Name: בידוד של המוח, שחדר Leukocytes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: למדו לבודד לויקוציטים ממוח עכברים נגועים בנגיף TMEV באמצעות צנטריפוגה בגרדיאנט. שיטה זו מאפשרת אפיון תאי חיסון במוח ומחקר תגובות נוירואימונולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NS64571 מן NINDS (CLH), על ידי בפרס פיתוח קריירה מוקדמת ממרפאת מאיו (CLH), ועל ידי מתנה נדיבה של דונלד פרנסיס Herdrich (CLH). ברצוננו להודות תזרים מרפאת מאיו Core cytometry לסיוע.

1. וירוס הזרקה תוך גולגולתי: הטכניקה הבאה שונתה והוא מנוצל באופן נרחב על ידי המעבדה שלנו ועמיתיו. בקצרה, הזרקה תוך גולגולתי של המתח של דניאל של Encephalomyelitis Murine Theiler של הנגיף (TMEV) או העמדת פנים, זיהום (1, 10) מתבצע על עכברים צעירים (רצוי 5-6 שבועות של גיל) כדי לעורר leukocytes המוח הסתננות (BILs). שים לב כי התוצאות יהיו שונות בין המתח של דניאל, זן שעועית, והמתח GDVII. לצורך קצירת BILs, עכברים לקבל 2x10 5 PFU של TMEV ו נגועים למשך 24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את מחט הזריקה (27 מד, ¼ ב, Kendall), כדי מזרק אוטומטי המילטון 1 מ"ל ולהגדיר לספק 10 μl של הנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את TMEV ב 10 DMEM μL לתוך המזרק עם תשומת לב קפדנית בועות אוויר. כאשר מתאים, עכברים דמה נגוע לקבל 10 μl של מווירוסים DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לפני הזריקה, לשפוך כ 1 מ"ל של isoflurane לצנצנת פעמון המכיל רשת חוטי כותנה עם המצע שמתחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מקום direclty על רשת תיל בצנצנת בפעמון עד שהם הופכים הרדים בקלילות, רגישות לצבוט-הבוהן משותקת על ידי נשימתית הרדמה, כ 10-15 שניות. עכברים לא צריך לבוא במגע ישיר עם isoflurane, כחומר יכול להיות מעצבן מאכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד תחת הרדמה, להכין עכברים להזרקה על ידי במהירות באיתור הקואורדינטות המתאימות באזור קליפת המוח הקדמית על הגולגולת באמצעות גילוח דיות. המיקום הכללי להזרקה הוא 1 מ"מ הקדמי כדי גבחת ו 1 מ"מ לרוחב תפר sagittal בצד ימין (איור 1). בעוד זריקה stereotactic עשוי להתאים כמה מצבים ניסיוני, מצאנו כי יד חופשית הזרקה ללא גילוח או דיות מתאים רוב הניסויים. קריעת פרווה עם נקודת מחט לאורך צירים גם מתאים ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעשות זריקה, המזרח בניצב מחט לגולגולת ולחץ דרך העצם עד לעומק של כ 3 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקספרס וירוס לתוך המוח ידי לחיצה על כפתור מזרק המילטון למטה מחכים 2 שניות הנגיף להזין את המוח לפני נסיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את המחט במקום עכבר בכלוב, נקי ויבש. עכברים להתעורר מן ההרדמה במהירות ולהמשיך לתפקד נורמלי בתוך דקות. תנו תשומת לב ראויה עכברים סימפטומים חריגים, כגון דימום יתר מאתר ההזרקה, כמו המתת חסד של בעלי החיים עשויים להיות מתאימים. טיפול בבעלי חיים פרופר 6 ודבקות המכונים הלאומיים לבריאות טיפוח בעלי חיים מוסדיים ועדת הנחיות שימוש חייב להיות אחריו. </li></ol> 2. Brain-הסתננות הכנה תא ליקוציט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מסביב לתחתית באוקרידג' צנטריפוגות צינורות אשר יכול להכיל קיבולת של 30 מ"ל עם 10 מ"ל RPMI 1640, 9 Percoll מ"ל ו 1 מ"ל PBS 10X וצינורות צריך לשבת על הספסל RT במהלך תהליך הסרת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו Ficoll-Paque פלוס לטמפרטורת החדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים על ידי יתר isoflurane שונה 5 במהירות להסיר את המוח באמצעות נירוסטה רקמות מרית ומכניסים צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל RPMI על הקרח. בנסיבות מסוימות, PBS-זלוף עשוי להיות מתאים כדי להסיר את התאים במחזור הדם ההיקפית של הכנת BILs. עכברים צריך להיות מלא כראוי הרדים לפני זלוף-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת המוח פתרון RPMI ל 7 מ"ל מטחנת זכוכית פיירקס Tenbroeck רקמות המותג homogenize בעדינות עם 10-15 ושבץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet נוסף 5 מ"ל RPMI לתוך homogenizer ו pipet למעלה ולמטה פעמיים. העברת המוח homogenate (בערך 10 מ"ל) ל צינור עגול התחתונה הכין בעבר בעדינות להפוך 2-3 פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין homogenate המוח בבית 7800g שד 'למשך 30 דקות ב RT ב הרוטור קבוע זווית F0360 ב צנטריפוגה אלגרה X-22R Beckman קליניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר שאריות המיאלין אשר צפו לחלק העליון של השיפוע. איסוף שכבת ליקוציט שצף מעל תא דם אדום גלולה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים שכבת ליקוציט דרך מסננת תא 40 מיקרומטר לתוך 50 מ"ל חרוטי. תביאו פתרון עד נפח 50 מ"ל עם RMPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין המכיל ההשעיה תא בדילול בצנטריפוגה קליני ב 1500 סל"ד (600g Ave) במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לאסוף את התא גלולה. