Name: פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti /em (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: למד שיטה לאיסוף וצביעת המוציטים מיתוש Aedes aegypti באמצעות הזרקת מדלל נוגד קרישה ופרפוזיה. הטכניקה משלבת פשטות עם דיוק גבוה לבידוד הכנות נקיות של תאי דם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ג&#39;ון פריי ובן פיטרסון לגידול יתושים. אנו מודים גם כריסטין דייוויס גארי רדיס לעזרה עם micrographs hemocyte. מחקר זה מומן על ידי אוניברסיטת ריצ&#39;מונד אומנויות &amp; המילגה המדע הקיץ AA Qayum ואנשי סגל להעניק א טלנג.

1. הכנה מוקדמת לאיסוף המוציטים
<ol>
 <li>הכינו תמיסת דילול להמולימף המורכבת מ-60% Schneider's Medium, 10% סרום עגל עוברי (FBS), ו-30% בופר ציטראט (נוגד קרישה; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 41 mM חומצה ציטרית, pH 4.5). 11הכינו מנות (aliquots) של 1.0 מ"ל שניתן לאחסן ב-20°Cהשתמשו בכל אליקוט פעם אחת בלבד (ראו חומרים).</li>
 <li>הכינו זכוכיות מיקרוסקופ (75 x 25 x 1 מ"מ) על ידי חריצת מעגל בקוטר 1 ס"מ בקצה אחד באמצעות כלי לחריטת זכוכית. לחלופין, ניתן לרכוש זכוכיות מיקרוסקופ עם שני מעגלים חרוטים מראש (לדוגמה, ממקורות של Fisher Scientific או EMS). יידרש זכוכית אחת עבור כל יתוש.</li>
 <li>הכינו סט של מחטי זכוכית (ראו חומרים) שנמשכו בהתאם להגדרות המוצעות הבאות (Sutter Instruments, דגם P-87): 
<table border="1"><tbody>
 <tr>
 <td>עליית טמפרטורה מדורגת +5 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>משיכה: 45</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>מהירות: 75</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>זמן: 175</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>לחץ 580</td>
 </tr>
</tbody></table> 
תוך שימוש בהגדרות המוצעות במותח זה, אנו מייצרים מחטים באורך כולל של כ-500 מיקרון, עם אורכי גבעול של כ-3 מיקרון. ניתן לרכוש גם מחטים שנמתחו מראש (למשל, מ-Tritech Research).</li>
</ol>
2. הכנת המיקרו-מזרק לפני איסוף ההמוציטים
<ol>
 <li>הכנס מחט שנמשכה למחזיק המחט של המיקרו-אינז'קטור בהתאם להוראות היצרן. בצע מילוי אחורי (Backfill) של צינורית המיקרו-אינז'קטור (ראו חומרים), המזרק והמחט מזכוכית שנמשכה בשמן מינרלי בהתאם להוראות היצרן.</li>
</ol>
3. הכנת נקבות יתושים לפני איסוף המוסיטים
<ol>
 <li>שאיפו 15 נקבות בוגרות לתוך מיכלי כלובים קטנים ומוצקים שניתן להבאיים במגע עם קרח. טבלו את הכלוב עם היתושים בקרח לעומק מספיק כדי שכל גובה הכלוב וכל צדדיו יהיו במגע עם הקרח. פעולה זו תבטיח שכל היתושים ייחשפו לקור. 
 בצעו הרדמה בקור ליתושים למשך כ-8 דקות או עד שלא יהיו ניידים יותר.</li>
 <li>הניחו יתוש אחד על תבנית זכוכית עם שקע (depression slide). תבנית זו תשמש כאתר להזרקות.</li>
</ol>
4. איסוף המוציטים
<ol>
 <li>כוון את המיקרו-מזרק לשאיבת 12 μl של מדולל המולימפה אל תוך מחט זכוכית משוכה, והזרק את התמיסה לתוך היתוש בין מקטעי הבטן השביעי והשמיני. ניתן להזריק לכ-3 יתושים נפח של 3-3.5 μl מתוך סך 12 μl הנפח שנשאב. יש להחזיק את היתוש בעדינות במקומו באמצעות פינצטה בזמן ביצוע ההזרקה. נפח קטן של מדולל צריך להישאר בקצה המחט כדי למנוע הזרקה של שמן מינרלי. לאחר ההזרקה, הבטן צריכה להיראות "מלאה" או נפוחה.</li>
 <li>הנח את היתושים המוזרקים במיכל נקי נפרד על קרח להתאוששות למשך 5 דקות. הדגירה של תמיסת המדולל נוגדת הקרישה בתוך היתוש תסייע בניתוק המוציטים (hemocytes) הדבקים לרקמות פנימיות. בממוצע, ניתן להזריק ל-3 עד 5 יתושים טריים במהלך כל תקופת התאוששות של 5 דקות.</li>
 <li>לאחר 5 דקות של התאוששות, גזור את הרגליים, הכנפיים ואת קצה הבטן (במקטע השמיני) של כל יתוש בנפרד באמצעות מיקרו-מספריים. פעולה זו צריכה להתבצע בכוס ההתאוששות המונחת על קרח. גזירת הרגליים והכנפיים מפחיתה את הסבירות להעברת קשקשים ללשוניות האיסוף. הערה: אין לגזור את הרגליים והכנפיים קרוב מדי לאתרי החיבור לחזה, כדי למנוע יצירת פתחים נוספים ממם עלולה לדלוף המולימפה. יש לאסוף את ההמולימפה רק דרך הפתח שנוצר בקצה הבטן.</li>
