Name: הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: למדו שיטת immunoprecipitation כרומטין מרקמות השורש הגבי לאחר פציעה אקסונלית. טכניקה זו מאפשרת זיהוי אתרי קשירה של גורמי שעתוק ושינויים אפיגנטיים הרלוונטיים לרגנרציה עצבית במערכת העצבים ההיקפית והמרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות אנדריאה טדסקי לעזרה בקביעת הניסויים CHIP הראשונית של מעבדה Ricco לינדנר על תרומתו לכוונן את התנאים שבב. עבודה זו נתמכה על ידי קרן Hertie; גרנט פורצ&#39;ן, אוניברסיטת Tuebingen, ואת DI DFG מענקים 1497/1-1 (כמובן מאליו כל סימון די ג&#39;ובאני).

1. הגב עצב השת &amp; עמודה פציעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיה ממוקם על מגבת כירורגית מתחתיו thermopad נוכח בכל ההליך שמירה על טמפרטורת הגוף של העכבר על 37 ° C. כל בעלי החיים מורדמים לניתוח עם הממשל רציף 2 isoflurane קלט / פלט. מכשירי ניתוח הם autoclaved לפני ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פגיעה הנשה, באחוריו הן מגולח בקפידה, depilation הושלמה עם מסיר שיער גנרית לפני ניקוי העור עם אלכוהול ואחריו Betadyne 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצב השת הוא נחשף על ידי ביצוע חתך 4 מ"מ אחורי ובמקביל הירך ב אמצע הירכיים דרך העור ועל ידי הפצת השרירים בנפרד של femoris שרירי עם מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצב השת חשוף נפגע אז, את העור סגורה עם שני קליפים תפר. </li></ol> הערה: חתך אותו הוא עשוי לחשוף את עצב השת, אבל הפצע הוא sutured סגור עוזב העצב שלם עבור הפגיעה דמה. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פגיעה טור הגבי, החלק האחורי של העכבר הוא מגולח בקפידה, depilation הושלמה עם מסיר שיער גנרית לפני ניקוי העור עם אלכוהול ספריי / לסחוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוט השדרה הוא נחשף על ידי ביצוע חתך 2.5 ס"מ על T7 ל T13. העור הוא מפושקות, ואת רקמת החיבור מוסר לאורך החוליה מ T9 ל T11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Laminectomy מבוצע ברמה T10 </li></ol> הערה: רוב הניסויים, laminectomy נחשבת פציעה שאם. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה טיפות של Xylocain מתווספים הרקמה לטשטש את חוט, ואת מאטר הדורה מוסר, תשומת לב לא לגעת בעמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העמודות הגב נפצעים ואת השריר sutured קרוב, שוב לשים לב לא לגעת בעמוד השדרה. בסופו של דבר, העור הוא sutured סגור עם קליפים תפר. עצירות (0.1 מ"ג / ק"ג משקל גוף) צריכה להינתן פעמיים ביום למשך 48 שעות או עד אין עוד צורך. </li></ol> 2. Cross-linking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח DRG L4 ו L5 מעכברים נפצעו לאחר euthanization. איסוף כולל של 16 DRG לתוך HBSS קר כקרח + מעכבי פרוטאז קוקטייל (2 נפצעו ו -2 דמה DRG מבעל חיים אחד עבור סכום כולל של 4 בעלי חיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה בצנטריפוגה DRG, אז בזהירות להסיר את HBSS ולהוסיף 500 μl של פורמלדהיד 1% קוקטייל PBS + מעכבי פרוטאז ו דגירה המדגם במשך 30 דקות על 37 ° C. </li></ol> שלב קריטי. השתמש טריים, פורמלדהיד ביולוגיה מולקולרית כיתה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 125 mM של גליצין כדי לעצור את הקיבעון ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה צנטריפוגות, לשאוב את החיץ, ולשטוף את הרקמה פעמיים עם 500 μl קוקטייל קר כקרח PBS + מעכבי פרוטאז. </li></ol> 3. גרעינים הכנה הגז הכרומטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את PBS, להוסיף 400 μl של חיץ תמוגה SDS, להעביר צינור מראש צונן microcentrifuge, ולשבש את הרקמה עם כ 30 משיכות עם micropestle. </li></ol> שלב קריטי. תמוגה והפרעה הרקמה חיוניים תשואה טובה של הכרומטין crosslinked. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate המדגם עם 8 קטניות, 10 כל שנייה במוצא 70% (Bandelin, Sonoplus GM70). </li></ol> זהירות. מריחה של הכרומטין חייב להיות מותאם sonication הספציפית שלך להגדיר את הפיצול התקין של הכרומטין צריך להיבדק לפני הפעלת הניסוי IP בפועל (ראה סעיף 3). . הערה פיצול של הכרומטין יכול גם להתבצע על ידי עיכול micrococcal (MNase) nuclease. ככלל אצבע, על ידי פיצול sonication היא המועדפת רקמות קבוע, תוך עיכול MNase הוא המועדף עבור immunoprecipitation רקמות יליד הכרומטין. צולבים, הכרומטין טעון יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C עד 2 חודשים, אך להימנע חזר להקפיא / מחזורי ההפשרה. 