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל FACS חוצץ (1% שור אזיד סרום אלבומין, נתרן 0.02% סידן ומגנזיום ללא PBS) ולהעביר את ההשעיה תא עגול 5 מ"ל צינורות התחתונה FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות בבסיס ההשעיה עם פלוס 1 Ficoll-Paque מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור ב 2500 סל"ד (1,400 נתן) בצנטריפוגה קליניים עבור 25 דק 'ב RT עם הבלם לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת שכבת לבנים, מוכי על הממשק (איור 2) עם פיפטה 1 מ"ל ולהעביר צינור חדש FACS 5 מ"ל. לשטוף גאמות עם חיץ 4 FACS מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינור ב 1500 סל"ד (600g Ave) במשך 5 דקות ב RT בצנטריפוגה קליניים בתאי גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ולאסוף תא גלולה. Resuspend גלולה ליקוציט במאגר המתאימים ולשמור על קרח בצינור FACS חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים, להעריך את כדאיות התא על ידי הרחקה Trypan כחול לנתח ידי cytometry הזרימה. באופן כללי, החוקרים יכולים לצפות לרכוש כ 5 x 10 5 תאים / החי. </li></ol> 3. תזרים cytometric immunophenotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בידוד ספירת לויקוציטים, לסובב את התאים במשך 3 דקות על 1500 סל"ד (600 נתן) בצנטריפוגה קליני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה בחסימת למאגר המכיל את הפעולות הבאות: חיץ FACS, supernatant מ 2.4G2 hybridoma (FC לחסום; anti-CD16/32) ו בסרום שור העובר ביחס של 10:05:01 ו דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ולהוסיף נוגדנים כנגד אנטיגנים מצומדות תאיים על התאים חסומים בריכוז של 1:200 ו דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך. כתם דגירה תאים μl 200 בצלחת V-96-התחתונה היטב. בקרות מתאימות כוללות תאים בלא כתם דגימות פיצוי fluorochrome, לפי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים מוכתם ב RT במשך 3 דקות על 1500 סל"ד (600 נתן) בצנטריפוגה קליני באמצעות המתאים הרוטור עבור 96-גם הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לשטוף את התאים עם FACS חיץ 200 μl ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על טכניקה כביסה מעל פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כביסה, resuspend התאים paraformaldehyde 2% ולהעביר צינורות FACS. קיבוע נדרש ניתוח תזרים cytometric של תאים נגועים של biosafety 2 ריאגנטים רמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התאים קבוע על FACS BD Calibur הבא שיטה שונה תזרים cytometry 8 ולנתח את הקבצים הלא מקוונים באמצעות FlowJo, WinMDI או cytometry אחרים הזמינים תזרים תוכנת ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח של אירועים 50-100,000 לדגימה נדרש בדרך כלל עבור immunophenotyping הולם. </li></ol> נוגדנים מצומדות ישירות השתמשו בניסוי זה: CD45 זוהה עם שיבוט 30-F11. Ly6C / G זוהה עם Gr1 שיבוט, RB6-8C5. CD11b זוהה עם שיבוט M1/70. F4/80 זוהה עם שיבוט BM8. 4. נציג תוצאות: אנחנו מראים phenotyping תא תוצאות BILs העכבר על זיהום 24 שעות שלאחר (איור 3). Leukocytes הוכתמו עכבר אנטי PerCP מצומדות-CD45 לזהות תאים חיסוניים, PE-מצומדות אנטי עכבר Ly6C / G לזהות מונוציטים דלקתיות, APC-מצומדות אנטי עכבר CD11b ו-APC מצומדות אנטי עכבר F4/80 כדי לזהות תאים השושלת מונוציטים. הניתוח בוצע באמצעות מכשיר FACS Calibur BD. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. לוקליזציה האנטומי של הזריקה. ההזרקה ממוקם 1 מ"מ הקדמי כדי גבחת ו 1 מ"מ לרוחב תפר sagittal בצד ימין. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Leukocytes איור של הפרדת צבע של לויקוציטים ו BILs. נאספים בתחילה ישירות מתחת לשכבת פסולת המיאלין ומעל גלולה RBC ב השיפוע Percoll. השכבה הלבנה, רכות (BILs) בממשק נאסף השיפוע Ficoll. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. Immunophenotype של המוח infilatrating leukocytes ב 24 שעות לאחר ההדבקה. Leukocytes עכבר בודדו מן המוח על ידי צנטריפוגה ההפרש צפיפות רקמת homogenates מוכן מחיות ב 24 שעות לאחר ההדבקה תוך גולגולתי. תאים הוכתמו נוגדנים fluorescently-מצומדות נגד עכבר CD45, Ly6C / G, CD11b ו F4/80. Gating ראשוני בוצע על ידי התוויית CD45, סמן תאים חיסוניים, נגד פיזור קדימה (FSC), אינדיקטור של גודל התא (C). היי CD45 (A, D), CD45 lo (B, E), ו CD45 נג (F, G) אוכלוסיות נותחו לאחר מכן על רמות הביטוי היחסי של סמנים מונוציטים ו macrophage Ly6C / G, F4/80 (A, B , ו), ו CD11b (D, E, G). Ly6C / G + + F4/80 CD11b + מונוציטים דלקתיות נמצאו כמעט אך ורק באוכלוסיה היי CD45 (A, D), עולה בקנה אחד עם חדירה של תאים אלה מהפריפריה. לעומת זאת, Ly6C/G-F4/80 lo CD11b מקרופאגים + נמצאו כמעט אך ורק CD45 lo (B, E) CD45 נג (G) אוכלוסיות, עולה בקנה אחד עם פנוטיפ תושב. בניסויים רבים, מעולם לא נצפתה CD45 בתאי היי או Ly6C / G + + F4/80 CD11b + מונוציטים דלקתית במוח של נגוע או זיוף-infecטד עכברים (מידע לא מוצג).