 <li>שטוף לשונית מיקרוסקופ אחת עם חריטה בזכוכית ב-70% Ethanol וייבש אותה בעזרת kimwipe. מקם יתוש אחד מוזרק ומותאושש על הלשונית, על הקצה החיצוני של המעגל החרוט. כוון את המיקרו-מזרק לשאיבת 12 μl של מדולל המולימפה טרי, והזרק נפח זה לתוך היתוש בצדו הלטראלי של המזוטורקס (mesothorax). הזרק את רוב נפח המדולל אך לא את כולו (כ-8 – 10 μl) כדי למנוע הזרקה של שמן מינרלי. נפח קטן של מדולל צריך להישאר בקצה המחט.</li>
 <li>מקם את היתוש כך שפתח הבטן הגזור נמצא בקצה המעגל של 1 cm. לאחר ההזרקה, יש לאסוף את ההמולימפה המדוללת בתוך השטח המסומן. לאחר הוצאת המחט מאתר ההזרקה במזוטורקס, המשך להחזיק את היתוש בין שתי זרועות הפינצטה ולחץ בעדינות על הבטן באמצעות הפינצטה כדי לכוון את ההמולימפה אל אזור המעגל החרוט.</li>
 <li>השאר את ההמולימפה המדוללת להתייבש על הלשונית למשך כ-10 דקות או עד שהיא יבשה באופן נראה לעין.</li>
</ol>
5. קיבוע וצביעה של המוציטים
 <ol>
 <li>צבע כל סלייד בנפרד באמצעות HEMA3 7 (ראה חומרים): טבול את הסלייד במקבע 5 פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם; טבול את הסלייד בתמיסה I 3 פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם; ולבסוף, טבול את הסלייד בתמיסה II 3 פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם. שטוף את גב הסלייד במים מזוקקים (DI water). אין לשטוף את חזית הסלייד. ייבש בטביטות את חזית הסלייד מחוץ למעגל החרוט המכיל את הרקמה הצבועה.
 </li>
 <li>מרח חומר הרכבה (לדוגמה Shur/Mount או Polymount) מסביב למרכז החרוט והנח עליו זכוכית כיסוי. לחץ בעדינות על זכוכית הכיסוי (25 x 25 mm) כך שחומר ההרכבה יתפשט על כל השטח המכוסה על ידי זכוכית הכיסוי (כולל המעגל החרוט המכיל את הרקמה הצבועה). השאר את הסליידים לייבוש למשך 3 שעות לפחות או למשך הלילה. יש לבחון את ההמוציטים תוך שבועיים ממועד האיסוף להשגת ויזואליזציה ודימוי אופטימליים.</li>
 </ol>
6. תוצאות מייצגות
דוגמאות של המוציטים מקובעים וצבועים ב-HEMA3 שנאספו מנקבת בוגרת של Aedes aegypti מוצגות באיור 1A-C. איור 1A מראה המוציט שזיהינו כפרוהמוציט (prohemocyte) בהתבסס על גודלו הקטן, צורתו הכדורית-ספרואידית ויחס הגרעין לציטופלזמה הגבוה (הגדלה של 550x) 11. איור 1B מראה המוציט שסווג כאונוציטואיד (oenocytoid) בהתבסס על צורתו הספרואידית ויחס הציטופלזמה לגרעין הגבוה (הגדלה של 550x). לבסוף, איור 1C מראה המוציט מסוג גרנולוציט (granulocyte) (הגדלה של 550x). גרנולוציטים הם גרנולריים יותר מטבעם ונוטים להיות אמבואידיים יותר בצורתם ובהתנהגותם כאשר הם נצמדים למשטחי זכוכית. תוך שימוש בקריטריונים שפורסמו בעבר לסיווג והשגת המוציטים 11, שיטת האיסוף שלנו הניבה מספר דומה של המוציטים סה"כ, ומצאנו באופן דומה כי הגרנולוציטים מהווים את האחוז הגבוה ביותר מכלל ההמוציטים 11 (איור 2).
<img src="/files/ftp_upload/2772/2772fig1.jpg" alt="שלבי חלוקת תא תחת מיקרוסקופ; ציטופלזמה, גרעין, גרנולות; קנה מידה 10 μm; מחקר ביולוגי." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="איור 1"> איור 1. תמונות במיקרוסקופ אור של פרוהמוציט (A), אונוציטואיד (B) וגרנולוציט (C) מייצגים מקובעים וצבועים ב-HEMA3 מנקבת בוגרת של Ae. aegypti. C = ציטופלזמה, N = גרעין, G = גרנולות.
<img src="/files/ftp_upload/2772/2772fig2.jpg" alt="תרשים עמודות המשווה בין מספר ההמוציטים למספר הגרנולוציטים ליתושה; ניתוח נתונים של התגובה החיסונית." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="איור 2"> איור 2. ספירה כוללת ± SE של כל ההמוציטים והגרנולוציטים שהתקבלו מיתושה נקבה באמצעות שיטת דילול ואיסוף ההמולימפה שלנו.

