Name: הכנת מבודדים תאים חיים בעלי חוליות photoreceptor עבור דימות פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: למדו הכנת מבודדים תאי פוטורצפטור חיים מרשתית מותאמת לחושך לדימות פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת חקר מטבוליזם תאי, תקשורת ותהליכי חמצון בנוירוביולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

נתמך על ידי מענק ניי EY014850.

1. הכנת Sylgard צלחות מלאות, לתאי ניסוי, סכיני גילוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 מ"מ פלקון צלחות פטרי מצופות אלסטומר Sylgard יש צורך לקצוץ התקין של הרשתית מבודד להשיג תאים photoreceptor יחיד. אלסטומר מוכן על פי הוראות הספק כמות קטנה הוא שפך לתוך כל מנה כדי לכסות את תחתית שלה בשכבה. החלף צלחת מכסה לאחר ציפוי ולאחסן אותם. בעוד ימים ספורים אלסטומר מתקשה ומאכלים מוכנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Photoreceptors מבודד צורך להיצמד אל החלק התחתון של תא הניסוי, כך הם משותקים במהלך ניסוי הדמיה. זו מושגת על ידי ציפוי תחתית החדרים עם פולי-L-ליזין או פולי-L-ornithine. הוספת 200 μL של פתרון של 0.01% או אחד לכל חדר, ומכסים לתאי עם מגבת נייר כדי להגן עליהם מפני אבק. לאחר הפתרון התייבש, לשטוף עם מים לתאי חנות מזוקקים בתוך קופסה סגורה. השתמש בתוך 2 שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות את חדרי בסוף הניסוי, לשטוף אותם עם אתנול 100% כדי להסיר שמן העדשה שמן הטבילה ופסולת התא. כדי להסיר את פסולת התא, השתמש כותנה שקצהו applicators ובזהירות לשפשף את החלק התחתון של החדר. לאחר מכן לשטוף עם מים מזוקקים ולתת לתאי היבש לפני ציפוי מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור פיפיות סכיני גילוח לחתיכות קטנות (8 מתוך להב אחד) עם חיתוך מתכת. </li></ol> 2. ההכנה של פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב של פתרונות תלוי המין. עבור דו חיים, את הצלצול של יש (ב mmol / L): 110 NaCl, KCl 2.5, 1.6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, pH = 7.55. PH צריך להיות מותאם לערך הסופי עם NaOH. עבור יונקים, את הצלצול של יש (ב mmol / L): 130 NaCl, KCl 5, 0.5 MgCl 2, 2 CaCl 2, 25-hemisodium HEPES, pH = 7.40. הפתרון של רינגר יכולים להישמר היטב אטום בטמפרטורת החדר במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלוקוז פתרון במלאי, 1 mol / L, המשיך ב -20 ° C כדי למנוע התפתחות חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי, להוסיף גלוקוז לפתרון של רינגר לריכוז סופי של 5 mmol / L. בסופו של יום, למחוק את הצלצול של המכיל גלוקוז כי זה עלול לגדול חיידקים. </li></ol> 3. בידוד של הרשתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כריתה התקין של הרשתית חשוב החיה להיות כהה המותאמים לפחות 2-3 שעות לפני להקריב. בעלי חיים צריכים להיות כהה מותאם במיכל מאוורר מתאים בחדר כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא שני 35 מ"מ צלחות פטרי חצי דרך עם פתרון של רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן חיה תחת אור אדום עמום להסיר את העיניים. בהמשך, כל ההליכים מתבצעים תחת אור אינפרא אדום באמצעות מיקרוסקופ לנתח או מצלמה עם צג וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל שאריות רקמת מפני השטח החיצוני של העין. גזור להסיר את החלק הקדמי, ולאחר מכן להעביר את עיינית לאחד צלחות פטרי מלאות של רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזגוגית ובזהירות להפריד את הרשתית משאר עיינית על ידי צובט את כל חיתוך או קבצים מצורפים. הרם בעדינות את הרשתית ואת זה נפרד לחלוטין מן עיינית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרשתית כדי בצלחת פטרי השני עם טפטפת העברת פלסטיק. שמור את המנה המכיל את הרשתית בתיבה אור חזק. </li></ol> 4. בידוד של תאים photoreceptor יחיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל ההליכים מתבצעים תחת אור אינפרא אדום. חותכים חתיכה קטנה של הרשתית ולהעביר אותו עם טפטפת פלסטיק צלחת Sylgard מכוסה. היקף הפתרון הכולל את פיסת הרשתית צריך להיות בערך 250 