פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנתח את קשרי מבנה-פעילות של נוירופפטידים של פרוקי רגליים מסונתזים על ה-gpcr התואם להם. זאת מושג על ידי טרנספקציה של תאי שחלה של אוגר סיני (Chinese hamster ovary), K1 empty cells, עם וקטור ביטוי של ה-GPCR הרצוי כדי לקבל שורות תאים שעברו טרנספורמציה יציבה השגוזרו מתא בודד. כשלב שני, שורת התאים היציבה עוברת טרנספקציה עם פלסמיד קוואראן (quaran plasmid), הנושא את הגן המדווח Gina Quaran למדידת ביולומינסנציה תוך-תאית בבדיקת לוח ביולומינסנציית סידן. לאחר מכן, מבוצעת בדיקת לוח ביולומינסנציית סידן כדי לקבוע את רמות הסידן הציטופלזמי לאחר יישום של ליגנד פפטידי לתאים רקומביננטיים אלה.

התוצאות שהתקבלו מראות הבדלים ביחידות הביולומינצנציה בעקבות יישום של פפטידים בעלי מבנה שונה או ריכוזי פפטידים שונים על התאים הרקומיננטיים, בהתבסס על שחרור סידן תוך-תאי שהופעל כפי שזוהה על ידי הדיווחן corrin בבדיקת הפלטה. היתרון המרכזי בשימוש בקווי תאים קלונליים שהועברו טרנספורמציה יציבה ומבטאים GPCRs רקומיננטיים, על פני טרנדים ופרוטוקולי ביטוי, הוא שרמות ביטוי הרצפטור אחידות יותר, מה שמאפשר עקביות ותוצאות. יתרה מכך, כיוונון חלבון האקווריום למיטוכונדריה מאפשר מדידות סידן רגישות באמצעות ביולומינצנציה המדגימה את הניסוי היום; שני סטודנטים לתארים מתקדמים, shall in lie ו-Simon Kersch, וכן פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי.

כדי להקים קווי תאים יציבים, התחילו בגידול תאי שחלה של אמסטרדם סיני (Chinese hamster ovary, K one empty cells) בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide. תחזקו את תאי הריק במצע גידול עם 1x antibiotic antimycotic לאחר שהתאים גדלים בצורה בריאה. זרקו את תאי ה-Chinese hamster ovary K one לבקבוקי תרבית רקמה מסוג T 25, והצמיחו את התאים למשך לילה במצע גידול ללא אנטיביוטיקה עד שיגיעו לכ-30% confluence.

לפני התעתוק (transfection), הכין וקטור ביטוי DNA המכיל את ה-GPCR הרלוונטי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. ערבב את ה-DNA עם 100 microliters של מצע Optum reduced serum medium.

ערבבו 6 µL של ריאגנט ליפופקציה לתוך 100 µL של מצע F 12 K ללא סרום והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 45 דקות. לאחר ההדגירה, ערבבו בעדינות את תמיסות ה-DNA והליפופקציה בתוספת של טיפות. השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 15 דקות בתוך מבחנה של 15 mL.

ערבבב בעדינות את תערובת הטרנספקציה לתוך 1.8 milliliters של מצע F 12 K טרי בטפטוף. לאחר מכן, שטוף את התאים ב-PBS והוסף את תמיסת הטרנספקציה החדשה הזו לתאים. לאחר דגירה של 18 שעות.

החליפו את המצע למצע F 12 K בתוספת 10% FBS ללא אנטיביוטיקה והדגירו למשך לילה. פצלו את התאים לשני בקבוקוני T 25 עם מצע F 12 K בתוספת 10% FBS ללא אנטיביוטיקה כפי שמתואר בנוהל הכתוב. הדגירו למשך 18 שעות נוספות.

החליפו את המצע במצע סלקטיבי. לאחר מכן, תרבתו את התאים באמצעות המצע הסלקטיבי במשך שלושה עד ארבעה שבועות. תהליך זה יבצע סלקציה לתאים ששילבו את הפלסמיד באופן יציב לתוך ה-DNA הגנומי שלהם.

המשך בתחזוקת התאים באמצעות מצע תחזוקה, והקפא באופן תקופתי את שורות התאים כדי למנוע אובדן במקרה של זיהום בלתי צפוי. כדי לבחור שורות תאים קלונליות, ראשית בצע trypsinization וסבב צנטריפוגה לתאים עם מצע תחזוקה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, השהה את התאים בחמישה מיליליטר של מצע תחזוקה.