<ol><li>Enayati, A., Hemingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+management%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Malaria management: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).</li>
<li>Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+transgenic+mosquitoes+on+dengue+virulence+to+humans+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Naturalist%22%5BJournal%5D)">The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes.</a> The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).</li>
<li>Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+studies+on+the+innate+immunity+of+disease+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors.</a> Insect Sci. 15, 15-15 (2008).</li>
<li>Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midgut+basal+lamina+thickness+and+dengue-1+virus+dissemination+rates+in+laboratory+strains+of+Aedes+albopictus+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).</li>
<li>Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+infection+responses+in+the+haemocytes+of+the+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).</li>
<li>Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+cellular+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">The insect cellular immune response.</a> Insect Sci. 15, 1-1 (2008).</li>
<li>Hillyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+mortality+in+immune+challenged+mosquitoes+%28Aedes+aegypti%29+correlates+with+a+decrease+in+haemocyte+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers.</a> Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).</li>
<li>Chen, C. C., Laurence, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+on+humoral+encapsulation+of+microfilariae%3A+establishment+of+technique+and+description+of+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction.</a> International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).</li>
<li>Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dirofilaria+immitis%3A+effects+on+hemolymph+polypeptide+synthesis+in+Aedes+aegypti+during+melanotic+encapsulation+reactions+against+Microfilariae%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae.</a> Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).</li>
<li>Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+innate+immune+response+by+the+mosquito+Aedes+aegypti+is+mediated+by+hemocytes+and+independent+of+Gram+type+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Infect%22%5BJournal%5D)">The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity.</a> Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).</li>
<li>Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemocytes+from+the+mosquitoes+Anopheles+gambiae+and+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטת איסוף hemocyte המתואר כאן הוא שונה משיטות שפורסמו בעבר ומאפשר לבודד את ההכנות נקי של hemocytes מ Aedes יתושים בצעדים פחות. בעוד עניין מיוחד שלנו טמון באפיון האוכלוסיות hemocyte ב Aedes יתושים, אנו מאמינים כי הטכניקה הזו יכול להיות מיושם על קבוצות אחרות יתוש לאחר הניסויים הראשוניים נערכים כדי לקבוע כרכים זריקה נכונה. פרוטוקול שלנו משתמשת מאגרים קרישה במקום תמיסת מלח והתשואות אוכלוסייה של hemocytes זה משקף במדויק את המספרים in vivo. עם זאת, אנו לא נקב...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> שניידר בינוני </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S0146 </td><td></td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> F0643 </td><td></td></tr><tr><td> Hema3 כתם ערכת </td><td> דיג </td><td> 123-869 </td><td></td></tr><tr><td> זכוכית מחטים (בורוסיליקט עם נימה) </td><td> סאטר Instrument </td><td> BF100-78-10 </td><td> 1.0mm OD ו - ID 0.78mm </td></tr><tr><td> מחט חולץ </td><td> סאטר מכשירים </td><td> דגם P-87 </td><td></td></tr><tr><td> MicroInjector </td><td> Tritech מחקר </td><td> MINJ-PD </td><td></td></tr><tr><td> בעל מחט </td><td> Tritech מחקר </td><td> MINJ-4 </td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול איסוף מכתים hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה aedes aegypti</em

