Name: Bioluminescent כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: למדו שיטה לזיהוי מהיר של Yersinia pestis באמצעות פאג' מדווח ביולומינסצנטי. השיטה מבוססת על הזרקת DNA רקומביננטי לתאי החיידק והפקת אות זוהר לזיהוי פתוגני קטגוריה A.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר קטן חדשנות עסקית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIAID, 1R43AI082698-01) ו - USDA המכון הלאומי של המזון והחקלאות (NIFA, 2009-33610-20028).

1. י ' pestis חיסון צלחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak י pestis A1122 (BeiResources # NR15) תרבויות המניות על לוריא-Bertani (LB) אגר (מילר). השתמש בטכניקה סטרילית לבצע את כל י pestis מניפולציות בסוג הכיתה השנייה הקבינט. biosafety י pestis A1122 הוא רמה biosafety (מנהלת הליגה) 2 נשלל זן סוכן לבחור. היא חסרה גם את צמד 75 kb סידן נמוכה (LCR) בתגובה ארסיות פלסמיד, ואת מוקד PGM הנדרשים ארסיות. לגדל י pestis על 28 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות בטמפרטורה סטטית מבוקרת האוויר בחממה. קצב הגידול של י ' pestis איטי עם זמן דור של 1.25 ש 9. </li></ol> 2. Y. pestis נוזלי מדיה חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת י 'אחת pestis המושבה לתוך צינור סטרילי 17 x 100 מ"מ תרבות המכילה 2 מ"ל של מרק LB באמצעות לולאה סטרילי חיסון מתכת. בחר מושבת כי הוא אחיד בגודל, מעיד על במושבות אחרות, מופרדת בבירור משאר המושבות על הצלחת. צינור וורטקס בקצרה ולגדול תרבות ב 28 מעלות צלזיוס למשך כ 20 שעות בתוך חממה רועד (225 סל"ד). </li></ol> 3. י ' תוצאה pestis, phage בנוסף כתב, זיהוי bioluminescent <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את י 'בן לילה pestis 1:20 התרבות לתוך מרק LB טרי 50 מ"ל בז צינור (למשל, 500 μL של תאים לתוך 9.5 מ"ל של מדיום) ו לגדול ב 28 ° C עם רועד (225 סל"ד). לגדול עד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (600) של 0.2 הוא הגיע (כ 5 שעות). תאים ומתרחב עדיפים לגילוי מאז היכולת של הפאג כדי transduce תגובה bioluminescent קשורה לקיומה והתאמה של החיידק המארח. עם זאת, מערכת הגילוי הוכח להיות תואם עם תאים שנקטפו בכל שלבי מחזור צמיחה 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את המצע הדרוש התגובה bioluminescent על ידי הכנת 2% n-decanal פתרון. מערבבים 200 μL של n-decanal עם 9.8 מ"ל של מרק LB. וורטקס בתוקף במשך 5 s. ראש luminometer microplate מזרק עם 2 מ"ל של הפתרון n-decanal 2%. שנקבע מראש luminometer כדי autoinject 67 μL הפתרון decanal כדי microplate כל טוב ומיד לקרוא את המדגם עבור 10 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר aliquots 1 מ"ל של LB לתוך מרק 3 צינורות תרבות. הוסף 20 μL של הפתרון phage מניות הכתב (מניות של 5 x 10 9 יחידות פלאק ויוצרים [PFU] / mL) אל צינור כל אחד; phage התקשורת