<ol><li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picornaviruses+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li>
<li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li>
<li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropath.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li>
<li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li>
<li>Donovan, J., &amp, P. B. rown, , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+%26+restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Handling & restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenteral+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li>
<li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li>
<li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection+in+mice%3A+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו משתמשים באופן שגרתי cytometry זרימה כדי לקבוע את איכות ההכנה שחדר המוח תא, להבדיל אוכלוסיות שונות של תאים חיסוניים 2, 9. בשלב נקודות חריפה, שיטה BILs שלנו תשואות באחוזים גבוהים של מונוציטים דלקתי בתוך האוכלוסייה CD45hi כמו גם באחוזים גבוהים של מקרופאגים באוכלוסייה CD45lo. זה מצביע על כך תגובה חיסונית לשחזור בתוך המוח יכול וחסונה להיות מאופיינת השיטה שלנו. טכניקה זו היא בעלת חשיבות מיוחדת עבור ניסוי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> האו מעבדה </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> דניאל זן </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> מסביב לתחתית באוקרידג&#39; צנטריפוגות מבחנות </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> רוש </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll Paque-Plus </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan כחול 0.4% (w / v) </td><td> Mediatech </td><td> 25-900-CI </td><td></td></tr><tr><td> 15 צינורות חרוטי מ&quot;ל </td><td> BD פלקון </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 מ&quot;ל מזכוכית פיירקס המותג Tenbroeck מטחנת רקמה </td><td> דיג </td><td> 08-414-10B </td><td></td></tr><tr><td> תא 40 מיקרומטר מסננת </td><td> BD פלקון </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ל חרוטי </td><td> BD פלקון </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> נתרן אזיד </td><td> סיגמא </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF-PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS צינורות </td><td> BD פלקון </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור העובר </td><td> סיגמא </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 hybridoma </td><td> ATCC </td><td> HB-197 </td><td></td></tr><tr><td> שחקן המשנה V-התחתונה צלחת </td><td> קורנינג </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> אלגרה X-22R צנטריפוגה או שווה ערך </td><td> Beckman </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 96 גם צלחת דלי הרוטור </td><td> Beckman </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> קבוע זווית הרוטור </td><td> Beckman </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehyde </td><td> סיגמא </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 7.5 </td><td> עץ הכוכבים, Inc </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557235 </td><td> שיבוט: 30-F11 </td></tr><tr><td> Gr1 (Ly6C / G) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553128 </td><td> שיבוט: RB6-8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> שיבוט: M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> שיבוט: BM8 </td></tr></tbody></table>