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

יתושים הם וקטורים עבור מספר גורמי מחלות ומזיקים כגון וירוס קדחת צהובה, טפילי מלריה ותולעים filarial. מעבדות חוקרת אנטי הפתוגן מרכיבים של מערכת החיסון המולדת של וקטור מחלת מין בתקווה ליצור יתושים מהונדס, כי הם מגיבים פתוגנים כגון 1, 2. מערכת החיסון המולדת של יתושים כולל כמה שורות של הגנה 3. פתוגנים שמצליחים לברוח המכשול שהוטלו על ידי יתוש אפיתל מצופה midgut 4 להיכנס hemolymph והמפגש hemocytes במחזור, מרכיבים תאיים חשובים לתמצת פתוגנים לבלוע 5, 6. החוקרים לא מצאו ראיות רקמות hematopoietic ב יתושים ראיות הנוכחי עולה כי מספר hemocytes קבוע על הופעתה מבוגרים המספרים בפועל עשוי לרדת כפי הגילאים יתושים 7. היכולת לזהות כראוי לאסוף hemocytes מפני חרקים חשוב מבחינה רפואית היא צעד חיוני ללימודי חסינות הסלולר. עם זאת, גודלו הקטן של יתושים נפח מוגבל של hemolymph מהווים אתגר לאיסוף תאים חיסוניים. שתי שיטות לאיסוף הוקמה hemocytes יתושים כולל גירוש hemolymph מתוך חוטם לחתוך 8, ועקירה נפח (זלוף), שבו מלוחים מוזרק באזור necklike קרומי בין הראש לבין החזה (כלומר, צוואר הרחם) לבין hemolymph perfused נאסף מפתיחת קרוע באזור הדיסטלי של הבטן 9, 10. טכניקות אלו, לעומת זאת, מוגבלים על ידי התאוששות נמוכה של hemocytes וזיהום אפשרי על ידי תאים שומן בגוף, בהתאמה 11. לאחרונה שיטה המכונה התאוששות הזרקה / התאוששות גבוהה משופרת של immunocytes על ידי שימוש מאגרים קרישה תוך הפחתת רמות זיהום קשקשים ורקמות פנימיות 11. אמנם שיטה המאפשרת שיטה משופרת של איסוף ושמירה hemocytes לתרבות העיקרי, הוא טומן בחובו מספר שלבים הזרקה איסוף שאינם נחוצים אם המטרה היא לאסוף את הזרם, לתקן כתם hemocytes עבור אבחון. הנה, אנחנו מדגימים את השיטה שלנו של איסוף hemolymph יתוש המשלבת את הפשטות של זלוף, באמצעות מאגרים קרישה במקום תמיסת מלח, עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים.