דגימות לבד משמש שליטה שלילי. בהעדרו של י ' תאים pestis, תוספת של הפאג הכתב לא צריך לתגובה bioluminescent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר aliquots 1 מ"ל של י ' תרבות pestis (משלב 3.1) תוך 6 צינורות תרבות. הוסף 20 μL של המניה phage הכתב 3 של תרבויות (תרבויות מבחן). שאר 3 תרבויות לשמש מלאה שלילית של התאים לבד "(autobioluminescence רקע). מערבבים תרבויות ידי vortexing בקצרה, ו -200 יבול μL מכל מדגם (בפעם 0 לקרוא) ו לוותר לתוך צלחת microtiter לבן 96-היטב. דגירה התרבות הנותרים ב 28 ° C עם רועד (225 סל"ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את זמן 0 דגימות פליטת אור (יחידות אור יחסי, RLU) באמצעות luminometer microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 200 קציר μL של כל דגימה לאחר 10, 20, 30, 40, 50, ו 60 שלאחר כתב דקות phage בנוסף, ולמדוד את המדגם עבור פליטת אור. אם י תאים pestis נוכחים, phage הכתב יהיה ספציפי להיקשר אל התא, להזריק DNA שלה, ולהשתמש המארחים מכונות תעתיק ו translational לתמלל ולתרגם את הגנים כתב luxAB (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוצמת האות ואת זמן התגובה אות הוא יחסי למספר תאים הנוכחי. בריכוזים גבוהים של תאים (10 -10 5 8 CFU / mL), גידול משמעותי לעומת RLU שולט צריך להיות ברור בתוך 20 דקות. בריכוזים נמוכים התא, (10 2 -10 4 CFU / mL), גידול משמעותי RLU צריך להיות ברור בתוך 40-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, כדי לזרז את תהליך זיהוי ללא צורך י תוצאה pestis, מושבה מהצלחת בוגר טרי עשוי להיות מעורב (על ידי vortexing) ישירות צינור 1.5 Eppendorf מ"ל עם μL 200 של מרק LB מחסה phage הכתב. מחלקים את התערובת תא / phage לבאר צלחת microtiter. דגירה את הצלחת microtiter ב 28 ° C ו לקרוא את המדגם עבור פליטת אור אחרי 60 דקות (נקודת זמן אחת בלבד). </li></ol> 4. נציג התוצאות: הפעם נציג במהלך ניסוי של הפאג הכתב בתיווך זיהוי של י ' pestis מתואר באיור 2. שולט שלילית של 1) phage לבד (ללא תאים), או 2) תאים בלבד (ללא phage) לספק רמות הבסיס של פליטת אור RLU של כ -20 לאורך 60 דקות incubation (רמות הבסיס הן ספציפיות luminometer). לעומת זאת, עלייה פליטת אור על דגימות הבדיקה (phage הכתב והתאים) ניכרת בכל 15 דקות אחרי כן phage. עוצמת האות צריכה לעלות בהתמדה במשך 60 דקות. Incubations לפרקי זמן ממושך (מעל 80 דקות), יביא אות כי תהיה ירידה של האות שיא בשל phage תמוגה בתיווך של התאים המארחים. תוצאות דומות מתקבלים בטמפרטורות דגירה של 37 ° C למרות הטמפרטורה האופטימלית עבור י ' צמיחה pestis היא 28 ° C 9. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Phage בתיווך זיהוי bioluminescent של י ' pestis. בזמן 0, phage הכתב והתאים היו מעורבים, מודגרות ב 28 ° C, פליטת אור (RLU) היה פיקוח לאורך זמן. גידול משמעותי RLU (* סטודנטים מבחן t, p &lt;0.05) ניכר בתוך 15 דקות.

