Name: אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: למד שיטת הנדסת רקמות לשימוש בכוח מתיחה לצמיחת אקסונים עצביים במהירות של עד 10 מילימטרים ליום. טכניקה זו מאפשרת מחקר מנגנוני צמיחת עצבים ופיתוח טיפולים לפגיעות עצביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו מומנה על ידי קריירה NSF CBET-0747615. המחברים מבקשים להודות בני הזוג. דאגלס ח סמית ודיוויד פ &#39;שמיני עבור הדרכה ותמיכתם.

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
<li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li>
<li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li>
<li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+%28Muller%29+cells%3A+sensing+and+responding+to+tissue+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li>
<li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair%3A+Surgical+Applications%2C+State+of+the+Art%2C+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
<li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons%3A+continuous+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+patterns%3A+The+mechanics+of+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%2C+Third+Growth+Symposium%22%5BJournal%5D)">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li>
<li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li>
</ol>

התארכות לשעבר vivo מכניות של תאים עצביים הוא תחת פטנט פטנטים בארה&quot;ב # # 6264944 ו 7429267.

שני צעדים קריטיים יש לשים לב במהלך הכנת bioreactors. ראשית, חפיפה אופטימלית בממשק המצע יש צורך להבטיח כי האקסונים יכולים לעבור על המצע נייח. Aclar כי היא מכורבלת מוגזם או לא מושלם אחרת לא אמור לשמש (איור 3). כדי לייעל את החפיפה, לאשר את המצע גרירה הוא שייף שווה וקשרים המצע נייח באופן אחיד על פני תיקון 2-3mm קשר ארוך. חפיפה צריך להיות מותאם לפני כל ניסוי בקפידה על ידי התאמת גובה הרגליים גרירה. שנית, תוך מתן עבור התקשרות של נוירונים, ציפויים המצע לקיים כוחות הסתייגותו ניכר שנגרם על ידי עקירה של מתח bioreactor ועל התכווצות של אקסונים (היידמן בוקסבאום 1990; פפיסטר, איווטה et al 2004;.. Loverde, Ozoka et al 2011). מצעים יש לשטוף היטב במים מעוקרים הן לפני ואחרי ציפוי ליזין. ציפוי צריך להיות מיושם החל aliquots מופשר טרי ולהפיץ בצורה שווה ככל האפשר. חשוב לציין, מצעים לא צריך להתרגש או מופרע אחרת במהלך תקופת ההדבקה. בשלבים הבאים, להימנע ממגע עם מצעים במהלך ציפוי, ו pipet כל הפתרונות מן הקצה המרוחק של נתיבים מן הממשק המצע. טולרנסים בקשרים של כל רכיב bioreactor יכול להתבטא בצורה של רפוי. בתקופה הראשונה של ASG, רפיון במערכת ניכרת תנועה של הטבלה תנועה אוטומטית הליניארי מתרחשת ללא תנועה של גוש גרירה. הנטוש יכול להשתנות בכל ניסוי, אבל הוא בדרך כלל &lt;1mm בחוויה שלנו. מסיבה זו, &quot;טרום מתח&quot; שלב חיסול רפיון של 1mm/day, ליום אחד, מקדים את לוח הזמנים ASG שבמהלכו חלקים bioreactor לעסוק ולהתחיל התנועה של מצעים גרירה. בעיות עשויות להידרש אם הצעד עקירה של הטבלה תנועה אוטומטית הליניארי אינו תואם את העקירה של גוש גרירה לאחר שלב טרום מתח תושלם. Asynchronous, התקות מדויק של גוש גרירה המשויכים &quot;stiction &#39;או חיכוך סטטי בתוך החומרה גרירה כיפוף של מתאם. כדי למנוע בעיות אלה התרחשות, תנועה של גוש גרירה צריך להיבדק על ידי יד, לאחר ההרכבה, תנועה חלקה ללא מאמץ כמעט. אם מחייב מתרחשת, הרכבה הגרירה צריך להיות משוחרר לפני ניסויים. קשיחות מספקת של מתאם זה נחוץ גם כדי להבטיח מדויק, התקות סינכרוני אינם להתגבר על ידי stiction של החומרה גרירה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם הרכיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Polyetheretherketone (הצצה) </td><td> מקמאסטר-קאר, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> מותאמים ללקוח bioreactor קאמרית </td></tr><tr><td> פוליקרבונט </td><td> מקמאסטר-קאר, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> מותאמים ללקוח מכסה תא bioreactor </td></tr><tr><td> מנוע צעד </td><td> אפלייד מוצרים Motion, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> תנועה ליניארית השולחן </td><td> מערכות סרוו, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1.0mm </td><td></td></tr><tr><td> שלב מנוע כונן בקר </td><td> אפלייד מוצרים Motion, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> מבנה Probe Inc, במערב צ&#39;סטר, פנסילבניה </td><td> 1859 </td><td> גרירה תרבות מצעים </td></tr><tr><td> מס &#39;1 coverslip </td><td> המוח מעבדות מחקר, ניוטון, MA </td><td> 4865-1 </td><td> תרבות נייחים המצע </td></tr><tr><td> סיליקון RTV </td><td> מקמאסטר-קאר, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> כותנה שקצהו מטליות </td><td> מקמאסטר-קאר, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-ליזין </td><td> BD, בדפורד, מסצ&#39;וסטס </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