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו פיסה קטנה של סכין גילוח עם בעל להב - קצה הלהב צריך להיות בזווית של כ 45 ° לבעל. שטחו את פיסת הרשתית על שכבת Sylgard באמצעות להב לקצוץ את החלק של הרשתית דק תוך שמירה על אותה שכבת דבק Sylgard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 200 μL של פתרון הכולל את התאים לתאי ניסיוני - לצאת כל פיסת הנותרים של הרשתית בצלחת Sylgard המכוסה. שמרו על חדר עם תאים בודדים בתיבת אור חזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכו 10 דקות עבור התאים להתיישב, ואז להוסיף 2-3 מ"ל של רינגר. בשלב זה, התאים מבודדים ניתן לטעון עם פלורסנט לצבוע מסוים (לדוגמה Fura-2) על פי פרוטוקול הטעינה צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים יכולים עתה לקחת על הבמה מיקרוסקופ לניסויים. </li></ol> 5. פלואורסצנטי הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לתא לשלב של המיקרוסקופ epifluorescence. התאם פתרון זלוף, בדיקות טמפרטורה, אור אינפרא אדום, וכו ' </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הווילונות להתחיל בניסוי. כבה את האור האינפרה אדום בתוך הכלוב מיקרוסקופ, להתמקד התחתון של תא הניסוי, ולעבור את השלב מחפש תאים. </li></ol> 6. נציג תוצאותs: איור. 1 מציג את המורפולוגיה של מוט מבודד בריא photoreceptors קונוס שהושגו עם פרוטוקול זה מן הרשתית סלמנדרה (Ambystoma tigrinum). תאים Salamander נעשה שימוש נרחב עבור יחיד פלואורסצנטי תא הדמיה בגלל גודל גדול ויכולתם לשרוד במשך כמה שעות לאחר במנותק מן הרשתית. בנוסף, מן הרשתית סלמנדרה אפשר להשיג באופן סדיר הן מוט photoreceptors קונוס. אחד הקריטריונים החשובים לבריאותם של התאים הוא נוכחותם של אליפסואיד תמים (איור 1), החלק של התא שבו המיטוכונדריה מרוכזים. כאשר התאים מוצגים תחת DAPI אופטיקה, זה ריכוז של המיטוכונדריה נותן איתות הקרינה חזקה (איור 2) בשל נוכחותם של NADH. חוסר אליפסואיד שלמים היא סימן של תא פגום, פסול, בדרך כלל לצורך הניסוי. איור. 3 מראה פגום סלמנדרה מוט photoreceptor, עם גוף התא נפוחות גרעין מרוכז. תאים אלה להציג פלואורסצנציה נמוכה בהרבה מתחת DAPI אופטיקה, אבל שנצפו תחת אופטיקה FITC להראות אות FAD חזק באזור אליפסה (שמקורם נוקלאוטידים פלבין ו flavoproteins חמצון). קריטריון נוסף לבריאות photoreceptors מבודד היא יכולתם ליצור כל טרנס רטינול (ויטמין A) במגזרי החיצוני שלהם על ידי גירוי האור. הדור של ויטמין A דורשת כמויות ניכרות של NADPH, אשר תלוי מכונות מטבולית ללא פגע. איורים 4 ו -5 להראות את היווצרות ויטמין A במגזרי החיצוני של צפרדע שלם מוט photoreceptors העכבר בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. בריא יחיד מוט חרוט photoreceptors. התאים היו מבודדים מן הרשתית נמר סלמנדרה. Phototransduction מתרחש במגזר החיצוני ואת אליפסה הוא ארוז בצפיפות עם המיטוכונדריה. מוטות אחראים ראייה באור עמום, חרוטים עבור החזון אור בהיר. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Fluorescence החיים סלמנדרה מוט חרוט. אלה הם כהים המותאמים תאים, מראה NADH הקרינה חזקה ellipsoids שלהם ולא ויטמין משמעותי הקרינה במגזרי החיצוני שלהם. לכידת התמונה פלואורסצנציה מייצג החשיפה הראשונה שלהם לאור הנראה לאחר תקופה של הסתגלות כהה. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. פגומים סלמנדרה מוט photoreceptor. גוף התא נפוחות גרעין מרוכז המעידים על נזק. התא הוא מתחמצן ויש מינימלית אות NADH (DAPI אופטיקה), אלא אות FAD הרבה יותר חזק (FITC אופטיקה). <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. צפרדע עם מוט NADH ו רטינול. זהו צפרדע בריא מוט photoreceptor מראה NADH הקרינה חזקה באזור אליפסה. לפני חשיפה לאור יש פלואורסצנציה מינימלי בקטע החיצוני. בעקבות חשיפה לאור, ישנו גידול משמעותי הקרינה את הקטע החיצוני עקב היווצרות של ויטמין A. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. עכבר מוט עם רטינול. זהו עכבר בריא מוט photoreceptor מראה פלח משמעותי הקרינה החיצוני לאחר חשיפה לאור עקב היווצרות של ויטמין A. האזורים אליפטיים של photoreceptors מוט העכבר לא מראים אות הקרינה חזקה.