<ol><li>Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threats+in+bioterrorism.+I%3A+CDC+category+A+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Med+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents.</a> Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22Laboratory+manual+of+plague+diagnostic+tests.%22">Laboratory manual of plague diagnostic tests.</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).</li>
<li>, (1999).</li>
<li>Inglesby, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthrax+as+a+biological+weapon%2C+2002%3A+updated+recommendations+for+management%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management.</a> JAMA. 287, 2236-2252 (2002).</li>
<li>Schuch, R., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+genomic+analysis+of+the+Wbeta+and+gamma+phages+infecting+Bacillus+anthracis%3A+implications+for+evolution+of+environmental+fitness+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance.</a> J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).</li>
<li>Garcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Yersinia+pestis+bacteriophage+phiA1122+reveals+an+intimate+history+with+the+coliphage+T3+and+T7+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes.</a> J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).</li>
<li>Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+bioluminescent+phage+for+detection+of+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).</li>
<li>Schofield, D. A., Westwater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage-mediated+bioluminescent+detection+of+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).</li>
<li>Chu, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChu%2C+MC+%22CDC%3A+Basic+laboratory+protocols+for+the+presumptive+identification+of+Yersinia+pestis%22">CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).</li>
<li>Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+differentiation+between+Pasteurella+pestis+and+Pasteurella+pseudotuberculosis+by+action+of+bacteriophage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage.</a> J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).</li>
<li>Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Action+of+Pasteurella+pestis+Bacteriophage+on+Strains+of+Pasteurella%2C+Salmonella%2C+and+Shigella%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella.</a> J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).</li>
<li>Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Yersinia+pestis+using+amplification+of+plague+diagnostic+bacteriophages+monitored+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR.</a> PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטה זו ממחישה את יכולתו של הפאג הכתב כדי לזהות במהירות Y. pestis מאז phage הכתב יכול transduce תגובה bioluminescent האות י &#39;תרבותי pestis תאים בתוך 20 דקות אחרי כן phage. Phage עיתונאי הוא גם מסוגל לזהות ישירות י pestis ב מטריצות קליני, ללא תנאי מוקדם של בידוד 7 הטיפוח הבאים. בהשוואה תמוגה מבחני תקן הפאג אשר בדרך כלל דורשים 48 שעות להשלמת, זה מקטין באופן משמעותי את הזמן כדי זיהוי. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direc...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Difco אגר LB, מילר </td><td> VWR </td><td> 90003-346 </td></tr><tr><td> Difco LB מרק, מילר </td><td> VWR </td><td> 90003-350 </td></tr><tr><td> 17 x 100 מ&quot;מ צינורות תרבות </td><td> ארה&quot;ב מדעי </td><td> 1485-0810 </td></tr><tr><td> n-Decanal </td><td> סיגמא </td><td> D7384 </td></tr><tr><td> Veritas microplate luminometer </td><td> טרנר Biosystems </td><td> 9100-001 </td></tr><tr><td> במטוס קטנטן microtiter 96-טוב צלחת </td><td> VWR </td><td> 62402-984 </td></tr></tbody></table>