הסיר 0.5 milliliters של תרחיף התאים והוסף 4.5 milliliters של מצע תחזוקה טרי כדי להכין דילול של 10 x, והעבר 100 microliters מהדילול של 10 x לתוך 12 בארות של פלטת 96 בארות כדי לבחור תאים בודדים. המשך לבצע דילול סדרתי של 10 x לתאים אלו כ-19 פעמים, כדי להגיע לתרחיף סופי תיאורטי של תא אחד ל-100 microliters, והעבר 100 microliters מכל דילול סדרתי לתוך 12 בארות של פלטת 96 בארות. לאחר 18 שעות של דגירה, בחן את פלטות 96 הבארות תחת מיקרוסקופ אור הפוך או מיקרוסקופ פלואורסצנציה, וסמן בארות שנראה כי הן מכילות תא בודד אחד בלבד או שני תאים שobviosly התחלקו מתא בודד אחד.

יש לעקוב אחר הפלטות מדי יום ולהחליף את המצע מדי שלושה ימים. יש לאפשר לתאים לגדול במשך שבוע אחד עד להגעה לכ-80% confluence. לאחר מכן, יש לשטוף את הבארים המסומנות עם 200 microliters של PBS וטריפסין.

שטפו אותם עם 100 µL של תמיסת PBS trypsin EDTA. הסירו את תמיסת ה-PBS trypsin EDTA. הוסיפו 100 µL של מצע תחזוקה והעבירו את התאים מכל באר מסומנת לבא אחת של פלטת 6 בארות המכילה 1 mL של מצע תחזוקה.

לאחר גידול התאים בלוח בעל שישה בארות למשך שלושה ימים, העבירו את התאים לבקבוקי T 25 בודדים. הקפיאו את קו התאים באופן תקופתי כדי שניתן יהיה לשחזר אותם אם התאים יפסיקו לתפקד בעקביות. כדי לקבוע את קו התאים בעל התגובה הגבוהה ביותר, בדקו את התאים שהועברו באמצעות בדיקת ביו-לומינסנציית סידן עם ליגנד פעיל כגון הרצפטור, פפטיד, ליגנד או אגוניסט אחר המשמש כביקורת חיובית.

בדיקת הביולומינצנציה של סידן תוצג בפירוט מאוחר יותר בסרטון זה. בצע את בחירת התאים הבודדים פעם שנייה לפני המשך הניסוי. כאשר נבחרים שורות תאים קלונאליות לבדיקות ומשמרים אותם בתרבית, קריטי לעקוב אחר מספרי המעברים, שכן תאים במספרי מעבר גבוהים עלולים להפסיק להגיב בבקבוק T 25.

גדלו קווי תאים המבטאים את הרצפטור הרצוי במצע תחזוקה עד להגעה לכ-90% התלכדות (confluence). לאחר trypsinization וסנטריפוגציה של התאים, השעו אותם שוב במצע התחזוקה, דללו את התאים פי 10 בערך באמצעות מצע תחזוקה, וספרו את מספר התאים באמצעות המוסימטר (hemocytometer). לאחר מכן, התאימו את מספר התאים לכ-2x10⁵ תאים למילליטר. זרקו שני מיליליטרים מהתאים לכל באער של פלטה בעלת שש באערים והדגרימו את הפלטה למשך 24 שעות, שבסיומן התאים צריכים להגיע לכ-60% התלכדות לפני תחילת בדיגת הביולומינסנציה של סידן בפלטה.

הכינו את הגן המדווח הרלוונטי בתוך מבנה וקטור הביטוי. במקרה זה נעשה שימוש במדווח קוורום המבטא במיטוכונדריה. לאחר מכן, בצעו טרנספקציה לתאים עם מיקרוגרם אחד של פלסמיד מדווח זה, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לאחר דגירה של התאים בלוח בעל שישה בארות למשך 24 שעות, יש לבצע טריפסין, סנטריפוגה ותליה מחדש, לדלל את התאים לריכוז של 400,000 תאים למיליליטר ולהעביר 100 µL לכל בארה בלוח מיקרו-טיטר לבן בעל תחתית דקה עם 96 בארות. יש לדגור למשך 24 שעות נוספות עד להגעה לכ-80% התלכדות (confluence). זהו ריכוז התאים האופטימלי עבור בדיקת הביולומנסנס. את השלבים הבאים יש לבצע בחשיכה, אך הם מוצגים כאן באור.