אקסון צמיחה מתיחה: mechanotransduction הצמיחה העצבית

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

במהלך ההתפתחות העוברית מראש הסינפטי, תהליכים עצביים לעבור מרחקים קצרים כדי להגיע ליעדם דרך חרוט צמיחה. במשך הזמן, somata העצבית מופרדים מסופי האקסון שלהם בשל הצמיחה השלד של האורגניזם הגדלת (וייס 1941,. גריי, Hukkanen et al 1992). Mechanotransduction זה משרה מצב משני של צמיחה עצבית המסוגלת להכיל התארכות מתמשך של האקסון (בריי 1984; היידמן בוקסבאום 1994; היידמן, Lamoureux et al 1995;. פפיסטר, איווטה et al 2004).. צמיחה אקסון מתיחה (ASG) היא להעלות על הדעת גורם מרכזי ההבשלה של תהליכים עובריים קצר לתוך העצבים ארוך קטעי החומר הלבן המאפיין של מערכת העצבים הבוגרת. כדי ללמוד ASG במבחנה, אנחנו מהונדסים bioreactors ליישם מתח לתהליכים axonal קצר של תרבויות העצבית (Loverde, Ozoka et al. 2011). כאן, אנו בפירוט את השיטות בהם אנו משתמשים כדי להכין bioreactors והתנהגות ASG. ראשית, בתוך נתיב כל מתיחה של bioreactor, הנוירונים מצופה על מצע גרירה מיקרו מניפולציה. בשלב הבא, נוירונים להתחדש תהליכים axonal שלהם, באמצעות הארכת חרוט צמיחה, על מצע נייח. לבסוף, צמיחה למתוח מבוצע על ידי גרירה הגופים התא מצופה מן מסופי האקסון דבק המצע נייחים; השחזור צמיחה השלד לאחר הארכה חרוט צמיחה. עבודות קודמות הראו כי ASG של עוברי העכברים הגב נוירונים שורש הגרעינים מסוגלים שיעורי צמיחה חסרת תקדים עד 10mm/day והגיע באורכים של עד 10 ס&quot;מ; ובמקביל וכתוצאה מכך בקטרים ​​axonal מוגברת (סמית, וולף et al 2001;. פפיסטר, איווטה et al 2004;. פפיסטר, Bonislawski et al 2006;. פפיסטר, איווטה et al 2006;. סמית 2009). זאת בניגוד דרמטי הרחבה חרוט משובי צמיחה (בהיעדר גירויים מכני) שבו קצב הצמיחה הממוצע 1mm/day עם התחדשות מוצלחת מוגבל באורכים של פחות מ 3 ס&quot;מ (פו גורדון 1997;. פפיסטר, גורדון et al 2011). לפיכך, מחקר נוסף של ASG עשוי לחשוף מנגנוני צמיחה dysregulated המגבילים התחדשות בהעדר גירוי מכני.