&quot;bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Pestis Yersinia ו anthracis Bacillus הם קטגוריה פתוגנים חיידקיים כי הם סוכני סיבתי של המגיפה ואת אנתרקס, בהתאמה 1. למרות התרחשות טבעית של שתי מחלות "כיום נדיר יחסית, את האפשרות של קבוצות טרור באמצעות אלה פתוגנים כמו bioweapon הוא אמיתי. בגלל communicability הטבועה של המחלה, כמובן קליניים מהירה, שיעור תמותה גבוה, זה קריטי, כי התפרצות להתגלות מהר. לכן מתודולוגיות המספקים איתור אבחון מהיר חיוניים על מנת להבטיח יישום מיידי של צעדים לבריאות הציבור ההפעלה של ניהול משברים. רקומביננטי phage הכתב עשוי לספק גישה מהירה ספציפי לגילוי של י ' pestis ו-B anthracis. המרכז לבקרת מחלות ומניעתן משתמש כעת תמוגה מבחני קלאסית phage לזיהוי אישר אלה חיידקים פתוגנים 2-4. מבחני אלו לנצל טבעי phage שהם ספציפיים ממס עבור המארחים חיידקי שלהם. לאחר לילה צמיחה של החיידק מעובדים בנוכחות phage הספציפי, היווצרות הפלאק (תמוגה חיידקי) מספק זיהוי חיובי של יעד חיידקי. למרות מבחני האלה הם חזקים, הם סובלים משלושה חסרונות: 1) הם המעבדה מבוססת, 2) הם דורשים בידוד טיפוח חיידקים מן המדגם חשד, ו 3) הם לוקחים 24-36 שעות כדי להשלים. כדי לטפל בבעיות אלה, רקומביננטי "אור מתויג" phage הכתב היו מהונדסים גנטית על ידי שילוב harveyi Vibrio luxAB גנים לתוך הגנום של י ' pestis ו-B anthracis phage ספציפי 5-8. הכתב כתוצאה phage luxAB הצליחו לזהות יעד ספציפי שלהם במהירות (תוך דקות) וברגישות הענקת פנוטיפ bioluminescent לתאי הנמען. חשוב לציין, זיהוי הושג גם עם תאים הנמען מעובדים או עם מעושה נגוע דגימות קליניות 7. למטרות הדגמה, כאן אנו מתארים את השיטה לגילוי phage בתיווך של י ידוע pestis לבודד באמצעות phage כתב luxAB בנויים המגפה CDC אבחון phage ΦA1122 6,7 (איור 1). שיטה דומה, עם שינויים קלים (למשל שינוי הטמפרטורה צמיחה התקשורת), ניתן להשתמש לצורך זיהוי של B. anthracis מבודד באמצעות B. phage anthracis Wβ כתב: luxAB 8. השיטה מתארת ​​את התמרה phage בתיווך של פנוטיפ biolumescent י 'טיפח pestis התאים הנמדדים לאחר מכן באמצעות luminometer microplate. היתרונות העיקריים של שיטה זו על פני מבחני תמוגה המסורתית הפאג הוא קלות השימוש, התוצאות מהירה, את היכולת לבחון דגימות בו זמנית בפורמט 96-microtiter גם צלחת. <img src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. סכמטית איתור. Phage מעורבבים עם המדגם, phage מדביק את התא, luxAB באים לידי ביטוי, ואת bioluminesces התא. עיבוד המדגם אינו הכרחי; phage ותאי מעורבבים ומדד לאחר מכן לאור.