4. ניתוח של מערכת העיכול הכרומטין (מומלץ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 10 μl של המדגם טעון שלך הכרומטין לניתוח. הוספת 200 mM NaCl של המדגם ולהפוך את צולבות הקישור ידי דוגרים על 65 מעלות צלזיוס למשך 2h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA (ראה סעיף 8) ולהפעיל ג'ל 1% agarose. ה-DNA צריך להיות מקוטעת לאורך של כ 200-1000 bp (איור 1). </li></ol> . זהירות יתר הפיצול של הכרומטין עלול להוביל אות ירד, תוך פיצול שלם תוביל ברזולוציה פחתה והרקע מוגברת. 5. Immunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר התגובות immunoprecipitation (ראה הערה להלן), לחלק דגימות שווה לתוך צינורות חדשים. תביאו את עוצמת הקול של כל אחדעד 500 μl עם חיץ CHIP + מעכבי פרוטאז קוקטייל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת 5 μl מדגם בדילול שלך ולהעביר לתוך צינור חדש. זהו מדגם של 1% שלך קלט את זה יאוחסן ב -20 ° C עד הצורך (סעיף 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כל immunoprecipitation, להוסיף או נוגדן מתאים נורמליים לשלוט IgG ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס לילה עם רוטציה. </li></ol> הערה. בעת קביעת מספר immunoprecipitation, ביקורת חיובית (למשל נוגדנים היסטון H3) ו שליטה שלילי (IgG רגילה) צריך להיחשב. כמות הנוגדנים המשמשים IP משתנה בין נוגדנים צריכה להיקבע באופן אמפירי. עם זאת, בדרך כלל בטווח של 20-10? G / immunoprecipitation. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי immunoprecipitate מורכב נוגדן / חלבון / DNA שלך, הוסף 30 μl של השבב חרוזים חלבון G כיתה מגנטית דגירה עבור 2 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה. </li></ol> 6. כביסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הנפתח מורכב הכרומטין-חרוז כבול, במקום הצינור על מתלה מגנטי. המתן עד הפתרון הוא ברור, ואז להסיר בזהירות supernatant שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ"ל של לשטוף מלח נמוכה (חיץ שבב) של חרוזים דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 3-5 דקות עם רוטציה, אז הנפתח חרוזים לשאוב את לשטוף כמו בשלב 6.1. חזור על שלב זה עבור סכום כולל של 3 שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ"ל של חיץ מלח גבוהה לשטוף (חיץ CHIP + 350 mM NaCl) על חרוזים דגירה של 3-5 דקות עם רוטציה, אז הנפתח חרוזים לשאוב את לשטוף כמו בשלב 6.1. </li></ol> 7. Elution ואת היפוך של cross-linking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח דגימות הקלט מתוך -20 ° C, להוסיף 150 μl של חיץ elution שבב ומניחים בצד בטמפרטורת החדר עד שלב 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של חיץ CHIP 1x elution עבור כל מדגם ה-IP של שלב 6.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות thermomixer ו elute הכרומטין מן החרוזים על ידי דוגרים דגימות ב 65 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם vortexing עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנפתח חרוזים על מתלה מגנטי, ובזהירות להעביר את הכרומטין eluted (supernatant) לתוך צינורות חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל צינורות, כולל דוגמאות קלט, להוסיף 200mm של NaCl ו - 40 מיקרוגרם / תגובת proteinase K ו לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li></ol> הערה. השלב elution יכול להתבצע בטמפרטורת החדר, אבל זה יכול להיות לא יעיל באותה מידה. 8. ה-DNA התאוששות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 נפח של כלורופורם פנול / דגימות שלך שלב 7.5 ו מערבולת למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות המרבית microcentrifuge בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשחזר את השלב מימית (העליון) לתוך צינורות חדשים, להוסיף 1 נפח של כלורופורם לשלב מימית, והמערבולת למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במהירות המרבית microcentrifuge בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשחזר את השלב מימית (העליון) לתוך צינורות חדשים, ולאחר מכן להוסיף NaOAc של 300 מ"מ, 20 מיקרוגרם / תגובה של גליקוגן, ו 2.5 כרכים של אתנול קרים כקרח 100%. </li></ol> זהירות. התוספת של הספק, כגון גליקוגן, היא צריכה לשפר את המשקעים קטנה יחסית של שברי DNA בגודל. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב -80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ל-DNA המשקע. </li></ol> הערה. השלב משקעים יכול גם להתבצע הלילה ב -20 ° C. