שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג מספר תרביות של מקרופגים מתרביות ראשוניות מעורבות של תאי כבד של חולדה, ללא צורך בציוד מורכב או במיומנויות מיוחדות. דבר זה מושג תחילה באמצעות דיסוציאציה של תאי כבד של חולדה בוגרת על ידי פרפוזיה של קולגנאז, ולאחריה בידוד של פראקציית תאי ההפטוציטים הפרנכימתיים. לאחר מכן, התאים מדגגרים בבקבוקי תרבית רקמה מסוג T 75 עם מצע גידול כדי להקים תרביות ראשוניות מעורבות של תאי כבד.

לאחר 10 עד 12 ימי תרבית, מבצעים ניעור לבקבוקי התרבית כדי להקל על העברת המקרופאגים לצלוחיות פלסטיק, מהן הם נאספים באמצעות היצמדות סלקטיבית לאחר תקופת אינקובציה קצרה. לבסוף, ניתן לאסוף יותר מ-10 מהתאים בעלי שש תכונות באופן חוזר מאותם בקבוקי תרבית רקמות T 75 במרווחים של יומיים עד שלושה ימים למשך יותר משבועיים. שיטות בידוד למקרופאגים של הכבד תוארו היטב בספרות.

עם זאת, מרבית השיטות הקודמות דורשות ציוד מתוחכם, כגון סנטריפוגה למשקעים, ומיומנויות טכניות גבוהות. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה וחדשנית להשגת מקרופאגים של הכבד במספר ובדרגת טוהר מספקים מתרביות ראשוניות מעורבות של תאי כבד מבוגרים, שאינה דורשת ציוד מיוחד או מיומנויות מעבדה מתקדמות. נתיחה של בעלי חיים, פרפוזיה של הכבד והכנת תאים יודגמו על ידי הדוקטורים Norco, Yamanaka ו-Miko yoshioka במכון הלאומי לבריאות בעלי חיים.

לאחר מכן, ד"ר Taketo Takeno מהמכון הלאומי למדעי החקלאות והביולוגיה ידגים את הבידוד והטיהור של מקרופאגים מהכבד מדגימות תרבית. אז בואו נתחיל. כדי להתכונן לפרפוזיה של כבד חולדה, התחילו בחימום מוקדם של בקבוק אחד של תמיסת שטיפה ובקבוק אחד של תמיסת קולגנאז.

לאחר אישור הסדציה באמצעות צביטה בעור, מקמיסו חולדה זכר בוגרת מורדמת בתבנית נירוסטה ורססו את הבטן והבית על ידי 70% ethanol. לאחר מכן, בצעו חתך קטן במרכז הבטן בעזרת מספרי דיסקציה וקלפו את העור לאחור. לאחר מכן פתחו את הבטן בעזרת המספריים ואשרו את מיקומו של הווריד הפורטלי.

בשלב הבא, העבירו את חוט הנימי הניתוחי מתחת לווריד הפורטלי (portal vein) והדקו את החוט באופן רפוי. לאחר מכן, סגרו את החלק הדיסטלי של הווריד הנבוב התחתון (inferior vena cava) ואת הווריד המזנטרי (mesenteric vein) באמצעות תפס Mosquito למניעת רפלקס של דם אל הכבד. פתחו את חלל בית החזה על ידי חיתוך הסרעפת במספריים וחשפו את הלב; לאחר ביצוע חתך קטן בווריד הפורטלי באמצעות מספרי עיניים, הכניסו לווריד קטטר פלסטיק בקוטר שני מילימטר והדקו את החוט בחוזקה סביב הקטטר.

טענו מערכת פרפוזיה עם תמיסת השטיפה שחוממה מראש ולאחר מכן חברו אותה לקטטר. התחילו את הפרפוזיה ב-C two בקצב של 10 milliliters per minute. במקביל, בצעו חתך בדופן העלייה הימנית באמצעות מספרי דיסקציה.

המשיכו בביצוע הפרופוזיה במשך 10 דקות, ולאחר מכן החליפו את תמיסת הפרופוזיה בתמיסת קולגנאז (collagenase) ובצעו פרפוזיה למשך 10 עד 20 דקות. מלאו כוס כימית סטרילית ב-25 milliliters של תמיסת קולגנאז בקצב של 10 milliliters לדקה. לאחר מכן, הוציאו את הכבד שעבר פרפוזיה והניחו אותו בזהירות בתוך הכוס הכימית.

קצצו את הכבד לחתיכות קטנות באמצעות מספריים. הוסיפו 75 milliliters של MEM קר לתרחיף התאים שהתקבל. לאחר פיפטור עדין, סננו את התרחיף דרך מסננת תאים של 100 micrometer.

כדי להסיר את רקמת החיבור מתוך שברי הרקמה שלא עוכלו, אספו את התסנין למבחנות קוניות של 50 מיליליטר. העבירו את התסנין למבחנות קוניות של 50 מיליליטר ושטפו את התאים ארבע פעמים על ידי סבב ראשון של צנטריפוגה במהירות 50 Gs למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כאשר הצנטריפוגה נעצרת, השליכו בזהירות את הנוזל העליון ולאחר מכן השעיקו מחדש את המשקע ב-MEM קר, ובצעו סבב צנטריפוגה נוסף לתאים לאחר השטיפה האחרונה.