שיטה ייחודית בהנדסת רקמות פותחה כדי להאריך סיבי עצב רבים בתרבות ידי משחזרת למתוח צמיחה האקסון, סוג של גידול במערכת העצבים לפיה עצבים להאריך בשילוב עם צמיחה של הגוף והרחבת.

אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

במהלך ההתפתחות העוברית של הקדם-סינפטי, תהליכים עצביים עוברים מרחקים קצרים כדי להגיע ליעדיהם באמצעות קונו הגדילה. עם הזמן, גופי התא העצביים...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפעיל כוח מתיחה על שלוחה אקסונית של נוירון במטרה לעורר ולשמר את צמיחתו. דבר זה מושג על ידי זריעת נוירונים על מצע גרירה המנופל על ידי מיקרו-מניפולציה, השולט בו ריאקטור מנוהל באמצעות מחשב. לאחר הזריעה, הנוירונים מתורגבים למשך עד שבוע, שבמהלכו האקסונים מתפשטים על מצע נייח באמצעות התארכות של קונוס הצמיחה.בשלב הבא, צמיחה באמצעות מתיחת אקסונים (Axon stretch growth) מבוצעת על ידי גרירת גופי התאים שהוצמדו הרחקה מקצות האקסונים הדבקים למצע הסטטי. טכניקת הנדסת הרקמות של צמיחה באמצעות מתיחת אקסונים מסוגלת להביא לקצבי צמיחה מתמשכים של עד 10 millimeters ליום, מה שמוביל, על פי ניתוח מיקרוסקופי, לצמתים וסיבי שלפוחיות ארוכים של מסלולי אקסונים מורחבים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון הרחבה באמצעות זרם צמיחה (growth current extension), הוא שצמיחה באמצעות מתיחת אקסונים מאפשרת לגדל מסלולי אקסונים לכל אורך רצוי בפרקי זמן קצרים יותר.להשלכות של צמיחה במתיחה של אקסונים יש חשיבות רבה, שכן היא מאפשרת לנו לשחזר את האותים הביומכניים המעוררים צמיחה של עצבים. ניתן לחקור אותות אלו במטרה לנצל אותם ולפתח אסטרטגיות חדשות לטיפול בעצבים פגועים או חולים. לפיכך, שיטת הצמיחה במתיחה של אקסונים יכולה לסייע במתן מענה לשאלות יסוד מרכזיות בנוגע להתפתחותו ולתחזוקתו של מערכת העצבים.חשוב לציין כי אנו יכולים לחקור את המנגנוים המאפשרים לאקסונים לגדול בקצבים מהירים יותר מכפי שחשבנו שאפשרי. למערכת הביוריאקטור להעמסת מתיחה של אקסונים יש שלושה רכיבים עיקריים. ראשית, תא ביוריאקטור שבו מתרבתים ומותחים נוירונים.שנית, שולחן תנועה ליניארית אוטומטי, המפעיל כוחות מתיחה. ולבסוף, בקר כונן למנוע פסיעות עם תוכנה לשליטה על הצמיחה במתיחה. כאן הפרוטוקול מודגם באמצעות מערכת מיניאטורית בעלת יכולת פעולה תחת מיקרוסקופ.ייצור אבות-טיפוס של ביו-ריאקטורים בוצע באמצעות מכונת כרסום אנכית כדי להבטיח תאימות ביולוגית וקלות בסטריליזציית התרבית. רכיבי התא עוצבו מ-Polyether ether ketone, ולשם השלמת ההרכבה נעשה שימוש בשלושה מחברים מפלדת אל-חלד 16 העמידה בפני קורוזיה. תא התרבית של הביו-ריאקטור מכיל מסגרת מתיחה, בלוק גרירה מתכוונן, מוטות גרירה למניפולציה חיצונית, ותשתי תרבית חד-פעמיות, הן לגרירה והן לתרבית סטציונרית.שולחן התנועה הליניארית האוטומטי מורכב משולחן תנועה ליניארית עם מנוע פסיעות (stepper motor) המותקן על שולחן דלרין (delrin). תוכנה בשם P si programmer משמשת לתכנות ולניטור של בקר ההנעה המהווה ממשק למנוע הפסיעות. הכינו מצעים לתרבית גרירה על ידי חיתוך של סרט LAR לרצועות דקות, במידות של בערך 0.5 על 2.5 סנטימטרים.