למטרות הדגמה, הכין כמות מספיקה של מצע DME נטול סידן המכיל חמישה מיקרומולר CHO terezin עבור 90 µL לכל באר. הסר את המצע הישן מהפלטה והוסף 90 µL לכל באר. הדגר את הפלטות למשך שלוש שעות בחושך בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide, ולאחר מכן התאים יהיו מוכנים לבדיקה.

הדגמה זו מבוצעת באמצעות קורא לוחות Nova star במצב ביולומינצנציה. כדי להתחיל את השטיפה, יש להניח את לוחות המכונה בתוך מחזיק הלוחות כאשר החדר חשוך. המיסו את הפפטידים בתוך מבחנת EOR בנפח 1.5 milliliter.

השתמש בכמות מספקת של DME נטול סידן ובמצע עבור 10 µL של פפטיד בריכוז 10x לכל באר. הגדר את עומק השאיבה וקבע את מיקום תמיסת הפפטיד לפני השימוש. חשוף את התאים ל-10 µL מהפפטיד והתחל מיד בהקלטת פליטת האור.

בהדגמה זו, המכשיר מוגדר להקליט את פליטת האור באורך גל של 465 nanometers עבור כל באר בכל שתי שניות, למשך זמן כולל של 50 שניות. עם סיום ההרצה, יש לשטוף את משאבות המכשיר. חזרו על התהליך עבור כל דגימת פפטיד, שמרו את הנתונים ושטפו שוב את משאבות המכשיר לאחר הבדיקה.

נתוני פליטת האור מכל באר מועברים באופן אוטומטי לגיליון נתונים של Microsoft Excel על ידי תוכנת המחשב. העתיקו את הנתונים מ-Excel לתוכנת Prism 4.0. צרו גרף עם ריכוזי הפפטיד השונים בציר ה-x ויחידות ביו-לומינסנציה (bioluminescence units).

בציר Y, בחר בניתוח התאמה של עקומת רגרסיה לא-ליניארית כדי לקבל עקומות תגובה לריכוז עבור כל פפטיד בערכי ה-EC 50 התואמים להם. יש לחזור על כל ניסוי שלוש פעמים לצורך ניתוח הנתונים. כאשר הוא מבוטא בתאי שחלה של אחורי סיני (Chinese hamster ovary, K one cells), הקנין רצפטור מהיתוש Aedes aegypti התנהג כרצפטור רב-ליגנדי והגיב תפקודית לריכוז נמוך של 1 nM.

עבור שלושת הקינינים האנדוגניים של ה-eighties שנבדקו בנפרד באמצעות בדיחת לוח ביולומינסנציה של סידן. נקבעו ערכי EC 50 השונים סטטיסטית של כ-16 nanomolar עבור eighties aegypti kinine 3, 26 nanomolar עבור eighties aegypti kinine two ו-49 nanomolar עבור eighties aegypti kinin one, מה שהוביל לדירוג עוצמה שבו eighties kinin three הוא העוצמתי ביותר ו-eighties kinin one הוא הפחות עוצמתי מביניהם. להלן השוואת הפעילות של שישה אנלוגים של alpha amino ISO butyric acid kinin על קו תאי Chinese hamster ovary K1 המבטא את רספטור הקינין של הקרציה, באמצעות בדיחת לוח ביולומינסנציה של סידן.

ציר Y מייצג את אחוזי יחידות הביולומנסינציה המקסימליות עבור כל אנלוג, המבוטאים כאחוז מהביולומנסינציה שנצפתה בריכוז מסוים לעומת התגובה המקסימלית שנצפתה בכל הריכוזים שנבדקו עבור כל אנלוג. האנלוג KININE HEXA peptide F-F-F-S-W-G amide משמש כביקורת חיובית לפעילות הקולטן. האנלוג של הקינין עם החלפה אחת, double F amino ISO butyric acid WG amide, היה פעיל יותר מהביקורת החיובית של ה-HEXA peptide KININE analog; האנלוג של הקינין עם שתי החלפות של חומצה אמינובוטירית, aminobutyric acid FF aminobutyric acid WG amide, היה החזק ביותר מבין אנלוגי ההחלפה הכפולה שנבדקו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבטא AGPR ולהשיג שורות תאים קלונליות כדי לנתח קשרי מבנה-פעילות של ליגנדים על קולטנים באמצעות בדיקת ביולומנסינציה של סידן.