בידוד של המוח, שחדר leukocytes

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

אנו מתארים שיטה להכנת leukocytes המוח הסתננות (BILs) מעכברים. אנו מדגימים כיצד להדביק עכברים עם Encephalomyelitis Murine Theiler של הנגיף (TMEV) באמצעות טכניקת ההזרקה מהירה תוך גולגולתי ואיך לטהר אוכלוסייה ליקוציט מועשר של תאים שחדרו מן המוח כולו. בקצרה, בעכברים מורדמים עם isoflurane בתא סגור חופשיים יד מוזרק בעזרת מזרק המילטון לתוך קליפת המוח הקדמית. עכברים נהרגים אז לאחר ההדבקה באמצעות מנת יתר isoflurane והמוח כולו בזמנים שונים המחולצים, ומעורים ב RPMI עם מטחנת רקמה Tenbroeck. Homogenates המוח הם centrifuged דרך שיפוע Percoll רציפה של 30% כדי להסיר את פסולת התא המיאלין אחרים. ההשעיה התא הוא מתוח אז 40 מיקרומטר, שטף centrifuged על שיפוע רציפה פלוס Ficoll-Paque לבחור ולטהר את לויקוציטים. Leukocytes נשטפים אז resuspended ב buffers מתאים immunophenotyping ידי cytometry הזרימה. Cytometry זרימה מגלה אוכלוסייה של תאים חיסוניים מולדים בשלבים המוקדמים של דלקת בעכברים C57BL / 6. ב 24 שעות שלאחר זיהום, תת מרובות של תאים חיסוניים נמצאים BILs, עם האוכלוסייה העשירה של Gr1 + + ו CD11b F4/80 + תאים. לכן, שיטה זו שימושית המאפיינת את התגובה החיסונית דלקת חדה במוח.

שיטה מהירה להשיג leukocytes חדירה מהמוח Murine מתואר. שיטה זו מנצלת שיפוע Percoll רציפה שיפוע Ficoll רציפה כדי לבחור ולטהר את שכבת ליקוציט מועשר. Leukocytes מבודד ואז עלול להיות מאופיין על ידי מדידות זרימת cytometric.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

אנו מתארים שיטה להכנת לוקוציטים חודרי מוח (BILs) מעכברים. אנו מדגימים כיצד להדביק עכברים בנגיף Theiler של העכבר...

