בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

מטרת נוהל זה היא לבצע דימות יציב in vivo של חוט השדרה בעכבר באמצעות מיקרוסקופיה של שני פוטונים. הדבר מושג תחילה על ידי הרדמת בעל החיים בתערובת הרדמה המשיגה קצב נשימה יציב ורגוע. השלב השני של הנוהל הוא חשיפת עמוד השדרה בגובה הרצוי ולאחר מכן ביצוע למינקטומיה (laminectomy) כדי לחשוף את חוט השדרה שמתחתיה, כך שניתן יהיה לדמותו in vivo.

השלב השלישי הוא הנחת בעל החיים על התקן לייצוב עמוד השדרה. השלב האחרון הוא בידודו של קטע חוט השדרה החשוף. כהכנה לדימות in vivo, ניתן בסופו של דבר להשיג תוצאות המפרטות את ההתנהגות הדינמית של תאים ואת האינטראקציות שלהם עם סוגי תאים או מבנים אחרים בחוט השדרה החי, באמצעות דימות in vivo בשיטת time-lapse בעזרת מיקרוסקופיית פוטונים כפולים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על ניסיונות קודמים להדמיית חוט השדרה in vivo הוא שהיא מייצרת נתוני הדמיה in vivo שאינם דורשים עיבוד נתונים לאחר מכן, וניתן להעריכם ולהשתמש בהם לניתוחים נוספים באופן מיידי. המשמעויות של טכניקה זו חלה גם על טיפול בעקבות פגיעה או מחלה של חוט השדרה, כיוון שהיא מאפשרת, למשל, ללמוד על התקדמות דגנרציה או רגנרציה של אקסונים בזמן אמת לאחר פגיעה, מעבר לפגיעה בחוט השדרה עצמה. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור את התקדמותם של תהליכים דלקתיים או נוירודגנרטיביים במודלים של מחלות בבעלי חיים, כגון טרשת נגדית (multiple sclerosis) או סקלרוזיס חוטר ניווני (amyotrophic lateral sclerosis), שבהם הפתולוגיה של המחלה בולטת בחוט השדרה.

התחילו את הפרוצדורה על ידי שקילת החיה. לאחר מכן, הרדימו את החיה על ידי הזרקת תערובת ההרדמה באופן תוך-peritoneal. בצעו צביטה קבועה של הבהונות כדי להבטיח הרדמה עמוקה של החיה לאורך כל הניסוי, והוסיפו חצי מהמינון המקורי של חומר ההרדמה, מדי שעה או לפי הצורך.

לאחר מכן, מרחו פומדת דמעות מלאכותיות על העיניים כדי למנוע התייבשות ונזק לקרנית. קצצו את הפרווה בגב בעזרת מכשיר קיצוץ וגלחו את הפרווה שנותרה בעזרת להב חד. לאחר חיטוי האזור המגולח, הניחו את בעל החיים תחת מיקרוסקופ והתחילו את הפרוצדורה ביצירת חתך אורכי קטן של כ-1.5 סנטימטר מעל גובה החוליה הרצויה.

חשוף את שרירי הגב על ידי הרחקה זהירה של רקמת החיבור התת-עורית. לאחר מכן, הפר בעדינות את השרירים הפרה-ורטברליים (paravertebral muscles) מעמוד השדרה בגובה הרצוי. בצע כמה שפחות חתכים כדי לנתק את השרירים משני צדדיו של כל זקיר (spinous process).

לאחר מכן, גרדו את השרירים שהופרדו מהמשטח הלמינרי. השתמשו במכשיר כויית כלי דם קטן כדי לשלוט בדימומים קלים במידת הצורך. המשיכו לגרד את השרירים עד שתחשפו באופן מספיק את הלמינה שמתחתיהם, ועד שתוכלו לזהות בבירור את הלמינה שבכוונתכם להסיר.

כדי להכין את נקודות הכניסה עבור התפסנים הספונליים בכל צד של עמוד השדרה, הכניסו את קצותיהם של מספריים מעוקלים בין השרירים הפרא-ורטברליים והזיזו בזהירות את הרקמה השרירית כדי ליצור ארבעה כיסים שבהם יוחדרו התפסנים. הרימו את עמוד השדרה באמצעות פינצטה בעלת שיניים ישרות כדי לאפשר הכנסה בטוחה של מספריים בעלי קצה קהה ומעוקל מתחת ללמינה מבלי לגעת בחוט השדרה. לאחר מכן בצעו את הלמינקטומיה על ידי חיתוך איטי של העצם בצד אחד ולאחר מכן בצד השני; השתמשו במקלון צמר או הכניסו פיסה קטנה וגזורה מראש של ספוג ג'לטין סופג (gel foam) לצד החתך כדי להגביל דימומים קלים.

לאחר מכן, השתמשו בנוזל חוט ששכיח (CSF) מלאכותי סטרילי שחומם מראש כדי לשטוף את הרקמה. התקן לייצוב עמוד השדרה תוכנן בהתאמה אישית עם הרכיבים העיקריים של תפסני חוט השדרה המורכבים של Nagate STSA, ומתאם החזקת ראש בעל שישה ראשים מדגם Nagate MA. לוח בסיס מפלדת אל חלון יוצר כדי להחזיק שני חלקי naga ביישור, כך שראש החיה ייתמך בעוד שעמוד השדרה והזנב שלה יהיו מקובעים בתפסנים.