שיטה פשוטה אך מדויקת לאסוף כתם hemocytes יתוש מתואר. השיטה שלנו משלבת את הפשטות של זלוף עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד את ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים. שיטה זו מקלה על מחקרים וידע המחייב של סוגי hemocytes ושפע שלהם.

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

יתושים הם וקטורים עבור מספר פתוגנים הגורמים למחלות, כגון נגיף Other הצהוב, טפילי מלריה ותולעי פילריה. מעבדות הן...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאסוף ולצבוע המוציטים מיתושים. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקת נפח קטן של מדלל נוגד קרישה לתוך יתושים מקוררים. זאת כדי לשחרר את ההמוציטים ולהביא את כל ההמוציטים למצב של תמיסה.השלב השני של הפרוצדורה הוא הסרת הרגליים, הכנפיים וקצה הבטן של היתוש. בשלישית, מזלגג טרי מוזרק לאתר נפרד בגוף היתוש כדי להתחיל את תהליך הפרפוזיה. השלב הסופי הוא הזרמת ההמולימפה המדוללת על עלית זכוכית מוכנה, כך שניתן יהיה לקבע ולצבוע את ההמוציטים שנאספו.בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את הסוגים העיקריים ומספר אתרי ההמוציטים (hemo sites) שנמצאו במין הפשפש הנבדק באמצעות מיקרוסקופיית גלייד (glide microscopy) בסיסית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון פרופוזיה (profusion) הוא שהיא משלבת את הפשטות של הפרופוזיה עם הדיוק המושג משיטות הזרקה גבוהות, אך עם פחות שלבים עד להשגת המטרה הסופית. מטרתנו היא לזהות את סוגי ההמוציטים (hemo cytes) ואת שכיחותם בתגובה לאתגרים חיסוניים.מי שמדגימה את הטכניקה היא אמינה עבדול קום, סטודנטית לתואר ראשון מהמעבדה שלי. לפני תחילת הפרוטוקול, הכינו את תמיסת המדלל להמולימפה באליקוטים של 1 ml. אחסנו אותם בטמפרטורה של 20°C- ואל תהמיסו שוב חלקים שלא נעשה בהם שימוש מאליקוט.כעת, סמנו עיגולים בקוטר של one centimeter על תגליות מיקרוסקופ בעובי של one millimeter. נדרשת תגלית אחת עבור כל יתוש. הכינו מחטים דקות (pulled needles).שברו את קצהו של כל מחט שנמשחה כדי ליצור פתח למחט. הרכיבו מחט אחת בתוך התומך שלה, המחובר לרכיבי הצינור והמזרק של מיקרו-מזרק. לאחר מכן, הסירו בועות אוויר מתוך מכלול הצינור ותומך המחט באמצעות שמן מינרלי.שאבו שמן מינרלי למזרק הידני הזה וודאו שלא נכנסו בועות אוויר. הניחו תחת המחט חומר שיספוג את השמן המטפטף. פתחו חלק זה של המיקרו-מזרק (micro injector) ואז הכניסו שמן כדי להסיר בועות אוויר.זה פשוט ננעל על מזרק היד הזה, בדיוק כפי שזה נעשה עם הקצה השני. מזריקו לאט את השמן המינרלי כך שיעבור דרך צינור הפלסטיק ויסיר כל בועות אוויר שנותרו. ולאחר מכן, שוב, מלאו את החלק העליון בשמן מינרלי עד לרמה שבה הוא מתחיל לטפטף.לאחר מכן, יש לחבר זאת חזרה למזרק הזכוכית כדי למנוע היווצרות בועות. לאחר מכן, מלאו את הרכיבים המורכבים בשמן מינרלי עד שכל צינורית המחט והמזרק יתמלאו. המיקרו-מזרק מוכן כעת לשימוש לצורך הזרקת תמיסת הדילול.