<ol><li>Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Counting+Photons%3A+Trials+and+Trends+in+Vertebrate+Visual+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction.</a> Neuron. 48, 387-401 (2005).</li>
<li>Ebrey, T., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Vertebrate Photoreceptors.</a> Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).</li>
<li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+in+Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Adaptation in Vertebrate Photoreceptors.</a> Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).</li>
<li>Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin.</a> Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).</li>
<li>Saari, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+Visual+Pigment+Regeneration%3A+The+Friedenwald+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).</li>
<li>Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+Adaptation+and+the+Retinoid+Cycle+of+Vision%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision.</a> Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).</li>
<li>Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Microscopy%3A+Shedding+Light+on+the+Chemistry+of+Vision%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision.</a> Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).</li>
<li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleached+Pigment+Produces+a+Maintained+Decrease+in+Outer+Segment+Ca2%2B+in+Salamander+Rods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods.</a> J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).</li>
<li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Dependent+Changes+in+Outer+Segment+Free-Ca2%2B+Concentration+in+Salamander+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).</li>
<li>Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+the+Rods+of+Wild-Type+and+Transducin+Knock-out+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice.</a> J Physiol. 542, 843-854 (2002).</li>
<li>Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Measurement+of+Current+and+Calcium+in+the+Ultraviolet-Sensitive+Cones+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish.</a> J Physiol. 579, 15-27 (2007).</li>
<li>Matthews, H. R., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Spot+Confocal+Technique+to+Measure+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors.</a> Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).</li>
<li>Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+Calcium+Stores+Regulates+Calcium+Influx+and+Signal+Transmission+in+Rod+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors.</a> J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).</li>
<li>Krizaj, D., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Calcium+Extrusion+Mechanisms+in+the+Outer+and+Inner+Segments+of+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors.</a> Neuron. 21, 249-256 (1998).</li>
<li>Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+Magnesium+Concentration+in+Salamander+Photoreceptor+Outer+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments.</a> J Physiol. 553, 125-135 (2003).</li>
<li>Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Behavior+of+Rod+Photoreceptor+Disks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks.</a> Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).</li>
<li>Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+Microfluorometric+Studies+of+Reduction+and+Clearance+of+Retinal+in+Bleached+Rod+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).</li>
<li>Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Cycle%3A+Dependence+of+Retinol+Production+and+Removal+on+Photoproduct+Decay+and+Cell+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology.</a> J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).</li>
<li>Koutalos, Y., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluorometric+Measurement+of+the+Formation+of+All-Trans-Retinol+in+the+Outer+Segments+of+Single+Isolated+Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors.</a> Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphotoreceptor+Retinoid-Binding+Protein+Is+the+Physiologically+Relevant+Carrier+That+Removes+Retinol+from+Rod+Photoreceptor+Outer+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments.</a> Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Cycle+and+Its+Metabolic+Support+in+Gecko+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors.</a> Vision Res. 47, 363-374 (2007).</li>
<li>Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+All-Trans+Retinol+after+Visual+Pigment+Bleaching+in+Mouse+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אם מבודדים תאים בריאים לא מתקבלים, הבעיה נעוצה גם עם בידוד או לבריאות של הרשתית או עם הקיצוץ שלה. בדרך כלל, לאחר הסרת הקדמי של העין ואת הזגוגית, הרשתית בקלות מרים את אפיתל הפיגמנט. אם לא, לנסות לקלף אותו החל בפריפריה של עיינית. אם זה עדיין קשה להפריד, אפשרות סבירה היא כי בעל החיים לא היה כהה מותאם לתקופה בלתי הולמת של זמן, או אור אדום בהיר מדי. ודא הסתגלות כהה מתאים החיה, ואור עמום האדום. הנוכחות של קולטני האור ברשתית מוט ניתן לקביעה בקלות על ידי סימון צבע של הרשתית מבודדים: לחתוך...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> החדר האפל (100-150 רגל 2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> אורות אדומים 19 </td><td></td><td></td><td> חנויות מקוונות </td></tr><tr><td> מקורות אור אינפרא אדום לצופים תמונה אינפרא אדום </td><td> FJW Optical Systems, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> הביתור מיקרוסקופ 19 </td><td></td><td></td><td> לבוש עם הצופים אינפרא אדום </td></tr><tr><td> מיקרוסקופ Epifluorescence סגורה בכלוב אור חזק 19 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> כלים לנתח (מספריים, מלקחיים, בעל להב) </td><td> Roboz או כלים המדע פיין </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard אלסטומר </td><td> אסקס (שארלוט, NC) </td><td> Sylgard 184 אלסטומר ערכת </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ornithine (0.01%) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ליזין (0.1%) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> P8920 </td><td> מדולל ל% 0.01 </td></tr><tr><td> ניסיוני בתאי </td><td> וורנר מכשירים (Hamden, CT) </td><td> D3512P </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי, טפטפות פלסטיק </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנת מבודדים תאים חיים בעלי חוליות photoreceptor עבור דימות פלואורסצנטי