שחזר את תאי הכבד בתוך תווך גידול. כעת, זרע את התאים בחמישה עד 10 בקבוקי תרבית רקמה T 75 בצפיפות של 6.7 times 10 to the fourth תאים לסמ"ר. הנח את בקבוקי התרבית באינקובטור והחלף את תווך הגידול מדי יומיים עד שלושה ימים.

לאחר יום אחד של תרבית, ההפטוציטים הפארנכימליים מתפשטים על פני השטח של הבקבוק ומראים מורפולוגיה פוליגונלית טיפוסית דמוית אבן קופל (copal stone) עם גרעין עגול אחד או שניים. בתוך מספר ימי תרבית, ההפטוציטים הפארנכימליים מאבדים את מורפולוגיית התאי האפיתליאלי שלהם והופכים לתאים פיברובלסטיים שטוחים יותר. בסביב היום השישי, במיקרוסקופ ניגודיות פאזה, תאים עגולים ובהירים דמויי מקרופאג מתחילים להתרבות על גבי שכבת התאים הפיברובלסטיים. צמיחת התאים הדמויי מקרופאג מגיעה לרמות מקסימליות בסביב היום ה-12.

מספר התאים דמויי המקרופאגים פוחת סביב היום ה-19, כאשר שכבת התאים הפיברובלסטיים מתחילה להתנוון. לכן, לאחר כ-7 עד 10 ימי תרבית, אנו תולה את המקרופאגים שהתרבו על שכבת התאים בתוך תוצר התרבית, באמצעות ניעור הדדי של בקבוקי התרבית למשך 30 דקות לאחר שהמקרופאגים הותלו מחדש. מלאו כל אחת מהצלחות הפלסטיק בנפח 100 מילימטר שאינן בדרגת תרבית רקמות בתוצר מתוך שני בקבוקי T 75.

מלאו מחדש את בקבוקי התרבית במצע גידול והחזירו אותם לאינקובטור. דגרו את הצלחות הפלסטיק למשך 30 דקות לאחר תקופת הדגירה, שטפו את הצלחות שלוש פעמים על ידי שאיבת המצע ושטיפה עדינה של צלחת הפלסטיק ב-PBS כפי שניתן לראות כאן; כבר לאחר 10 דקות מההזרעה, תאי מקרופאג נצמדים לפני השטח של הצלחת בעוד שתאי פיברובלסטים מזוהמים אחרים נותרים תלויים. לאחר השטיפה ב-PBS, מתקבלת אוכלוסיית מקרופאגים מטהרה מאוד.

כפי שניתן לראות בדמות זו, התאים מקבלים מורפולוגיה טיפוסית של מקרופגים לאחר 40 דקות של תרבית, ותאים במצב של מיטוזה נצפים לעיתים קרובות כפי שמוצג על ידי החיצים. כדי לאסוף אוכלוסייה חדשה ומזוכה מאוד של מקרופגים, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת trip LE Express לתאים השטופים והחזירו את הצלחות לתוך האינקובטור למשך 10 דקות נוספות. לאחר תקופת דגירה זו, הוסיפו תשעה מיליליטרים של מצע גידול, ולאחר מכן גרדו בעדינות את המקרופגים ההיצמדים באמצעות מגרדת תאים (cell scraper), העבירו לשפופרת קונית של 15 מיליליטר, סובבו בצנטריפוגה והשליכו את העלייה (supernatant).

הוסיפו מיליליטר אחד של מצע גידול, פלקו את גושי התאים שסוספנדו לתאים בודדים באמצעות פיפוט נמרץ, וספרו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר כפי שמוצג בגרף זה; ניתן לאסוף יותר מ-10⁶ תאים מבקבוק תרבית T 75 שוב ושוב במרווחים של יומיים עד שלושה ימים במשך יותר משבועיים, מה שמאפשר תנובת תאים כוללת של 10⁷ לבקבוק תרבית T 75. כפי שמוצג בתמונות אלה, התאים המבודדים נצבעו אימונו-היסטוכימית באמצעות נוגדנים מונוקלונליים נגד אנטיגנים של מקרופאגים של חולדה כגון CD 68 או ED 1 ו-CD 172 A או OX 41. תאים אלו הפגינו תכונות פונקציונליות של מקרופאגים, כגון פגוציטוזה פעילה של מיקרו-חרו지를 המסומנים ב-FITC.

בסרטון זה, הצגנו שיטה פשוטה ויעילה להשגת מקרופאגים מתרביות ראשוניות מעורבות של תאי כבד אדומים בוגרים. הפרוצדורה שלנו אינה דורשת ציוד או מיומנויות מורכבים, אך מספקת מספרים מספיקים של מקרופאגים טהורים שניתן לאסוף שוב ושוב מאותה תרבית של brass. ניתן ליישם שיטה זו על מיני יונקים אחרים.

תודה שצפיתם בסרטון ובהצלחה בניסוייכם העתידיים. בברכה.