שיטה פשוטה לזיהוי חיידקים פתוגנים העדיפות היא להשתמש phage כתב מהונדסים גנטית. אלה phage הכתב, אשר הן ספציפיות למין מסוים המארח שלהם, הם מסוגלים במהירות transducing תגובה אות bioluminescent לתאי המארח. בזאת, אנו מתארים את השימוש phage הכתב לצורך זיהוי של<em&gt; Yersinia pestis</em&gt;.

&quot;Bioluminescent&quot; כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

*Yersinia pestis* ו-*Bacillus anthracis* הם פתוגנים חיידקיים מקטגוריה A, שהם הגורמים למחלת הדבר ולאנתרקס, בהתאמה 1. ...

Yesinia Pestis ו-Bacillus Anthrax הם פתוגנים חיידקיים מקטגוריה A, שהם הגורמים למחלות הדבר והפחם בהתאמה. למרות שההסתמנות הטבעית של שתי המחלות נדירה כיום יחסית, האפשרות שקבוצות טרור ישתמשו בפתוגנים אלה כנשק ביולוגי היא ממשית. סרטון זה מדגים שיטה לזיהוי ואבחנה של yersinia pestis.ראשית, המיקרואורגניזם גדל על מצעי אגאר ובמדיום נוזלי. לאחר מכן, מתוסיפים לתרבית פלסמיד מדוחה (reporter pH) ספציפי ל-y pesti. הפלסמיד המדוחה נושא בגנומו שלו את הגנים המקודדים ללוסיפרז בקטריאלי, luxe AB.במידה ונוכחים תאי Y pesti, הפאג המדווח ייקשר באופן ספציפי לתא, יזריק את ה-DNA הרקומביננטי שלו, הנושא את הגנים luxe AB, וישתמש במנגנוני השעתוק והתרגום של המארח כדי לשעתק ולתרגם את הגנים המדווחים luxe AB. התוצאות המתקבלות מראות כי הדגימות רכשו פנוטיפ ביולומינצנטי, מה שמעיד על כך שהמיקרואורגניזם הבלתי ידוע זוהה באופן חיובי כ-why pestis. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת ליזיס פאגית מסורתית, הוא שהזמן הנדרש לזיהוי וגילוי של your senior pestis הוא דקות במקום ימים. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי מהיר ובגילוי נוכחות של Yesenia pesti באמצעות תרביות מבודדות או ישירות מדגימות קליניות או סביבתיות מורכבות.השלכותיה של טכניקה זו מתרחבות לאבחון של מחלת הדבר, מכיוון שהמחלה היא בדרך כלל קטלנית אם לא ניתן טיפול בתוך 24 השעות הראשונות להופעת התסמינים. לפיכך, זיהוי מהיר של Yersenia pestis חיוני לפרוגנוזה חיובית. מכיוון שפאג'ים קיימים עבור כמעט כל המינים החיידקיים, ניתן באופן פוטנציאלי להתאים את המתודולוגיה לכל מין שחשיבותו הרפואית, הסביבתית או החקלאית דומה לזו של Y. pestis.A 1122 הוא זן של סוכן נבחר המוחרג מרמת בטיחות ביולוגית 2. הוא חסר הן את פלסמיד virulent-ness של תגובת הסידן (LCR) בגודל 75 Kilobase והן את הלוקוס PGM, הדרושים לצורך virulent-ness. התחל את ההליך תחת מ ইরানের בטיחות ביולוגית מסוג class two type a תוך שימוש בטכניקה סטרילית, ובצע מריחה (streak) של Y pestis, A 1122.בצעו זריעה של תרביות המקור על מצע LB agar כפי שמוצג כאן. הניחו את הפטריות הפוכות באינקובטור אוויר סטטי עם בקרת טמפרטורה ב-28 degrees Celsius למשך 48 שעות. קצב הצמיחה של Y pestis איטי, עם זמן דור של 1.25 שעות לאחר יומיים.השתמשו בלולאת הזרקה מתכתית סטרילית כדי לדגום מושבה אחת של *Y. pestis*. בחרו מושבה שגודלה אחיד, המייצגת את שאר המושבות ומופרדת בבירור משאר המושבות בצלחת. העבירו את המושבה למבחנה סטרילית במידות 17 על 100 מילימטר המכילה שני מיליליטר של מצע LB broth.