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

ברשתית החוליות, phototransduction, ההמרה של האור לאות חשמלי, מתבצעת על ידי מוט חרוט תאים photoreceptor 1-4. Photoreceptors רוד אחראים ראייה באור עמום, חרוטים על רקע בהיר. Phototransduction מתרחש במגזר החיצוני של התא photoreceptor, תא מיוחד המכיל ריכוז גבוה של פיגמנט ויזואלי, גלאי אור ראשוני. פיגמנט ויזואלי מורכב chromophore, 11 - ציס רשתית, מחובר לחלבון, opsin. פוטון נספג על ידי פיגמנט הראייה isomerizes chromophore מ 11 - ציס לכל, טרנס. Photoisomerization זה מביא לשינוי קונפורמציה פיגמנט הראייה כי יוזם מפל של תגובות שהגיעו לשיאן שינוי פוטנציאל הממברנה, ולהביא על התמרה של גירוי האור לאות חשמלי. ההתאוששות של התא מפני גירוי האור כולל את שחרור משרות של ביניים מופעל על ידי אור, ואת כינונה מחדש של פוטנציאל הממברנה. Ca 2 + מודולציה את הפעילות של כמה אנזימים המעורבים phototransduction, וריכוז שלה הוא מופחת על גירוי אור. בדרך זו, Ca 2 + משחק תפקיד חשוב בתהליך ההחלמה של התא מפני גירוי האור והתאמתה אור רקע. עוד חלק חיוני של תהליך ההחלמה הוא התחדשות של פיגמנט הראייה כי הושמד במהלך איתור לאור על ידי photoisomerization של 11 שלה - chromophore לכל cis-trans 5-7. התחדשות זה מתחיל עם שחרורו של טרנס כל הרשתית על ידי הפיגמנט photoactivated, והותיר אחריו opsin apo-החלבון. שוחררו כל טרנס רשתית מצטמצם במהירות התגובה לכל ניצול NADPH-טרנס רטינול, ו opsin משלב עם 11 טרי - רשתית cis להכניס קטע החיצוני לרפורמה פיגמנט הראייה. כל trans-רטינול הוא הועבר לאחר מכן מתוך קטע החיצוני לתוך תאים שכנים על ידי חלבון retinoid התמחה Interphotoreceptor המוביל הכבילה (IRBP). דימות פלואורסצנטי של תאים photoreceptor יחיד יכול לשמש כדי ללמוד הפיזיולוגיה שלהם ביולוגיה של התא. Ca 2 + רגיש צבעי ניאון ניתן להשתמש כדי לבחון בפירוט את יחסי הגומלין בין קטע החיצוני Ca 2 + שינויים בתגובה האור 8-12, כמו גם את תפקידו של פלח Ca פנימי 2 + חנויות Ca 2 + הומאוסטזיס 13,14 . צבעי ניאון יכול לשמש גם למדידת Mg 2 + בריכוז 15, רמת החומציות, וכן קליעים נותבים של מימיות קרום התאים 16. לבסוף, הקרינה הפנימית של כל טרנס רטינול (ויטמין A) ניתן להשתמש כדי לפקח על קינטיקה של הקמתו והסרת תאים photoreceptor יחיד 17-19.

השיטה מתוארת להכנת יחיד photoreceptor תאים חיים ממינים שונים חוליות דימות פלואורסצנטי. השיטה יכולה לשמש התמונה פלואורסצנציה של fluorophores אנדוגני, כגון NADH או ויטמין A, או של exogenously צבעי ניאון הוסיף רגיש Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; או גורמים אחרים.