יש לזכור כי המכשיר כולו צריך להיכנס תחת עדשת המיקרוסקופ כאשר שולחן המיקרוסקופ מונמך כדי לייצב את בעל החיים. ראשית, הניחו אותו על רפידת הגבהה בלוח הבסיס של מכשיר ייצוב עמוד השדרה. לאחר קיבוע הראש במתאם החזקת הראש, מקמו את תסבכת עמוד השדרה של מכשיר ה-SDSA לאורך הציר הקדמי-אחורי של בעל החיים בכיסים שהוכנו מראש, משני צדי הלאמיקטומיה.

מקמו את שני התפסים בזווית של כ-45 מעלות ביחס לציר הגב של בעל החיים, כדי לאפשר מספיק מקום להורדת עדשת הטבילה במים מעל חוט השדרה החשוף. לאחר מכן, מקמו את התפס השלישי בבסיס הזנב, כך שגופו של בעל החיים יוכל להיות תלוי לאחר הסרת כרית ההגבהה בניסוי הדימוי. לאחר מכן, בנו בריכה קטנה של דבק ג'ל (gel seal) סביב חוט השדרה החשוף כדי להקל על שמירת חוט השדרה ב-A CSF.

לאחר מכן, הסיר את רפדית ההגבהה כאשר תהיה מוכן להתחיל בהדמיה In vivo, הבא את מכשיר הייצוב לתא המיקרוסקופ שחומם מראש והנח אותו על במה המיקרוסקופ כשהיא במצב נמוך. ודא שהלמינקטומיה מיושרת עם העדשה. הורד בזהירות את עדשת הטבילה במים לתוך תמיסת ה-A CSF, וודא שהיא אינה נוגעת בתסמיכי העמוד השדרה או באטום הג'ל.

השתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אפי-פלואורסצנטית (epi fluorescence) כדי לזהות את אזור העניין ולאחר מכן התמקדו בו. עברו למצב סריקה בלייזר ובצעו דימות in vivo תוך שימוש בעירור לייזר דו-פוטוני, באורך גל, במראות דיכרואיות ובמסנני Band pass המתאימים לפלואורופורים הנמצאים ברקמת הדגימה. בסיום ניסויי הדימות, הוציאו את בעל החיים מהתקן ייצוב עמוד השדרה.

נגב בזהירות את חותם הג'ל מהאזור שסביב הלמינקטומיה ונקה אותו. תפר היטב את שרירי הגב מעל הלמינקטומיה. לאחר מכן, תפר את החתך בעור ומרח עליו Betadine, המוצג כאן כהקרנה של תמונות Zack כפי שהיו נדרשות in vivo ובהמשך הוקרנו לאורך ציר Z ללא יישור תמונות.

התמונה מראה תאי מיקרוגליה צפופים מאוד החיוביים ל-GFP בירוק, בסמיכות צמודה לכלי דם באדום בחוט השדרה. להלן תמונה בהגדלה גבוהה של תא מיקרוגליה בודד המחובר לדופן של כלי דם, המראה בפירוט חלק מהזיזיונות שלו המשתרעים סביב הכלי וחלקם לעבר פרנכימת חוט השדרה. להלן דוגמה לדימוי חוזר in vivo של אותם מקטעי אקסונים המסומנים ב-YFP, כפי שמוקמו מחדש ודוממו שוב בחוט השדרה של אותה עכבר מקו YFPH בשני מפגשים שונים במרווח של חמישה ימים. זוהי דוגמה נוספת לדימוי חוזר המראה את אותם מבני כלי דם ותאי מיקרוגליה שדוממו in vivo בחוט השדרה בשני ימים רצופים.

להלן רצף של סרטון Time-lapse מייצג שצולם in vivo מחוט השדרה. רצף זה מראה בפירוט את ההתנהגות הדינמית של הזרועות העדינות של תאי מיקרוגליה בירוק ואת האינטראקציות שלהן עם כלי הדם באדום. עם הזמן, התמונות הגולמיות תוקנו רק עבור רעש רקע, בהירות וניגודיות, וסרטון ה-time-lapse הוקם על ידי דחיית מחסניות תמונות באופן רצופי ללא יישור תמונות.

בממוצע של בחירת מישורי Z בודדים, כלי דם עוברים טווח דומה של מישורי Z כמו התמונות של המיקרוגליה. עומק נפח התמונה הוא 38 מיקרונים. רצף זה של צילומי time-lapse מראה את יציבות שיטת ההדמיה ברמה של מישור Z בודד.

רכישה מהירה של אותו מישור Z בודד בחוט השדרה של עכבר CX three, CR one GFP ההטרוזיגוט, שהורדם באמצעות תערובת KXA והונח על מכשיר לייצוב עמוד השדרה, מדגימה הסטה מינימלית של התמונה בין פרמים עוקבים. יצוין כי קצב רצף זה היה פריים אחד לשנייה, קצב המהיר מקצב הנשימה של העכבר. ההסטה השארית הקלה נובעת ככל הנראה מדפיקות הלב של בעל החיים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגביל את מספר החתכים למינימום ולנסות להפסיק כל דימום קל מיד עם הופעתו. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה כיצד לבצע הדמיה יציבה in vivo בחוט השפני של העכבר באמצעות מיקרוסקופיה פוטונית דו-פוטונית.