך שישה מטרים התלויים על ידי מיסבי פליז מיושרים ומתא להפעלת לחץ על תאים in vitro. מתא הפעלת הלחץ על התאים, הממוקם בין שני המוטות, מורכב מבוכנה וגליל.

בבסיס החלל של הגליל ישנו חור קטן מוברגה, המשמש לשחרור אוויר ונוזלים עודפים במהלך התקנת דגימת התאים. הבוכנה עשויה מאותו צינור שבו עשוי המוט, והיא עטופה בשתי או שלוש שכבות של סרט טפלון. מכסה הקצה מקבע את כיסויי הזכוכית באמצעות שני ברגי נירוסטה קטנים.

הדגמה זו משתמשת בתאי נוירובלסטומה אנושיים מסוג SH SY 5Y. עם זאת, הפרוטוקול רלוונטי למודלים רבים של תרביות תאים. התאים נזרעים על לביות זכוכית בקוטר 18 מילימטר בצפיפות של 3000 תאים לסמ"ר.

בזמן הדגרה ב-DMEM מועשר, עוררו את התמיינות התאים על ידי הוספת 10 micromolar של retinoic acid למצע למשך שבעה ימים, תוך החלפת המצע מדי יומיים. ביום השביעי, התאים יציגו מבנה אקסוני של נוריטים מפותח היטב ויהיו מוכנים להפעלת לחץ. סטריליזו את כל חלקי תא הלחץ באמצעות אוטוקלאב ואחסנו אותם תחת אור UV בזמן הרכבת התא.

בתוך מנדף תרביות, ודא שבורג הפתח בתא מוברג באופן רופף לתוך פתח האוורור. בבסיס החלל, מלא את התא במצע גידול חמים שהוכן טרי. לאחר מכן, הברג זכוכית לכיסוי תרבית תאים על מכסה הבוכנה כאשר התאים פונים החוצה, והכנס בזהירות את הבוכנה לתוך חלל התא.

הסר את בורג השחרור, הטה את פתח השחרור כלפי מעלה ודחף את הבוכנה לתוך התא עד לקו ייחוס שנקבע מראש. פעולה זו תותיר עומק נוזל של כשישה מילימטרים בתוך תא הלחץ של התא. הימנע מהחדרת בועות, חטא את בורג השחרור והחזר אותו למקומו כדי להפוך את התא לאטום למים.

התא לא אמור לדלוף תחת העומס הסטטי. הגדירו מחדש את מערכת מוט ה-Ksky. העבירו את המסה הכבדה חזרה למיקומה המקורי והחזירו את בורג הנעילה.

בור הנעילה שומר על כוח לחיצה המונע את תנועת מוט הפגיעה עד לשבירת הפינים. הדק את בור הנעילה החדש באמצעות ג'ק הידראולי עד ללחץ של כ-200 PSI. השתמש במגבה מספריים כדי לדחוס את חלק הטעינה המוקדמת של מוט הפגיעה ללחץ הגבוה מעט מהערך הרצוי, ולאחר מכן שחרר אותו מעט כדי להפעיל את כל החיכוך של בורג הג'ק. כעת הגדר את מערכת רכישת הנתונים, כיוון שתהליכי הלחצון נמשכים כמילישנייה אחת.

הגדירו תדר דגימה של 1 MHz באמצעות מדי-מאמץ של 2000 ohm במעגל גשר ווייטסטון. יש להגדיר את המתח ל-45 volts במוט המעביר. התקינו את תא התא עם הבוכנה הפונה לכיוון המוט המעביר.

הנח את תא התאים בתוך V block הנתמך על ידי ג'ק מעבדה קטן ומיושר עם שני המוטות. גרז קלות כל ממשק והסר כל בועת אוויר בין המשטחים הנצמדים על ידי שפשוף עדין שלהם זה בזה. כעת המערכת מוכנה.

הפעילו את רכישת הנתונים ובצעו את הבדיקה על ידי שאיבה מהירה של מניע הסגור ההידראולי. פעולה זו גורמת לשבירת בורג הנעילה, מה שמוביל להפרדת הסגור ולהעברת גל לחץ לתאים. לאחר הבדיקה, הוציאו את הפסייה מהתא בתוך מנדף תרבית והמשיכו בהערכת התנהגות התאים.

עם ניסיון, ניתן להשתמש במכשיר להפעלת לחץ על כ תשעה סליידים של תרביות תאים בשעה. בעת ניתוח הקריאה, עשויות להופיע שגיאות הנובעות מבועות אוויר בתחילת אות פס המעבר, אם כי אלו אינן נראות בהדגמה זו.

אם פס הנבליות (transmittance bar) ארוך מספיק, אזי הנתונים החשובים ביותר צריכים להתחיל עם ההפרעה הראשונה ולהסתיים במקום שבו המדידות מראות לחץ שלילי; קריאת מתח זו פרופורציונלית למאמץ שחוו התאים באמצעות ניתוח מד-מאמץ (strain gauge). משך הפולס המועבר עשוי להיות קצר יותר מהפולס הפוגע. אם בועה קטנה נלכדה בנוזל בתוך תא ערכת הלחץ, עוצמת הפולס המועבר עשויה שלא לעלות על זו של הפולס הפוגע, אך עליה להיות בעלת מישור (plateau) ארוך מספיק לפני פריקת העומס.

במידה ולא, ייתכן שבועת אוויר גדולה נלכדה בתא האטום, או שההרכבה והמוט אינם מיושרים. לאחר ההלחץ, ניתן לבחון את התאים באופן מיידי או להמשיך בדגירה לבדיקה מאוחרת יותר. השוו את התאים שהולחצו לתאי הביקורת בתא אשר טופלו באופן זהה אך לא הולחצו, כדי להעריך שינויים באורך הניוריטים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית בנקודות זמן שונות לאחר הדגירה.

ניתן להשתמש בצביעה אימונופלואורסצנטית של אקטין כדי להעריך שינויים בשלד התא. כמו כן, ניתן להשתמש בנוגדן לחלבון המקושר למיקרוטובולי 2 (MAP2) כדי להדמיות שינויים באחד מהסמנים הנוירונליים המרכזיים.

כדי להעריך את השפעת הלחץ האימפולסיבי על ביטוי גנים נוירונליים ואפופטוטיים, ניתן להשתמש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות כגון R-T-P-C-R במידת הצורך. ניתן לאסוף ליזאטים של תאים בכמות מספקת עבור immuno blotting מכמה דגימות תאים שהופעלו תחת לחץ זהה. בדוגמה זו, במערך הלחץ, מכשיר ה-ksky bar יישם בהצלחה לחץ אימפולסיבי מסוג פולס בודד בעוצמה של 2 megapascal ובמשך של כ-0.7 millisecond על התאים הנוירונליים המטופחים, כפי שניתן לראות בתמונות המיקרוסקופ האופטי; תאי עצב אנושיים מסוג SHSY five Y שהוכפפו ללחץ אימפולסיבי של 2 megapascal מראים פירוק בולט של אקסוני הנויריטים ביחס לתאי ביקורת שלא הופעלו תחת לחץ.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, יש להחזיק תמיד את תא לחץ הנוזלים בצורה זו ולעולם לא כך, שכן הדבר יחשוף את התאים ללחץ שלילי לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי העצבים לחקור את מנגנון התא בפגיעת ראש טראומטית תחת תנאי לחץ מבוקרים. אנו מודים על התמיכה במימון ממרכז Army UNL למכניקת טראומה.