פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti
16 במאי 2011
שיטה פשוטה אך מדויקת לאסוף כתם hemocytes יתוש מתואר. השיטה שלנו משלבת את הפשטות של זלוף עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד את ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים. שיטה זו מקלה על מחקרים וידע המחייב של סוגי hemocytes ושפע שלהם.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לאסוף ולצבוע המוציטים מיתושים. דבר זה מושג תחילה על ידי הזרקת נפח קטן של מדלל נוגד קרישה לתוך יתושים מקוררים. זאת כדי לשחרר את ההמוציטים ולהביא את כל ההמוציטים למצב של תמיסה.
השלב השני של הפרוצדורה הוא הסרת הרגליים, הכנפיים וקצה הבטן של היתוש. בשלישית, מזלגג טרי מוזרק לאתר נפרד בגוף היתוש כדי להתחיל את תהליך הפרפוזיה. השלב הסופי הוא הזרמת ההמולימפה המדוללת על עלית זכוכית מוכנה, כך שניתן יהיה לקבע ולצבוע את ההמוציטים שנאספו.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את הסוגים העיקריים ומספר אתרי ההמוציטים (hemo sites) שנמצאו במין הפשפש הנבדק באמצעות מיקרוסקופיית גלייד (glide microscopy) בסיסית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון פרופוזיה (profusion) הוא שהיא משלבת את הפשטות של הפרופוזיה עם הדיוק המושג משיטות הזרקה גבוהות, אך עם פחות שלבים עד להשגת המטרה הסופית. מטרתנו היא לזהות את סוגי ההמוציטים (hemo cytes) ואת שכיחותם בתגובה לאתגרים חיסוניים.
מי שמדגימה את הטכניקה היא אמינה עבדול קום, סטודנטית לתואר ראשון מהמעבדה שלי. לפני תחילת הפרוטוקול, הכינו את תמיסת המדלל להמולימפה באליקוטים של 1 ml. אחסנו אותם בטמפרטורה של 20°C- ואל תהמיסו שוב חלקים שלא נעשה בהם שימוש מאליקוט.
כעת, סמנו עיגולים בקוטר של one centimeter על תגליות מיקרוסקופ בעובי של one millimeter. נדרשת תגלית אחת עבור כל יתוש. הכינו מחטים דקות (pulled needles).
שברו את קצהו של כל מחט שנמשחה כדי ליצור פתח למחט. הרכיבו מחט אחת בתוך התומך שלה, המחובר לרכיבי הצינור והמזרק של מיקרו-מזרק. לאחר מכן, הסירו בועות אוויר מתוך מכלול הצינור ותומך המחט באמצעות שמן מינרלי.
שאבו שמן מינרלי למזרק הידני הזה וודאו שלא נכנסו בועות אוויר. הניחו תחת המחט חומר שיספוג את השמן המטפטף. פתחו חלק זה של המיקרו-מזרק (micro injector) ואז הכניסו שמן כדי להסיר בועות אוויר.
זה פשוט ננעל על מזרק היד הזה, בדיוק כפי שזה נעשה עם הקצה השני. מזריקו לאט את השמן המינרלי כך שיעבור דרך צינור הפלסטיק ויסיר כל בועות אוויר שנותרו. ולאחר מכן, שוב, מלאו את החלק העליון בשמן מינרלי עד לרמה שבה הוא מתחיל לטפטף.
לאחר מכן, יש לחבר זאת חזרה למזרק הזכוכית כדי למנוע היווצרות בועות. לאחר מכן, מלאו את הרכיבים המורכבים בשמן מינרלי עד שכל צינורית המחט והמזרק יתמלאו. המיקרו-מזרק מוכן כעת לשימוש לצורך הזרקת תמיסת הדילול.
בשלב הבא, הכינו את בעלי החיים על ידי שאיבת 15 נקבות בוגרות לתוך מיכל כלוב קטן וסולידי שיוטבל לחלוטין בקרח. היתושים מורדמים כאשר הם מקובעים על ידי הקור, תהליך שבדרך כלל ארך שמונה דקות או פחות. הניחו יתוש בודד מורדם על שקופית שקועה (depression slide) שבה תתבצע ההזרקה המיקרוסקופית.
תחת המיקרוסקופ, שאבו 12 µL של מדלל המולימפה לתוך המיקרו-מזרק. קבעו בעדינות את היתוש תחת המיקרוסקופ באמצעות פינצטה והזריקו 3 עד 3.5 µL מהמדלל. הבטן תנפח בין פלח הבטן השביעי לשמיני.