שייף קלות את השליש התחתון של תשתי המטפחה הגוררת משני הצדים, באמצעות נייר זכוכית דק בגרעיניות של 1,200, כדי להקל על צמיחת אקסונים מהתשתי הגורר אל התשתית הנייחת. שימוש בלשונית מפרידה מסייע לשייף באופן אחיד יותר. גזור פיסה של חמישה על שבעה סנטימטרים של LAR או השתמש בכיסוי זכוכית (cover slip) מספר 1 שישמש כתשתית הנייחת.נקה את מצעי התרבית ואת תא הביוראקטור בעזרת תמיסת Alcan מדוללת ושטוף היטב במים דה-יוניים. עקר את מצעי התרבית על ידי טבילה ב-70% ethanol למשך 30 דקות. עקר את תא הביוראקטור באמצעות אוטוקלאב בתוך מכל שניתן לעקר באוטוקלאב.לאחר הסטריליזציה, העבירו את מצעי התרבית ותא הביוריאקטור למנדף תרביות רקמה והניחו להם להתייבש באוויר. ניתן להשתמש בקופסת טיפים של פיפטות לייבוש מצעי התרבית. הכניסו את מצעי התרבית באמצעות מקלוני צמר גפן סטריליים.הדביקו את תשתיות התרבית הגרירה לרגלי בלוק הגרירה. באמצעות שכבה דקה של סיליקון RTV, יש להדביק את התשתית בחלק שאינו משויף, תוך הימנעות ממגע עם פני השטח המשויפים של התרבית. לאחר מכן, הדביקו את תשתית התרבית הסטטית לתחתית תא הביוריאקטור.הסר שאריות דבק ובועות אוויר על ידי לחיצה עדינה של מקלון יבש כנגד תחתית התשתית הסטטית. הנח לתא להתייבש במשך יומיים מלאים בתוך מנדף לתרביות רקמה. לאחר יומיים, כוונן את רגלי בלוק הגרירה כדי להשיג חפיפה של שני עד שלושה מילימטרים בין קצות תשתיות הגרירה הסטנדרטיות לבין התשתית הסטטית.יש להקדיש תשומת לב מכרעת לגודל החפיפה. אם היא גדולה מדי, קצות תשתיות הגרירה יסטו מהתשתית הנייחת ויפחיתו את מספר האקסונים החוצים את החפיפה. מקמו את בלוק הגרירה בעמדת ההתחלה כאשר מוטות הגרירה נסוגים לתוך הביוריאקטור.הדק את ברגי הקיבוע כדי למנוע תזוזה של מוטות המתיחה. לפני תחילת גידול המתיחה, בתוך מפתחת תרביות רקמה, יש להוסיף מיליליטר אחד של poly-D-lysine בעל משקל מולקולרי גבוה בתוך מצע ללא סרום בממשק התשתית של כל נתיב. השאר את התמיסה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר; לאחר שעה, שטוף שלוש פעמים במים דאיוניים, ולאחר מכן בביצוע שטיפה סופית עם מצע גידול. זרע explan של ganglion של השורש האחורי מגושים של חולדות בשלב E 16 על תשתיות תרבית המתיחה המשויפות.באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, ראשית יש לדלל את הדגימה בטיפות בתוך צלחות פטרי, ולאחר מכן לאסוף שלוש עד ארבעה צמחים באמצעות פלטת פיפטה של 100 µL. מקמו את הצמחים בקצה של מצע הגרירה בתוך שלולית קטנה של מצע תרבית בנפח של עד 1 mL. כמות זו של מצע מספיקה כדי למנוע התאיידות למשך מספר שעות תוך הגבלת תנועת הצמחים.סגרו את מכסה הביוראקטור והעבירו אותו לאינקובטור למשך שעה אחת כדי לאפשר לחצאי הביצים להיצמד. לאחר שעה, מלאו את הביוראקטור במצע תרבית בנקודה הרחוקה ביותר מחצאי הביצים כדי למנוע את ניתוקם. דגרו את הביוראקטור למשך חמישה ימים כדי לאפשר לנוירונים של ה-DRG להושיט שלוחות אקסוניות על התשתית הנייחת.