המטרה הכללית של הליך זה היא להוציא אוכלוסייה מועשרת בלויקוציטים של תאי מערכת חיסון מולדת מהמוח של עכברים שהודבקו באופן חריף בנגיף ה-thyer mirroring encephalomyelitis או TMEV. זאת משיגים תחילה על ידי הדבקה תוך-גולגולתית של העכברים ב-TMEV. לאחר מכן, המוח נאסף ועובר הומוגניזציה עדינה 24 שעות לאחר ההדבקה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא שימוש במדרג רצף של Percoll ומדרג לא רציף של Ficoll כדי לטהר באופן סלקטיבי את שכבת התאים המועשרת בלויקוציטים. לבסוף, ניתן לאפיין את הפנוטיפ של אוכלוסיית הלויקוציטים החודרת למוח המעורבת בתגובה החיסונית לזיהום חריף של המוח באמצעות ניתוח ציטומטריה זרימה. שלום, שמי ד"ר צ'ארלס האו.השיטה שנדגים היום יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירו-אימונולוגיה. לדוגמה, מהם תאי החיסון החודרים למוח במהלך זיהום חריף? תדגים את השיטה היום ריגן, לה פרנס.קורי, טכנולוג מחקר בכיר במעבדה שלי, לצורך הפקת לוקוציטים חודרי מוח. חברו מחט בכילוי (gauge) 27 למזרק המילוליטרי אוטומטי של Hamilton והגדירו את המזרק ל-10 µL. שאבו למזרק 10 µL של DMEM המכיל 2×10⁵ PFU של זן דניאל של TMEV, או 10 µL של DMEM לביקורת (sham infection), תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר.הרדימו עכבר בן חמישה עד שישה שבועות ואשרו את הסדציה על ידי צביטה של בהונות בזמן ההרדמה. הכינו את העכבר להזרקה על ידי איתור מהיר של הקואורדינטות המתאימות באזור הקליפה המצחית (frontal cortex) בגולגולת, הזיזו את פרוות העכבר והניחו את חוד המחט לאורך שני ה-AEs כפי שנדרש להזרקה; כדי לבצע את ההזרקה, כווןו את המחט בניצב לגולגולת ולחצו את המחט דרך כיסוי העצם לעומק של כ-3 מילימטרים. כדי להחדיר את ה-DMEM עם הנגיף או את ה-DMEM הבלתי נגוע (sham) אל תוך המוח, לחצו על כפתור מזרקת ההמילטון (Hamilton syringe) והמתינו שתי שניות עד שהמדיום יחדור למוח לפני הנסיגה.הוצא את המחט בזהירות והצב את העכבר בכלוב נקי ויבש. העכברים יתעוררו מההרדמה במהירות ויחזרו לתפקוד רגיל תוך דקה אחת, 24 שעות לאחר זיהום ויראלי או זיהום דמה (sham) תוך-גולגולתי. ולפני בידוד הלוקוציטים החודרים למוח, מלא מבחנה לצנטריפוגה של Oakridge בעלת תחתית עגולה ב-10 milliliters של RPMI 1640, ב-9 milliliters של percoll וב-1 milliliter של 10X PBS, ואחסן את המבחנה בטמפרטורת החדר.הביאו את ערכת ה-FI call pack plus לטמפרטורת החדר ומלאו מבחנה קונית של 15 מיליליטר בחמישה מיליליטר של RPMI, והניחו אותה על קרח בנקודת זמן זו גם כן. לאחר הקרבת בעל החיים באמצעות מינון יתר של isof fluorine בשיטה מותאמת, הוציאו במהירות את המוח והניחו אותו לתוך המבחנה הקונית של 15 מיליליטר המכילה את חמשת המיליליטר של RPMI, לאחר מכן העבירו את המוח ואת תמיסת ה-RPMI לדוחס רקמות מסוג 10 brook של חברת Pyrex העשוי זכוכית בנפח שבעה מיליליטר, והומוגניזו בעדינות את המוח באמצעות 10 עד 15 תנועות דחיסה.בשלב הבא, העבירו בפיפטה חמישה מיליליטרים נוספים של RPMI אל ההומוגניזטור ובצעו פעולת שאיבה ושחרור (pipette up and down) פעמיים. העבירו את כ-10 המיליליטרים של הומוגנאט המוח אל נבובת הצנטריפוגה בעלת התחתית העגולה והשוליים שהוכנה מראש, והפכו את הנבובת בעדינות פעמיים עד שלוש פעמים כדי לערבב. כעת, סובבו את הומוגנאט המוח ב-7,800 Gs למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה עם רוטור בזווית קבועה.