בעת הזרקת המדלל, ניתן להזריק לשלושה יתושים. לפני טעינה מחדש של המיקרו-מזרק, הניחו את כל היתושים שהוזרקו לכוס פלסטיק נקייה על קרח, שם יתאוששו היתושים למשך כחמש דקות. במהלך הדגירה, המדלל נוגד הקרישה משחרר המוציטים (hemocytes) הדבקים לרקמות הפנימיות.
בעוד קבוצת בעלי החיים הראשונה מתאוששת במהלך הדגירה, ניתן בדרך כלל להזריק לשלושה עד חמישה יתושים נוספים. לאחר חמישה דקות, בעודם בתוך הכוס, הכינו את היתושים המוזרקים על ידי גזירת הגפיים, הכנפיים וקצות הבטן במקטע השמיני באמצעות מספרי מיקרו. היזהרו לא לגזור את הגפיים והכנפיים קרוב מדי לחזה או להמו.
ייתכן שהדגימה תחליק. כעת שטפו סלייד עם תבנית חריטה ב-70% ethanol וייבשו אותו בעזרת נייר Kim wipe. תחת המיקרוסקופ, מקמו יתוש אחד שנותח בשולי המעגל החרוט.
מלאו את המיקרו-מזרק ב-12 µL של מדלול טרי. החזיקו את היתוש בעזרת פינצטה והזריקו 8 עד 10 µL לצדו הלטראלי של המזו-טורקס (mesothorax). היזהרו לא להזריק שמן מינרלי לאחר הזרקה זו.
הלימפה (Hemo lymph) תיאסוף מהבטן אל תוך מעגל התחירה; לחץ בעדינות על הבטן באמצעות פינצטה כדי לכוון ולעודד את זרימת הלימפה. כעת הנח ללימפה שנאספה להתייבש על תגלידה. פעולה זו אמורה להימשך כ-10 דקות.
כעת ניתן לצבוע אותן. צבעו כל סלייד בנפרד באמצעות Hema three. טבלו כל סלייד במקבע חמש פעמים, למשך שנייה אחת בכל טבילה.
בצע לאחר מכן שלוש טבילות של שנייה אחת בכל פעם בתמיסה 1, ולאחר מכן בתמיסה 2. כעת שטוף רק את גב השקף במים דה-יוניזציה, אך לא את החלק הקדמי. ייבש את הצד הקדמי, הצמד זכוכית כיסוי באמצעות מדיום קיבוע, ולחץ בעדינות על זכוכית הכיסוי כך שהמדיום ימלא את כל השטח מעל הרקמה הצבועה.
כעת יש להמתין לפחות שלוש שעות לייבוש הזכוכית כדי להשיג תוצאות אופטימליות. יש לבחון ולדגום תמונות של ה-he cytes הצבועות תוך שבועיים מהכנה זו. תאים אלו מנקבות בוגרות זוהו באמצעות פרוטוקול זה.
התמונה הראשונה מציגה אתר המטופויטי של פרו-המבליבס (pro hemo), המזוהה על פי צורתו הבלתי סדירה ויחס הגרעין לציטופלזמה הגבוה. תמונה זו מציגה תא ENO על פי צורתו הבלתי סדירה ויחס הציטופלזמה לגרעין. לבסוף, זהו אתר המטופויטי מסוג גרנולוציט.
מרקמה גרנולרי יותר וצורתו דומה יותר ל-OID בהשוואה לשיטות הזרקה גבוהות קודמות. פרוטוקול זה הניב מספר כולל דומה של תאי המיוגניקה ובדומה לכך זיהה אתרים גרנולריים כסוג התא הנפוץ ביותר. ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה תוך שעה אחת עבור כ-15 עד 20 יתושים, אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להזריק נכון dent ליתושים, כיצד לאסוף את ה-hemos שלהם, ולאחר מכן כיצד להכין את ה-hemos לצורך ויזואליזציה ודימוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה פשוטה אך מדויקת לאיסוף וצביעה של המוציטים של יתושים. הטכניקה משלבת פרפוזיה עם שיטות הזרקה בלחץ גבוה כדי לבודד דגימות נקיות של המוציטים ביתושי Aedes.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אנטומולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- המוציטים ממלאים תפקיד מכריע בתגובה החיסונית של יתושים.
- הבנת סוגי ההמוציטים ושכיחותם חיונית למחקרים ביולוגיים שונים.
- השיטות הנוכחיות לאיסוף המוציטים עשויות להיות מורכבות וגוזלות זמן.