בשלב הבא, הכינו את בעלי החיים על ידי שאיבת 15 נקבות בוגרות לתוך מיכל כלוב קטן וסולידי שיוטבל לחלוטין בקרח. היתושים מורדמים כאשר הם מקובעים על ידי הקור, תהליך שבדרך כלל ארך שמונה דקות או פחות. הניחו יתוש בודד מורדם על שקופית שקועה (depression slide) שבה תתבצע ההזרקה המיקרוסקופית.תחת המיקרוסקופ, שאבו 12 µL של מדלל המולימפה לתוך המיקרו-מזרק. קבעו בעדינות את היתוש תחת המיקרוסקופ באמצעות פינצטה והזריקו 3 עד 3.5 µL מהמדלל. הבטן תנפח בין פלח הבטן השביעי לשמיני.בעת הזרקת המדלל, ניתן להזריק לשלושה יתושים. לפני טעינה מחדש של המיקרו-מזרק, הניחו את כל היתושים שהוזרקו לכוס פלסטיק נקייה על קרח, שם יתאוששו היתושים למשך כחמש דקות. במהלך הדגירה, המדלל נוגד הקרישה משחרר המוציטים (hemocytes) הדבקים לרקמות הפנימיות.בעוד קבוצת בעלי החיים הראשונה מתאוששת במהלך הדגירה, ניתן בדרך כלל להזריק לשלושה עד חמישה יתושים נוספים. לאחר חמישה דקות, בעודם בתוך הכוס, הכינו את היתושים המוזרקים על ידי גזירת הגפיים, הכנפיים וקצות הבטן במקטע השמיני באמצעות מספרי מיקרו. היזהרו לא לגזור את הגפיים והכנפיים קרוב מדי לחזה או להמו.ייתכן שהדגימה תחליק. כעת שטפו סלייד עם תבנית חריטה ב-70% ethanol וייבשו אותו בעזרת נייר Kim wipe. תחת המיקרוסקופ, מקמו יתוש אחד שנותח בשולי המעגל החרוט.מלאו את המיקרו-מזרק ב-12 µL של מדלול טרי. החזיקו את היתוש בעזרת פינצטה והזריקו 8 עד 10 µL לצדו הלטראלי של המזו-טורקס (mesothorax). היזהרו לא להזריק שמן מינרלי לאחר הזרקה זו.הלימפה (Hemo lymph) תיאסוף מהבטן אל תוך מעגל התחירה; לחץ בעדינות על הבטן באמצעות פינצטה כדי לכוון ולעודד את זרימת הלימפה. כעת הנח ללימפה שנאספה להתייבש על תגלידה. פעולה זו אמורה להימשך כ-10 דקות.כעת ניתן לצבוע אותן. צבעו כל סלייד בנפרד באמצעות Hema three. טבלו כל סלייד במקבע חמש פעמים, למשך שנייה אחת בכל טבילה.בצע לאחר מכן שלוש טבילות של שנייה אחת בכל פעם בתמיסה 1, ולאחר מכן בתמיסה 2. כעת שטוף רק את גב השקף במים דה-יוניזציה, אך לא את החלק הקדמי. ייבש את הצד הקדמי, הצמד זכוכית כיסוי באמצעות מדיום קיבוע, ולחץ בעדינות על זכוכית הכיסוי כך שהמדיום ימלא את כל השטח מעל הרקמה הצבועה.כעת יש להמתין לפחות שלוש שעות לייבוש הזכוכית כדי להשיג תוצאות אופטימליות. יש לבחון ולדגום תמונות של ה-he cytes הצבועות תוך שבועיים מהכנה זו. תאים אלו מנקבות בוגרות זוהו באמצעות פרוטוקול זה.התמונה הראשונה מציגה אתר המטופויטי של פרו-המבליבס (pro hemo), המזוהה על פי צורתו הבלתי סדירה ויחס הגרעין לציטופלזמה הגבוה. תמונה זו מציגה תא ENO על פי צורתו הבלתי סדירה ויחס הציטופלזמה לגרעין. לבסוף, זהו אתר המטופויטי מסוג גרנולוציט.מרקמה גרנולרי יותר וצורתו דומה יותר ל-OID בהשוואה לשיטות הזרקה גבוהות קודמות. פרוטוקול זה הניב מספר כולל דומה של תאי המיוגניקה ובדומה לכך זיהה אתרים גרנולריים כסוג התא הנפוץ ביותר. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה תוך שעה אחת עבור כ-15 עד 20 יתושים, אם היא מבוצעת כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להזריק נכון dent ליתושים, כיצד לאסוף את ה-hemos שלהם, ולאחר מכן כיצד להכין את ה-hemos לצורך ויזואליזציה ודימוי.