בתוך מנדף לתרביות רקמה, מלאו את מאגרי הביוראקטור במי מלח פוספט (phosphate buffered saline) כדי להלחיח את התא ולמנוע אידוי מוגבל של המדיום. בצעו החלפה סופית של המדיום על ידי מילוי נתיבי הביוראקטור עד למלוא קיבולתם. הניחו את הביוראקטור על שולחן תנועה לינארית אוטומטית בתוך אינקובטור שאינו מולחח.חברו את מתאם מוט הגרירה למוטות הגרירה. באמצעות תוכנת Cy programmer, הזיזו את הבמה בשולחן התנועה הליניארית כדי ליישר אותה עם מתאם מוט הגרירה, וחברו אותו לבמה לנוחות העבודה.הכינו מראש רצפי תכנות כדי לתפעל את הבמה במרווחים ספציפיים. לפני תחילת תוכנית גידול ה-Axon Stretch, שחררו את ברגי הקיבוע של תא הביוריאקטור. המתיחות מופעלות באופן מדורג באמצעות סדרה של שלבי העתקה קטנים המופרדים על ידי תקופות מנוחה.פרדיגמה זו מתחילה בביצוע שני צעדי מיקרון כל 172 שניות, מה שיוביל למתיחה נטו של מילימטר אחד במהלך 24 השעות הראשונות לאחר המתיחה המקדימה. לאחר יום אחד, ניתן להאיץ את קצב המתיחה על ידי הגדלת גודל צעד ההעתקה, או קיצור זמן המנוחה. תוצאות מייצגות של תהליך צמיחת המתיחה של האקסון מוצגות כאן.התאים הראשונים בתוך השתלים שהונחו נודדים אל מצע הגרירה. במהלך חמישה הימים הבאים, קוני גדילה (growth cones) מאריכים שלוחות אקסוניות על המצע הסטטי. ברגע שקוני הגדילה התארכו בלפחות מילימטר אחד על פני המצע הסטטי, מתחיל תהליך של גדילה במתיחה של האקסונים.המצע הגרירה מורחק מקוני הצמיחה של ה-AED. בסדרה של שלבים, הגמישות של האקסונים המגשרים ניכרת מיד בעת מתיחתם. בדרך כלל, האקסונים נהיים דקים בתחילה, אך בתוך שעות נכנסים לשלב צמיחה שבו הם משקמים ושומרים על קוטרם. בתוך 24 שעות של צמיחה תחת מתיחה רציפה, האקסונים מראים סבילות מוגברת למתיחה ומסוגלים לעמוד בעליות בקצב המתיחה.ככל שהאקסונים גדלים ומאריכים עוד יותר ו-FAS זורמים, הם מפגינים סבילות גוברת למתיחה. כאן ניתן להבחין בצפיפות של אקסונים שגדלו תחת מתיחה כאשר הביוריאקטור נ bumped בכוונה ביד. לעיתים, אקסונים עלולים להתנתק מהמצע הסטטי עקב הידבקות לא מספקת.זהו הכישלון הנפוץ ביותר, והוא סביר להתרחש ביותר אם גודל הצעד הראשוני גדול מדי או אם הת substrat הסטטי לא כוסה כראוי. במקרה זה, חלק מהאקסונים מתנתקים מה-substrat הסטטי עם תחילת הצמיחה במתיחה בשל גודל צעד גדול מדי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להקדיש את הזמן הדרוש להכנת הממשק של ה-substrat.הקצה והמצע צריכים לחפוף את המצע הסטטי בשני עד שלושה מילימטרים, ויש לזרוע את ה-DRG קרוב ככל האפשר לממשק בזמן התרחשות הגדילה במתיחה. תהיה לכם הזדמנות ייחודית לחקור גדילת אקסונים באמצעות גששים פלואורסצנטיים חיים או על ידי ליזיס של התאים בזמן שהם נמתחים, כדי לחקור ביטוי גנים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש במתיחה מיושמת כדי להניע גדילת אקסונים.באמצעות טכניקה זו, אנו מגלים שלאקסונים יש יכולת מדהימה לגדול במהירות רבה יותר מכפי שחשבנו שאפשרי, וליצור קשרים שלא ניתן להשיג בשום דרך אחרת.