- מחקר זה שואף לייעל את התהליך תוך שמירה על דיוק.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לאיסוף יעיל של המוציטים של יתושים.
- הקלה על מחקרים בנושאי סוגי המוציטים ושכיחותם.
- שיפור הדיוק של טכניקות בידוד של המוציטים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקת מהולל נוגד קרישה לתוך יתושים מקוררים.
- הסרה של הרגליים, הכנפיים וקצה הבטן כדי לגשת להמולימפה.
- תחילת תהליך הפרפוזיה באמצעות הזרקת מהולל טרי.
- איסוף של המולימפה על זכוכית preparando לצביעה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מבודדת בהצלחה תכשירי המוציטים נקיים.
- דיוק גבוה בזיהוי סוגים שונים של המוציטים.
- מקלה על מחקרים נוספים באימונולוגיה של יתושים.
- תהליך יעיל המפחית את הזמן ואת המורכבות של איסוף ההמוציטים.
מסקנות
- השיטה המתוארת יעילה לחקר המוציטים של יתושים.
- היא משלבת פשטות ודיוק, מה שהופך אותה לנגישה עבור חוקרים.
- טכניקה זו יכולה להעמיק את הבנתנו לגבי הביולוגיה והאימונולוגיה של היתוש.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
איסוף וצביעה מהימנים של המוציטים (hemocytes) של יתושים הם קריטיים לתיקוף התפקוד של תאי מערכת החיסון בביולוגיה של וקטורים, ומשפיעים ישירות על תיקוף מטרות בשלב מוקדם עבור התערבויות במחלות המועברות על ידי וקטורים. פרוטוקול זה מאפשר בידוד סטנדרטי וניתן לשחזור של המוציטים מ-Aedes aegypti, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובביטחון ניבוי במחקרים על מערכת החיסון המולדת של היתוש. תהליכי עבודה יעילים לניתוח תאי מערכת החיסון מסייעים בקבלת החלטות לגבי פורטפוליו של הדברת וקטורים ופיתוח יתושים טרנסגניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של אוכלוסיות תאי חיסון של יתושים לצורך תיקוף תפקודי של מטרות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת שכיחות ההמוציטים ותגובתם לאתגרים חיסוניים.
- מספק נתונים תאיים כמותיים לביסוס רמת הוודאות החזויית במחקרי ביולוגיה של וקטורים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק תכשירים סטנדרטיים של המוציטים עבור בדיקות אימונולוגיות המשך.
- משפר את השחזוריות והדיוק בתהליכי עבודה של זיהוי וכמות תאים.
- מקל על הכנת הבדיקה להערכת התערבויות אנטי-פתוגניות בבזנזים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מיישר מדדי תגובה חיסונית תאית עם מודלים של וקטורים הרלוונטיים למחלה.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי של פרופיל חיסוני ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות לבקרת וקטורים.
- תומך בקידום מותאם סיכונים של גישות טרנסגניות או גישות למודולציה חיסונית בבני יתושים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני במחקר של מחלות המועברות על ידי וקטורים, ומגשר בין אפיוני תאי חיסון לבין תיקוף פונקציונלי וסריקה.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת בדיקת השערות חסונה לתפקוד ולשכיחות של תאי חיסון ביתושים.
- סריקה: קובעת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור עבור בדיקות מבוססות תאי חיסון.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של אוכלוסיות המוציטים בתנאי ניסוי שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין נתוני תאי חיסון למודלים של וקטורים הרלוונטיים למחלה לצורך מחקרים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול סטנדרטי וניתן להרחבה, שניתן להתאימו לתוכניות מחקר שונות על יתושים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתוצאות החיזוי ומפחית עמימות במחקרי תאי מערכת החיסון של יתושים.
- ערך תפעולי: מייעל את הכנת הדגימות, משפר את השחזוריות ותומך בתפוקה גבוהה יותר.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת (go/no-go) יוזמות לבקרת וקטורים ויתושים טרנסגניים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של התערבויות וקטוריות המכוונות למערכת החיסון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית בהזרקה מיקרוסקופית (microinjection) וטיפול ביתושים.
- נדרשת גישה למזרקי מיקרו, מיקרוסקופיה ומגיבי צביעה.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך כימות עקבי של המוציטים (hemocytes).
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מיני יתושים אחרים או מערכות מודל אחרות.
- מוגבל עקב נפחי המולימפה (hemolymph) הקטנים והסיכון לאובדן דגימות אם הפעולה לא תבוצע בדיוק.