לאחר הצנטריפוגה, הסירו את שאריות המיאלין שצפו לחלק העליון של המדרג. שכבת הלוקוציטים צפה מעל למשקע של כדוריות הדם האדומות. סננו את שכבת הלוקוציטים דרך מסנן תאים של 40 מיקרומטר לתוך מבחנה קונוית של 50 מיליליטר.השלם את התמיסה לנפח של 50 milliliter. בעזרת ה-PMI שלנו, סבב את המבחנה המכילה את תרחיף התאים המדולל בצנטריפוגה קלינית ב-600 Gs למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, שאב את הנוזל העליון (supernatant) ואסוף את משקע התאים.יש להשעות מחדש את המשקע ב-1 mL של באפר FACS ולהוסיף את תרחיף התאים למבחנה עגולה לתשלומי FACS בנפח של 5 mL. יש להוסיף בזהירות מתחת לתרחיפים 1 mL של FiCall Pack Plus בטמפרטורת החדר. סבב את מבחנות ה-FACS ב-800 ×g בצנטריפוגה קלינית למשך 25 דקות.בטמפרטורת החדר וללא הפסקה, הסירו את השכבה הלבנה והפרויה בממשק באמצעות פיפט של מיליליטר אחד והעבירו את השכבה לנבובת FACS חדשה של חמישה מיליליטר. שטפו את התאים עם ארבעה מיליליטר של תמיצת FACS. כעת סובבו שוב את הנבובת בצנטריפוגה קלינית כדי לשקיע את התאים.לאחר מכן, שאבו את supernatant ואספו את משקע התאים. השעיקו את משקע הלוקוציטים ב-blocking buffer, ושמרו על קרח. לאחר מכן, ספרו את התאים.לאחר בידוד וספירה של הלוקוציטים החודרים למוח, יש לזרוע את התאים בפלטה בעלת תחתית בצורת V כהכנה לאימונופנוטיפיקציה באמצעות ציטומטריה של זרימה. לאחר מכן, יש לסובב את התאים בצנטריפוגה קלינית.שחזר את המשקע ב-200 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) והדגר את התאים למשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן, הוסף נוגדנים בריכוז של 1:200, והדגר את התאים למשך 30 דקות נוספות על קרח, הפעם בחשכה. לאחר מכן, סבב את התאים הצבועים בצנטריפוגה קלינית ושאב את הנוזל העליון (supernatant).הוסיפו 200 µL של תמיסת fax למשקע וערבבו בעדינות בעזרת פיפטה (pipette up and down) שלוש פעמים. לאחר מכן, שטפו את התאים בצנטריפוגה פעמיים נוספות באופן דומה; לאחר השטיפה הסופית, השעיו את התאים בריכוז סופי של 2% para formaldehyde והעבירו את התאים הצבועים למבחנות fax. לבסוף, העבירו את התאים המקובעים לבדיקת flow cytometry ונתחו את הקבצים באופן לא מקוון (offline) באמצעות תוכנת fax analysis. laקציות של עכברים בודדו מהמוח באמצעות צנטריפוגה של צמיפות דיפרנציאלית של הומוגנאט רקמה שהוכן מבעלי חיים 24 שעות לאחר זיהום תוך-גולגולתי. כפי שניתן לראות בשני תרשימי הנקודות הללו, מונוציטים דלקתיים LY6C חיוביים, F4/80 חיוביים ו-CD11b חיוביים נמצאו כמעט אך ורק באוכלוסיית CD45 גבוהה, דבר העולה בקנה אחד עם חדירה של תאים אלו מהפריפריה. לעומת זאת, מקרופאגים LY6C שליליים, F4/80 נמוך ו-CD11b חיוביים נמצאו כמעט אך ורק באוכלוסיות CD45 נמוכה (שני הפאנלים השמאליים) ו-CD45 שלילית (הפאנל הימני ביותר), דבר העולה בקנה אחד עם פנוטיפ תא מקומי.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת לוקוציטים ממוחם של בעלי חיים מזוהמים באופן חריף.

