שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשיג תרביות מקרופאגים מרובות מתרביות ראשוניות מעורבות של תאי כבד של חולדות ללא צורך בציוד או מיומנויות מורכבות. זה מושג תחילה באמצעות דיסוציאציה של תאי כבד של חולדות בוגרות על ידי זלוף קולגנאז, ולאחר מכן בידוד של חלק תאי ההפטוציטים הפרנכימליים. לאחר מכן, התאים מודגרים ב-T 75, צלוחיות תרבית רקמות עם מדיום גידול כדי ליצור תרביות ראשוניות מעורבות של תאי כבד.

לאחר מכן, לאחר 10 עד 12 ימי תרבית, צלוחיות התרבית מנוערות כדי להקל על העברת המקרופאגים לצלחות פלסטיק שמהן הם נקצרים לאחר הידבקות סלקטיבית לאחר תקופת דגירה קצרה. לבסוף, ניתן לקצור יותר מ-10 מתוך ששת התאים שוב ושוב מאותן צלוחיות תרבית רקמה T 75 במרווחים של יומיים עד שלושה במשך יותר משבועיים. שיטות בידוד למקרופאגים בכבד תוארו היטב.

עם זאת, רוב השיטות הקודמות דורשות ציוד מתוחכם כמו מאייר צנטריפוגלי ומיומנויות טכניות מעודנות. כאן אנו מציגים שיטות פשוטות וחדשניות להשגת מקרופאגים בכבד בכמות ובטוהר מספיקים מתרביות ראשוניות מעורבות של תאי כבד עטופים בוגרים שאינה דורשת ציוד מיוחד או כישורי מעבדה מתקדמים. דיסקציה של בעלי חיים, זלוף של הכבד והכנת ציטים יודגמו על ידי הרופאים נורקו, יאמאנאקה ומיקו יושיוקה במכון הלאומי לבריאות בעלי חיים.

לאחר מכן יוצג בידוד וטיהור של מקרופאגים בכבד מסיכונים תרבותיים על ידי ד"ר טקטו טאקנו במכון הלאומי למדעי האגרו-ביולוגיה. אז בואו נתחיל. כדי להתכונן לשפע של כבד החולדה התחל בחימום מראש בקבוק אחד של תמיסת כביסה ובקבוק אחד של תמיסת קולגנאז.

לאחר מכן, לאחר אישור ההרגעה על ידי צביטה בעור, הניחו חולדה זכר בוגר מורדם במחבת נירוסטה ורססו אתנול 70% על הבטן ובית החזה שלה. לאחר מכן, בצע חתך קטן באמצע הבטן בעזרת מספריים מנתחים וקילף את העור. ואז פתח את הבטן עם המספריים ואשר את מיקום וריד הפורטל.

לאחר מכן, העבירו את החוט הכירורגי מתחת לווריד הפורטל והדקו את החוט באופן רופף. לאחר מכן מהדקים את החלק הדיסטלי של הוואנוק קאווה התחתון והווריד המזנטרי בעזרת מהדק יתושים כדי למנוע ריפלוקס דם לכבד. פתח את חלל בית החזה על ידי חיתוך הסרעפת במספריים וחשוף את הלב לאחר ביצוע חתך קטן בווריד הפורטל בעזרת מספריים עיניים, הכנס קטטר פלסטיק של שני מילימטר לווריד והדק את החוט בחוזקה סביב הקטטר.

טען מערכת זלוף עם תמיסת הכביסה החמה מראש ואז חבר אותה לקטטר. התחל זלוף ב- C two בקצב של 10 מיליליטר לדקה. במקביל, בצע חתך בקיר האטריום הימני בעזרת מספריים מנתחים.

המשיכו בשפע במשך 10 דקות, ולאחר מכן העבירו את תמיסת השפע לתמיסת הקולגנאז והחליפו למשך 10 עד 20 דקות. בקצב של 10 מיליליטר לדקה, מלאו סטרילית ב -25 מיליליטר תמיסת קולגנאז. לאחר מכן מוציאים ומניחים בזהירות את הכבד המחורבן לתוך הכוס.

טוחנים את הכבד לחתיכות קטנות בעזרת מספריים. הוסף 75 מיליליטר של MEM קר לתרחיף התאים שנוצר. לאחר פיפטינג עדין, סנן את המתלה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר.

כדי להסיר את רקמת החיבור בשברי הרקמה הלא מעוכלת, אסוף את המסנן לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר. העבירו את המסנן לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר ושטפו את התאים ארבע פעמים על ידי סיבוב התאים ב-50 גרם למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. עם ההפסקה, השליכו בזהירות את הסופרנטנט ולאחר מכן השעו מחדש את הכדור ב-MEM קר וסובבו את התאים שוב לאחר הכביסה האחרונה.