סגרו את הפיה של המבחנה והעבירו אותה במיקסר (vortex) לזמן קצר, ולאחר מכן הניחו אותה באינקובטור שוקק במהירות של 225 RPM ובטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך כ-20 שעות. עבור בדיקה זו, תאים בצמיחה פעילה מועדפים לצורך הזיהוי. מכיוון שיכולת הטרנסדוקציה של הפאג תלויה בחיוניות ובכושר ההישרדות של חיידקי המארח, התגובה הביולומינסנטית מקושרת למדדים אלו.עם זאת, הוכח כי מערכת הגילוי תואמת לתאים שנאספו בכל שלבי מחזור הצמיחה. לאחר 20 שעות של צמיחה, דללו את תרבית ה-Y pestis ביחס של 1 ל-20 בתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר, על ידי הוספת 500 µL של תאים ל-10 milliliters של lb broth. החזירו את התרבית לאינקובטור המנער בטמפרטורה של 28 °C.יש לאפשר לתרבית לגדול עד להגעה לצפיפות אופטית (optical density) של 0.2 באורך גל של 600 nanometers. תהליך זה אמור להימשך כחמש שעות כדי לייצר את סובסטרט התגובה הביולומינצנטית. הכינו תמיסת N decanal בריכוז 2% על ידי ערבוב של 200 µL של N decanal עם 9.8 mL של מצע LB broth.סובב במכשיר Vortex בעוצמה למשך חמישה שניות. לאחר מכן, כדי להכין (prime) את המזרק של ה-Microplate Luminometer, הנח קצה אחד של צינור המזרק בתוך מבחנה של 13 מיליליטר המכילה תמיסת end decal בריכוז 2% ואת הקצה השני של צינור המזרק בתוך מיכל פסולת.בעזרת התוכנה של המכשיר, הנחו את המכונה להזרים (prime) את קו המזרק עם שני מיליליטרים של תמיסת ה-decanal. לאחר השלמת הפעולה, הקו אמור להיות מלא בסובסטרט; החזירו את קצה קו המזרק למיקומו המוגדר כדי שיהיה מוכן להזרקה לבארים. לאחר מכן, הנחו את הלומינומטר להזריק באופן אוטומטי 67 µL מתמיסת ה-deel לכל מיקרופלטה.לאחר מכן, מדדו מיד את רמת הביולומינצנציה שנפלטה במשך 10 שניות. בהמשך, כדי להכין כל דגימה, תייתו בשלוש כפילויות שלוש מבחנות תרבית עבור כל תנאי. כאן, יוכנו בקרות של פאזה בלבד ובקרות של תאים בלבד, בנוסף לדגימה לבדיקה.כדי להכין דגימות ביקורת של פאג' בלבד דרושות תשע מבחנות; העבירו מנות של 1 mL של מצע lb broth לשלוש מבחנות תרבית. הוסיפו לכל מבחנה 20 µL מתמיסת מלאי של פאג' רפורטר בריכוז של 5×10⁹ PFU ל-mL.בהיעדרה של תאי Y pesti, הוספת פאג הדיווח אינה אמורה לעורר תגובה ביולומנסנטית. לאחר מכן, להכנת דגימות הבדיקה, העבירו מנות של 1 mL מתרבית Y pesti לשלוש מבחנות תרבית. הוסיפו 20 µL ממלאי פאג הדיווח לשלוש מהתרביות.ערבבו את התרביות באמצעות vortex קצר כדי להכין תאים בלבד. עבור הביקרים השליליים, המשמשים לקביעת רמת הביולומינצנציה האוטוסטרטית של הרקע, העבירו מנות של 1 ml מתרבית ה-Y pestis לשלוש מבחנות תרבית נוספות. לאחר הכנת הדגימות, העבירו 200 µl מכל תרבית לבארות של פלטת מיקרוטיטר לבנה בעלת 96 בארות עבור קריאת זמן אפס.העבירו את שארית כל תרבית למכשיר הנעורה בטמפרטורה של 28 °C תוך שימוש בלומינומטר למיקרו-פלטות. מדדו את הזמן. בצעו איפוס לדגימות עבור ביולומינסנציה או יחידות אור יחסיות.בצעו מדידות ביו-לומנצנציה על ידי איסוף של 200 µL מכל תרבית וביצוע קריאות בלומינומטר למיקרו-פלטה בדקות 20, 30, 40 ו-60. לאחר הוספת פאג הדגלי (reporter phage) כדי להאיץ את תהליך הגילוי ללא צורך בצמיחה של y pestis, העבירו מושבה ממיקרו-פלטה שגדלה טרי למבחנת מיקרו-צנטריפוגה המכילה 200 µL של lb, הכולל את פאג הדגלי. ערבבו את הדגימה באמצעות וורטקס, ולאחר מכן העבירו את תערובת התאים והפאג לבאר במיקרו-טיטר פלטה.