axon-stretch-growth-the-mechanotransduction-of-neuronal-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

יישום ישיר מדידות של כוחות על הנוירונים בטווח 2000-1000 microdyne מושגות עם דיוק גבוהה באמצעות מחטים זכוכית מכויל. מתודולוגיה זו ניתן להשתמש כדי לשלוט ולמדוד כמה היבטים של התפתחות axonal, לרבות ייזום axonal, מתח axonal, מהירות של התארכות axonal ו וקטורים כוח.

מניפולציה מכני של נוירונים שליטה פיתוח axonal

חיים חיידקים גראם שליליים גראם חיוביים יכולים להיות משותקת על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

אנו מציגים במאמר זה פלטפורמה חדשני מתיחה שיכול לשמש כדי לחקור את תגובות תא בודדות לעיוות מכאנית biaxial איזוטרופי מורכב ולכמת את התכונות מכאניות של רקמות ביולוגיות.

פלטפורמה חדשני מתיחה עבור יישומים בתאים והרקמות mechanobiology

פרוטוקול הדמיה חדשני פותח באמצעות מפעיל מכני מונע מנוע מותאם אישית כדי לאפשר מדידה של תגובות בזמן אמת למתח מכני בתאים חיים. רלוונטית למכניוביולוגיה, המערכת יכולה ליישם זנים של עד 20% תוך שהיא מאפשרת הדמיה כמעט בזמן אמת עם מיקרוסקופ כוח קונפוקלי או אטומי.

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של נוירונים של גנגליון שורש הגב (DRG) שבודדו מחולדות ואת התרבית של נוירוני DRG על מערכת תרבית תאים סטטית מתוחה מראש כדי לשפר את יישור האקסונים, עם תרבית משותפת של תאי שוואן (SCs) כדי לקדם מיאלינציה.

גישת שפר מערך myelination של נוירונים שורש הגבה גנגליון

הליך זה מתאר כיצד במהירות ליזום, להרחיב ולחבר neurites מאורגן בתאי microfluidic באמצעות poly-D- ליזין מצופה חרוזים קבוע micropipettes כי מדריך התארכות neurite.

Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית

באמצעות התקן שתוכנן בעבר כדי להחיל זן מכני לתאים חסיד, נייר זה מתאר גיאומטריה תת שכבה מחדש מכשיר מותאם אישית עבור ברזולוציה גבוהה תא יחיד הדמיה של תאים מתוחים עם המטרה טבילה 100x שמן.

ברזולוציה גבוהה הדמיה של דינמיקה גרעינית בתאים חיים תחת מתיחה Uniaxial המתח

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

כאן, אנו מציגים מכשיר מתיחה שווה צירי רב-תכליתי המופעל פניאומטית ותואם למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.

מכשיר מתיחה שווה צירי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית של תאים חיים בהגדלה גבוהה

כאן אנו מציגים מכשיר חדשני שמיישם גלי עיוות איזוטרופיים וחד-ציריים על תאים, תוך תמיכה בתרבות על תת-קרקעיות עם קשיחות מכווננת ומטריצות חלבון מותאמת אישית. פלטפורמה פשוטה וחסכונית זו מאפשרת לחוקרים לחקור כיצד רמזים מכניים מווסתים את תפקוד התאים הן במחקרים בסיסיים והן בהקשרים רלוונטיים למחלות.

פלטפורמה חדשנית למתיחות והדמיה תאית חובנית

למד שיטת הנדסת רקמות לשימוש בכוח מתיחה לצמיחת אקסונים עצביים במהירות של עד 10 מילימטרים ליום. טכניקה זו מאפשרת מחקר מנגנוני צמיחת עצבים ופיתוח טיפולים לפגיעות עצביות.

אקסון צמיחה מתיחה: Mechanotransduction הצמיחה העצבית

גלה סרטונים נוספים