a-protocol-for-collecting-staining-hemocytes-from-yellow-fever

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאל הווירוס דנגה, זה חייב להיות מוערך על תפקיד זה במניעת זיהומים נגיפיים בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים דנגה של יתושים יכול להיות assayed. שיטות לגידול את הנגיף בתרבית, האכלה קרום דם יתושים אדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

פרוטוקול זיהומים דנגי ב יתושים (א aegypti) ו הפנוטיפ קביעת זיהום

ברגע גן מזוהה עקשן פוטנציאלי עבור מלריה, זה חייב להיות מוערך על תפקידה במניעת זיהומים Plasmodium בתוך היתוש. פרוטוקול זה מדגים כיצד מידת זיהומים Plasmodium של יתושים יכול להיות assayed. טכניקות להכנת תרבות gametocyte, האכלה קרום יתושים דם האדם, assaying titers ויראלי midgut היתושים הם הפגינו.

פרוטוקול זיהומים Plasmodium falciparum בקביעת הפנוטיפ יתושים זיהום

זמן ומרחב ביטוי ניתוח גנטי תפקיד מכריע גנומיקה תפקודית. כל...

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

hemocytes חרקים למלא תפקידים חשובים רבים, הוא חיסון ושאינם מחוסנים, לאורך כל שלבי התפתחות חרקים. הידע הנוכחי שלנו של הסוגים והתפקוד hemocyte מגיע ממחקרים על מודלים גנטיים של חרקים. כאן, אנו מציגים שיטה לחילוץ, כימות והמחשת hemocytes מזחלים פרא.

פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild

בין השלושה סוגי היתושים,...

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

באמצעות שתי שיטות להערכת ביטוי גנים בנספחים התעוררו אצל הגדולים של Aedes aegypti, זיהינו הקבוצה של גני putatively בסיס התגובות עצביות לתרכובות מרות ודוחות, כפי שנקבע על ידי בדיקת אלקטרו.

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

המתואר הוא זמן ושיטת חיסכון במקום לספור ביצים ולקבוע את שיעורי הצוהר של יתושים בודדים באמצעות 24 גם צלחות תרבית רקמה, אשר יכול להגדיל באופן משמעותי את קנה המידה ואת המהירות של פוריות ופוריות מבחני.

מבחני פוריות ופוריות משופרים עבור Aedes aegypti באמצעות 24 צלחות תרבית רקמה באר (צלחות EAgaL)

מטרת פרוטוקול זה היא לספק ארוחות דם שמקורן בבעלי חיים ומלאכותיות ליתושים Aedes aegypti באמצעות מאכיל קרום מלאכותי ולכמת במדויק את נפח הארוחה שנבלעה.

האכלה וכימות של דם שמקורו בבעלי חיים וארוחות מלאכותיות יתושים Aedes aegypti

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקר התחרותיות הזדווגות של Aedes aegypti זכר באמצעות צבע פלואורסצנטי כסמן. נקבות היתושים חשופות הן לזכרים מסומנים והן לזכרים לא מסומנים להזדווגות. לאחר ההזדווגות, הזרע שלהם נבדקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע את בן זוגם להזדווגות.

באמצעות צבע פלואורסצנטי, רודמין B, כדי ללמוד תחרותיות הזדווגות יתושים Aedes aegypti זכר

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לעריכת גנום באמצעות מיקרו-הזרקה עוברית ביתוש A. aegypti באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9.

עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9

למד שיטה לאיסוף וצביעת המוציטים מיתוש Aedes aegypti באמצעות הזרקת מדלל נוגד קרישה ופרפוזיה. הטכניקה משלבת פשטות עם דיוק גבוה לבידוד הכנות נקיות של תאי דם.

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti

גלה סרטונים נוספים