דגרו את פלטת המיקרוטיטר בטמפרטורה של 28 °C למשך 60 דקות. לאחר מכן, קראו את הדגימה לבדיקת ביולומינסנציה. הבדיקה המוצגת בסרטון זה מזהה את נוכחותם של תאי Y pesti כפי שמתואר במבוא.כאשר *Y. pestis* נוכח, פאג המדווח נקשר לקולטן ספציפי על התא, מזריק את ה-DNA שלו, ומשתמש במכונת השעתוק והתרגום של המאכסן כדי לשעתק ולתרגם את הגן המדווח *lux*. עוצמת האות וזמן התגובה של האות פרופורציונליים למספר התאים הנוכחים בריכוזים גבוהים של תאים, בין $10^5$ ל-$10^8$ CFU למיליליטר.עלייה משמעותית ב-RLU בהשוואה לבקרות צפויה להיראות בתוך 20 דקות בריכוזי תאים נמוכים, 10² עד 10⁴ CFU למילליטר. עלייה משמעית ב-RLU צפויה להיראות בתוך 40 עד 60 דקות. כאן מוצג ניסוי מייצג של מהלך זמן עבור זיהוי המתווך על ידי פאג'ים של reporter עבור Y pestis, בזמן אפס.ערבבו פאג'ים מדווחים (Reporter phage) ותאים ודגרו אותם בטמפרטורה של 28 degrees Celsius, תוך ניטור של bioluminescence RLU לאורך זמן. עלייה ב-RLU הייתה ניכרת בתוך 12 דקות, והייתה מובהקת עם ערך P של P less than 0.05; ביקורות שליליות של פאג'ים בלבד או תאים בלבד סיפקו רמות בסיס של bioluminescence של כ-20 RLU לאורך 60 דקות הדגירה. שימו לב שרמות הבסיס תלויות במכשיר הלומינומטר שבו נעשה שימוש.לעומת זאת, ניכרת עלייה בביולומינסנציה עבור תאי ה-reporter phant של דגימות הבדיקה 12 דקות לאחר הוספת ה-phia. עוצמת האות אמורה לעלות בהתמדה במשך 50 דקות, אם כי הדבר אינו מוצג כאן, דגירה לפרקי זמן העולים על 80 דקות תוביל לאות שירד מהשיא עקב ליזיס של תאי המאכסן המגורם על ידי הפאג'. תוצאות דומות מתקבלות בטמפרטורות דגירה של 37 degrees Celsius, למרות שטמפרטורת האופטימום לצמיחת Y pestis היא 28 degrees Celsius.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה באופן השימוש בדיווח רקומביננטי לצורך גילוי. ברגע שתשלטו בזיהוי של Yesenia Pestis, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 30 דקות תוך שימוש במושבות S Golden כאינוקולום ראשוני. בעת ביצוע הליך זה ושימוש בפאג'ים במעבדה, חשוב לזכור שקל מאוד לזהם את תרביות המאגר הבקטריאליות שלכם בפאג'ים; כדי להפחית את הסיכון לזיהום, יש לנקוט במשנה זהירות.השתמשו בכלי פלסטיק חד-פעמיים עם טיפים מתאימים והחליפו את הכפפות באופן סדיר. היכולת של הדיווח לעורר תגובת Blum נמצאת במתאם עם כשירות התא. לכן, בעקבות זיהוי של Yesenia Pesta, ניתן להשתמש בדיווח כדי לקבוע את הרגישות לאנטיביוטיקה של הבידוד.לדוגמה, תאי Yesenia pesta שהודגרו בריכוז מעכב של האנטיביוטיקה לא יוכלו, או שכושרתם יופחת באופן משמעותי, להפיק אות ביו-לומנסי. לעומת זאת, תאי Yesenia pesta העמידים לאנטיביוטיקה לא ייפגעו מנוכחות האנטיביוטיקה ויהיו מסוגלים להפיק תגובה ביו-לומנסית הדומה לזו של תאים שאינם מעוכבים. כך ניתן לקבוע במהירות את פרופיל הרגישות של הפתוגן לאנטיביוטיקה.לצורכי הדגמה, השתמשנו בזן מוחלש של Yesenia pesta. בניסוי זה, Yesenia pests היא קטגוריה, פתוגן חיידקי. בעת ביצוע טכניקה זו עם דגימות שחשודה שהן מכילות Yesenia Pestis, יש להקפיד על אמצעי בטיחות ביולוגית ומניעת סיכונים ביולוגיים מתאימים.