השעו מחדש את תאי הכבד במדיום הגידול. כעת זרעו את התאים בחמישה עד 10 צלוחיות תרבית רקמה של 75 T בצפיפות של 6.7 כפול 10 עד תאים רביעיים לסנטימטר מרובע. מניחים את צלוחיות התרבות בחממה ומחליפים את מצע הגידול כל יומיים-שלושה.

לאחר יום אחד של תרבית, הפטוציטים פרנכימליים מתפשטים על פני הבקבוק ומראים מורפולוגיה אופיינית דמוית אבן קופלית מצולעת עם גרעין עגול אחד או שניים. תוך מספר ימים של תרבית, הפטוציטים פרנכימליים מאבדים את המורפולוגיה של תאי האפיתל שלהם והופכים לתאים פיברובלסטיים שטוחים יותר בסביבות היום השישי, ניגודיות פאזה, תאים דמויי מקרופאגים עגולים בהירים מתחילים להתרבות על יריעת התא הפיברובלסטית. צמיחת התאים דמויי המקרופאגים מגיעה לרמות מקסימליות בסביבות היום ה-12.

מספר התאים דמויי המקרופאגים יורד בסביבות היום ה-19 כאשר יריעת התאים הפיברובלסטיים מתחילה להתנוון. לפיכך, בסביבות שבעה עד עשרה ימים של תרבית, אנו משהים את המקרופאגים שהתרבו על יריעת התא לתוך מדיום התרבית על ידי ניעור הדדי של צלוחיות התרבית למשך 30 דקות לאחר שהמקרופאגים הושעו מחדש. שחקו בכל אחת מכלי הפלסטיק בגודל 100 מילימטר ללא תרבית רקמות עם המדיום משתי צלוחיות T 75.

מלאו מחדש את צלוחיות התרבות במדיום גידול והחזירו אותם לחממה. דגרו על כלי הפלסטיק למשך 30 דקות לאחר תקופת הדגירה, שטפו את הכלים שלוש פעמים על ידי שאיבת המדיום ושטיפה עדינה של כלי הפלסטיק עם PBS כפי שניתן לראות כאן כבר 10 דקות לאחר ציפוי תאים דמויי מקרופאגים המחוברים למשטח הכלי בעוד תאים פיברובלסטיים מזהמים אחרים נשארים תלויים. לאחר שטיפת ה-PBS מתקבלת אוכלוסיית מקרופאגים מטוהרת מאוד.

כפי שניתן לראות באיור זה, התאים מקבלים מורפולוגיה טיפוסית של מקרופאגים לאחר 40 דקות של תרבית ותאים מיטוטיים נצפים לעתים קרובות כפי שמצוין על ידי החצים. כדי לאסוף את אוכלוסיית המקרופאגים המטוהרת החדשה הזו במיליליטר אחד של תמיסת LE Express לתאים השטופים ולהחזיר את הכלים לאינקובטור למשך 10 דקות נוספות. לאחר תקופת הדגירה הזו, הוסיפו תשעה מיליליטר של מצע גידול ואז גרדו בעדינות את המקרופאגים המחוברים עם מגרד התאים והעבירו לצנטריפוגה של צינור חרוטי של 15 מיליליטר והשליכו את הסופרנטנט.

הוסף מיליליטר אחד ממצע הגידול, פרק את גושי התאים התלויים לתאים בודדים על ידי פיפטינג נמרץ, ספר את מספר התאים לפי ציטומטר המו כפי שמוצג בגרף זה, ניתן לקצור יותר מ-10 מתוך ששת התאים מבקבוק תרבית T 75 שוב ושוב במרווחים של יומיים-שלושה במשך יותר משבועיים, מה שמאפשר תפוקת תאים כוללת של 10 עד שבעה לכל בקבוק תרבית T 75. כפי שמוצג בתמונות אלה, התאים המבודדים הם כתם חיסוני עם נוגדנים חד-שבטיים כנגד אנטיגנים מקרופאגים של חולדות כגון CD 68 או ED אחד ו-CD 1 72 A או OX 41. לתאים אלה היו תכונות פונקציונליות של מקרופאגים כגון פגוציטוזיס פעיל של מיקרו-חרוזים המסומנים ב-FITC.

בסרטון זה הצגנו שיטה פשוטה ויעילה להשגת מקרופאגים מתרביות ראשוניות מעורבות של תאי כבד אדומים בוגרים. ההליך שלנו אינו דורש ציוד או מיומנויות מורכבות, אך מספק מספר מספיק של מקרופאגים טהורים שניתן לקצור שוב ושוב מאותה תרבית פליז. ניתן ליישם שיטה זו על מיני יונקים אחרים.

תודה שצפית בסרטון ובהצלחה בניסויים העתידיים שלך. לחיים.