ברשתית של בעלי חוליות, פוטוטרנסדוקציה (phototransduction), המרת אור לאות חשמלי, מתבצעת על ידי תאי פטורצפטור מסוג פוטו-רוד (rod) ופוטו-קונוס (cone)1-4. ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין תאי פטורצפטורים חיים בודדים עבור דימוי פלואורסצנציה. הדבר מושג תחילה על ידי בידוד רשתית שהותאמה לחושך. השלב השני של הפרוצדורה הוא בידוד תאי פטורצפטורים חיים בודדים.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא העברת התאים לתא ניסוי. השלב הרביעי של הפרוצדורה הוא הנחת התא על במה המיקרוסקופ. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא בחירת תא בריא לצורך דימוי פלואורסצנציה; לבסוף, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים בזמן אמת במטבוליזם של התא, באיתות, בתעבורה תוך-תאית או בחמצון באמצעות דימוי של פלואורסצנציית התא.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות בתחום הפוטורצפטורים של חולייתנים, כגון פינוי תוצרי לוואי רעילים, ועד לגילוי אור. השלכותיה של טכניקה זו חולשות על הטיפול במחלות של הרשתית, שכן ניתן להשתמש בה כדי לחקור תאי פוטורצפטורים ממודלים של עכברים למחלות אלו. לפני תחילת הפרוטוקול, יש להכין מראש חומרים שונים.ראשית, יש להכין מספר ימים מראש צלחות פטרי Falcon בקוטר 35 מילימטר עם כמות מספקת של אלסטומר סיגר (cigar elastomer) לכיסוי הצלחת, כדי לאפשר לאלסטומר להתקשות. תאי הניסוי הם צלחות פטרי של 35 מילימטר שעברו שינוי וכוללות תחתית זכוכית בקוטר 12 מילימטר. תאי הניסוי צריכים להיות דביקים, לכן התאים מקובעים על ידי הוספת 200 microliters של 0.01% poly L lysine או poly L ornithine לתחתית

preparation-living-isolated-vertebrate-photoreceptor-cells-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

הרקמה העוברית הדמיה בזמן אמת הוא מאתגר לאורך תקופות זמן ארוכות. כאן אנו מציגים assay לניטור שינויים הסלולר משנה הסלולר בחוט השדרה חומוס לתקופות ארוכות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. טכניקה זו יכולה להיות מותאם לאזורים אחרים של מערכת העצבים בעובר המתפתח.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

העברה של גנים באמצעות AAV לצורך ויזואליזציה של פגיעה בשלמות קרומי הרשתית

מקור: Laboissonniere, et. al. רצף RNA של תא בודד של תת-קבוצות מוגדרות של תאי גנגליון ברשתית. J. Vis. exp.{{}} (2017).  }סרטון זה מדגים טכניקת מעקב פלואורסצנטית לזיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית (RGC) ברשתית של עכבר טרנסגני. התהליך כולל אבטחת הרשתית המבודדת בתא הקלטה, שמירה על כדאיות התא עם זלוף מחומצן, והתמקדות ב-RGCs עם תווית פלואורסצנטית באמצעות פיפטה עם עוקב. על ידי ניתוח מורפולוגיה וריבוד דנדריטי, השיטה מאפשרת סיווג של תת-סוגים מובהקים של RGC.

זיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית עכבר באמצעות מעקב פלואורסצנטי

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית לסיווג סוגי תאים נוירונים לפני הבידוד ועל אפיון לאחר מכן של transcriptomes תא בודד. פרוטוקול זה מייעל את ההכנה של דגימות עבור רצף RNA מוצלח (RNA-Seq) ומתאר מתודולוגיה שתוכננה במיוחד עבור הבנה משופרת של מגוון הסלולר.

יחיד תא RNA-Seq של קבוצות מוגדרות של תאים גנגליון רשתית

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

הדמיה רקמת רשתית יכול לספק מידע מתא בודד לא יכול להיות שנאספו שיטות ביוכימיות מסורתיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה של הרשתית פרוסות דג זברה הדמיה קונפוקלי. פלורסנט מקודדים גנטית חיישנים או מחוון צבע לאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים רבים סוגי תאים ברשתית ברורים.

הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במי חמצן מקודד גנטית (H2O2)-biosensor בנוירונים זברה בתרבית וזחלים להערכת תפקידי האיתות הפיזיולוגיים של H2O2 במהלך התפתחות מערכת העצבים. זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים שונים ושונה עם טיפולים ניסיוניים לחקור מינים חמצן תגובתי (ROS) בפיתוח כללי.

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

למדו הכנת מבודדים תאי פוטורצפטור חיים מרשתית מותאמת לחושך לדימות פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת חקר מטבוליזם תאי, תקשורת ותהליכי חמצון בנוירוביולוגיה.

הכנת מבודדים תאים חיים בעלי חוליות photoreceptor עבור דימות פלואורסצנטי

גלה סרטונים נוספים