bioluminescent-reporter-phage-for-detection-category-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטות הדמיה של פליטת אור זיהומים חיידקיים בבעלי חיים החיים המתוארים. פתוגנים הם שונה להביע בלוציפראז הדמיה אופטית המאפשרת לגוף שלם של זיהומים בבעלי חיים. במודלים של בעלי חיים יכול להיות נגוע פתוגנים להביע בלוציפראז ואת כמובן כתוצאה של המחלה דמיינו בזמן אמת על ידי הדמיה פליטת אור.

שימוש בלוציפראז לזיהומים חיידקיים תמונה ב עכברים

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק...

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

מאמר זה מתאר את הממשל...

הדמיה בקטריאלי bioluminescent<em&gt; In Vivo</em

מקור: דה וריס, ס. ר. ואח', מודל חיסון מאוחר של זיהום פצע כרוני בפסאודומונס אארוגינוסה . J. Vis. Exp. (2020).הסרטון הזה מדגים טכניקת הדמיה ביולומינצנטית למעקב אחר התקדמות זיהום חיידקי במודל עכבר חי. חיידקים פתוגניים שהונדסו באמצעות מערכת הדיווח luxABCDE פולטים אור באתר הזיהום, ומאפשרים ויזואליזציה של חיידקים פעילים מטבולית. על ידי הדמיית העכבר לאורך זמן, החוקרים יכולים לעקוב באופן לא פולשני אחר דינמיקת הזיהומים ולכמת את עוצמת האות הביולומינצנטי.

הדמיית ביולומינסציה של זיהומים חיידקיים בעכברים

סרטון זה מדגים את ההדמיה הפלואורסצנטית של אנזים הכתב (REF) לזיהוי in vivo של זיהום Mycobacterium tuberculosis. העכברים הנגועים מוזרקים תוך צפקית עם מצע להדמיית REF. עם הידרוליזה על ידי אנזים חיידקי β-לקטמאז, המצע פולט פלואורסצנטיות, אשר זיהויה מסייע להערכת זיהום.

כתב הדמיית אנזים פלואורסצנטי למעקב In Vivo אחר זיהום חיידקי

חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis על תקשורת מוצקה.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

הרחבת הבסיס ותחולתה של הקרינה על ידי מאוגד עירור מהארה (דלק) על ידי מדידות העקרונות הרלוונטיים והוכחת התאימות שלה עם שפע של fluorophores ותנאים ממוקדי נוגדן.

שלב מעבר לברט: הקרינה על ידי מאוגד עירור מההארה (דלק)

פרוטוקול מפורט של דגם העכבר עבור enterohemorrhagic e. coli (EHEC) מושבת באמצעות חיידקים התווית על-ידי ביולומינסנציה מוצג. זיהוי חיידקים זוהרים אלו באמצעות פולשני ויוו מערכת בבעלי חיים הדמיה יכול לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של EHEC קולוניזציה.

זיהוי של כיבוש Escherichia Coli Enterohemorrhagic מאתר מארח על-ידי המערכת לא פולשנית In Vivo ביולומינסנציה

חיידקים זוהרים לווסת ייצור אור באמצעות מגוון רחב של מנגנונים, כגון חישת צפיפות. שיטה חדשנית זו מאפשרת החקירה ב באתרו של ביולומינסנציה הקורלציה של פליטת אור לדחיסות התא. מייצרים אור מלאכותי Escherichia coli מערכת מאפשרת אפיון lux operons, לאקס חלבונים והגומלין שלהם.

בחיי עיר ובחינת המתאם של צפיפות התאים ואת פליטת אור של חיידקים זוהרים

המתוארים כאן היא שיטה לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים ברמה התאית. שיטה זו מספקת משאב ללמוד את הגיוון פנוטיפי המתרחשים בתוך אוכלוסיה חיידקי בתגובה הסביבה רקמות במהלך זיהום.

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

במאמר זה אנו מתארים הליך המאפשר זיהוי כלל איברי של חיידקים פתוגניים במהלך ההדבקה וכימות של פעילות המדווח הפלואורסצנטי.

טומוגרפיה תלת-ממדית תלת-ממדית של איברים שלמים ברזולוציה גבוהה של זיהומים מיקרוביאליים

למדו שיטה לזיהוי מהיר של Yersinia pestis באמצעות פאג' מדווח ביולומינסצנטי. השיטה מבוססת על הזרקת DNA רקומביננטי לתאי החיידק והפקת אות זוהר לזיהוי פתוגני קטגוריה A.

"Bioluminescent" כתב phage לצורך זיהוי של קטגוריה פתוגנים חיידקיים

גלה סרטונים נוספים