isolation-of-brain-infiltrating-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון הזה אנחנו מדגימים כיצד לבודד תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם Encephalomyelitis אוטואימונית ניסיונית.

בידוד של תאים mononuclear ממערכת העצבים המרכזית של חולדות עם EAE

המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול מהיר יעיל לבודד תאים mononuclear מרקמות המוח ואת חוט השדרה אשר יכול להיות מנוצל ביעילות עבור ניתוחים תזרים cytometric.

בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients

בסרטון זה אנו מבצעים בידוד של תאים חד-גרעיניים ממוחו של עכבר באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. תרחיף התא החד-גרעיני המבודד יכול לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.

בידוד תאים חד-גרעיניים ממוח עכבר: טכניקת צנטריפוגה של שיפוע צפיפות לבידוד תאים חד-גרעיניים שוכני מוח

הסרטון מדגים בידוד של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים חודרי גידול ממוח עכבר באמצעות דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי. זה ואחריו צפיפות הדרגתית צנטריפוגה לאסוף את התאים החיסונית לניתוח נוסף.

בידוד תאי חיסון חודרי גידול ממוח מוריני

שיטה לבידוד של לויקוציטים הדלקתי חסיד מכלי דם...

בידוד ואנליזה של Leukocytes המוחי מוחרם מ<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; עכברי אנקה נגוע

אפיון תאי מיאלואידית מוח לאחר שבץ יכול להתבצע על ידי stereology בשיטת fractionator האופטית, או על ידי ניתוח התזרים cytometric של מוח לויקוציטים השעיות. שניהם טכניקות שימושיות לבצע הבחנה phenotypical מדויקת של תת תא מיאלואידית העיקרי נמצאים במוח איסכמי.

Stereological וcytometry זרימת אפיון תת-אוכלוסיות יקוציט במודלים של חולף או קבוע מוחין איסכמיה

דלקת ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהוא פועל כחרב פיפיות המחמירה פגיעה מוחית מוקדמת, אך גם תורמת לתיקון מאוחר יותר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי חיסון מהמוח האיסכמי ואת הפנוטיפ הציטומטרי הזרימה שלהם לאחר מכן.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

מוצג כאן היא שיטה פשוטה לניתוח cytometric הבידוד וזרימה של תאי דם היקפי mononuclear הסתננות-גליומה שמניב נתונים כמותיים זמן תלוי במעמד המספר והפעלת תאים חיסוניים הנכנסים למייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם.

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים אופטימליים לבחינת תאי חיסון חיים ופריפריאליים במערכת העצבים המרכזית, כולל המוח, חוט השדרה וקרומי המוח. כל אחד מהפרוטוקולים הללו מסייע לוודא את תפקודם והרכבם של התאים המאכלסים תאים אלה בתנאים יציבים ודלקתיים.

בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

מחקר זה משתמש cytometry זרימה ושתי אסטרטגיות gating שונות על עכברים מבודדים perfused מוח choroid plexuses; פרוטוקול זה מזהה את תתי-הערכות העיקריות של תאי החיסון המאכלסות מבנה מוח זה.

בידוד ואפיון של תאי מערכת החיסון מזכוכית זרחית עכבר מיקרוניתוח

כדי לחקור את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות, גישה נפוצה אחת היא לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון. כאן, שני פרוטוקולים פשוטים ויעילים ניתנים לבידוד תאי מערכת החיסון מרקמת המוח וממח עצם הגולגולת.

בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר

למדו לבודד לויקוציטים ממוח עכברים נגועים בנגיף TMEV באמצעות צנטריפוגה בגרדיאנט. שיטה זו מאפשרת אפיון תאי חיסון במוח ומחקר תגובות נוירואימונולוגיות.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

גלה סרטונים נוספים