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות במהירות המרבית microcentrifuge למשך 20 דקות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את supernatant לשטוף את כדורי ה-DNA זירז עם 300 μl של אתנול קר כקרח 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות במהירות המרבית microcentrifuge למשך 10 דקות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות כמה supernatant ככל האפשר ולתת כדורי האוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 20 μl של סטרילית H 2 O. דוגמאות מוכנים כעת עבור ה-PCR, או את ה-DNA יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C. </li></ol> 9. נציג תוצאות התוצאה נציג של ניסוי שבב DRGs הבאים הנגע sciatic מוצג (איורים 1 ו -2). ראשית, עלינו להראות DNA מקוטעת לאורך של כ 200-1000 bp (איור 1). שנית, אנחנו מדגימים את שבב ה-PCR האות הבאה האמרגן הפרוקסימלי של הצמיחה הקשורים חלבון 43 (GAP-43) רק על פגיעה עצבית sciatic (מסלול 4, תרשים 2, 5 '). אין אות PCR קיים כאשר בעל החיים מקבל פציעה דמה בלבד (מסלול 3), בעת שימוש רגיל IgG בסרום עבור ה-IP (מסלול 5 ו - 6). כדי לבדוק את הספציפיות של הנוגדן, ניתחנו את דגימות ה-DNA זהה, אך השתמשו פריימר שליטה מוגדר אשר מזהה אזור 3'-UTR של הגן שלנו עניין בהם לא צפויה תפוסה. אותות ה-PCR נעדרים מכל נתיבים (מסלולים 3-6, איור 2, 3 "), למעט אותות הקלט, המייצג הלא IP דגימות DNA כסטנדרט PCR שולטת (נתיב 1-2, Figuמחדש 2). הליך זה CHIP יכול להתבצע בעקבות פציעה הירך או עמוד השדרה הגבי או בטור כפי שמסוכם סכמטית (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> 1. איור agarose בג'ל של דנ"א צולבים הפוך כי כבר טעון על ידי sonication לטווח התקין של אורך קטע. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Semi-PCR כמותי תוצאות מרקמות DRG בעקבות פגיעה בעצב הנשה מראה כי p53 acetylated נקשר GAP-43 באזור האמרגן הפרוקסימלי 48 שעות לאחר פציעה של עצב השת. שליטה PCR מן להראות רקמות זהה DRG כי p53 acetylated אינה מחייבת לאזור השליטה של ​​ה-DNA נמצא באזור 3'-מתורגמים (UTR) של הגן 43-GAP (S = שאם אני = פצוע). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. תרשים כללי מראה את מיקומם של אתרי הנגע על עצב השת, והעמודה הגבי.

<ol><li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li>
<li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarey%2C+MF+%22Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%22">Chromatin immunoprecipitation (ChIP)</a>. , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).</li>
<li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28%26mu%3BChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li>
<li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Makwana, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li>
<li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+p53-CBP%2Fp300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression%2C+axon+outgrowth%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li>
<li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה מספק שיטה לשאול ישירות על הסביבה הכרומטין במהלך רגנרציה axonal במערכת העצבים הבוגרת בעקבות פציעה axonal. היא משלבת את המודל פציעה DRG עם immunoprecipitation הכרומטין לחקור את הסביבה ואת תעתיק epigenetic לאחר פציעה או CNS או PNS. זה שימושי במיוחד עבור החוקרים מי רוצה לאפיין אתרי הקישור המשוער עבור גורם שעתוק האהוב שלהם, כדי לקבוע אם התפוסה של אתרים אלה מתרחשת בתגובה לפציעה. שינוי epigenetic של ההיסטונים ו-DNA באתרים אלה יכולים גם להיות במעקב בו זמנית. פרוטוקול דומה ניתן...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> CHIP 10x הצפת </td><td> תא האיתות </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> CHIP 2x elution הצפת </td><td> תא האיתות </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> CHIP כיתה חלבון G חרוזים מגנטיים </td><td> תא האיתות </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> גריפ Rack Magna (8 טוב) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> מרק </td><td> האו&quot;ם 1888 </td></tr><tr><td> 37% פורמלדהיד </td><td> רוט </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> הפתרון 10x גליצין </td><td> תא האיתות </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> גליקוגן </td><td> סיגמא </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> 10x HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> נוגדן היסטון H3 (ארנב) </td><td> תא האיתות </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> רגיל הארנב IgG </td><td> תא האיתות </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> פנול / כלורופורם / Isoamyl אלכוהול </td><td> רוט </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> מעכבי פרוטאז טבליות קוקטייל </td><td> רוש </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Proteinase K (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> תא האיתות </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> SDS תמוגה הצפת </td><td> בצפון מדינת ניו יורק </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> ציוד נחוץ </th></tr><tr><td> Sonicator </td></tr><tr><td> Micropestle </td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

האקסונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) לא להתחדש בעוד אלה במערכת העצבים ההיקפית (PNS) לעשות להתחדש במידה מוגבלת לאחר פציעה (טנג et al. 2006). הוא זיהה כי תוכניות תעתיק חיוני תולדה neurite ו axonal הם מחדש על פגיעה ב PNS (Makwana et al. 2005). אולם הכלים העומדים לרשותו כדי לנתח ויסות הגנים עצביים in vivo מוגבלים ומאתגר לעיתים קרובות. הגרעינים השורש הגבי (DRG) מציעים מערכת מעולה מודל פציעה כי הן CNS ו PNS מעוצבבים על ידי האקסון מפוצלת שמקורם סומה זהה. הגרעינים מייצגים אוסף של גופים נפרדים התא שבו כל האירועים תעתיק להתרחש, ובכך לספק אזור מוגדר של פעילות תעתיק כי ניתן להסיר בקלות reproducibly מן החיה. פגיעה של סיבי עצב ב PNS (למשל עצב השת), שבו התחדשות axonal קורה, צריך לחשוף סדרה של תוכניות תעתיק כי נבדלים אלה להגיב פציעה דומה למערכת העצבים המרכזית, שם התחדשות אינו מתקיים (למשל חוט השדרה ). אתרים עבור גורם שעתוק מחייבים, היסטון ושינוי ה-DNA כתוצאה מפגיעה או CNS או PNS ניתן לאפיין באמצעות הכרומטין immunoprecipitation (שבב). כאן אנו מתארים פרוטוקול CHIP באמצעות רקמות קבוע DRG עכבר בעקבות פציעה axonal. זה שילוב רב עוצמה מספק אמצעי לאפיון הסביבה בעד התחדשות הכרומטין הכרחי לקידום התחדשות axonal.

אנו מציגים שיטה immunoprecipitation הכרומטין מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal. גישה זו יכולה לשמש לזיהוי ספציפי גורם שעתוק אתרי הקישור ושינוי epigenetic של היסטון חשובים ו-DNA של התחדשות של אקסונים נפגע במערכת העצבים ההיקפית שני מרכזי.

אקסונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) אינם עוברים רגנרציה, בעוד שאלו שבמערכת העצבים ההיקפית (PNS) כן עוברים רגנרציה במידה מוגבלת לאחר...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע שיקוע חיסוני (immunoprecipitation) של קומפלקסים של חלבון ו-DNA מקושרים מרקמת גנגליונים של השורש האחורי (dorsal root ganglia) לאחר פגיעה עצבית. דבר זה מושג תחילה על ידי השראת פגיעה בעצב הסיאטי (sciatic) או בעמוד השדרה האחורי (dorsal column). השלב השני הוא קישור צולב (cross-link) של הדגימה והמסה של קומפלקס החלבון וה-DNA.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא שיקיבון חיסוני (immunoprecipitation) של קומפלקס חלבון-DNA ספציפי. לבסוף, ה-DNA מטוהר ומושג. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות העשרה של מקטעי DNA הקשורים לחלבון או למודיפיקציה של היסטון ב-DNA.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ההתחדשות העצבית, כגון אילו אתרי קישור ל-DNA, פקטורים של שעתוק ומודיפיקציות של היסטון דרושים להסדרת גנים החשובים לקידום התחדשות אקסונית. כדי להתחיל, מקמו בעל חיים מורדם על שולחן הניתוחים. שמרו על ההרדמה לאורך כל הניתוח באמצעות מתן רציפה של isoflurane בחמצן דרך קונו לאף לפני ההמשך.אשש את עומק ההרדמה הנכון באמצעות רפלקס צביטה של הבהונות עבור פגיעה בעצב הסיאטיק. גלח בזהירות את רבע הגוף האחורי והסר שיער שנותר באמצעות חומר להסרת שיער. לאחר הסרת השיער, נקה את העור במריחות חוזרות של אלכוהול ולאחריהן Betadine.בצעו חתך של ארבעה מילימטרים דרך העור, מאחור ובמקביל לירך (femur). במרכז הירך, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להפריד את השרירים ולחשוף את עצב הסיאטיק (sciatic nerve) הלבן שמתחתם. לאחר בידוד העצב, ניתן להותיר אותו ללא חיתוך כדי שישמש כביקורת ניתוח מדומה (sham surgical control), או לחתוך אותו כדי לגרום לפגיעה.לסיום, קרבו את העור וסגרו באמצעות שני קליפסים של תפר עבור פגיעה בעמוד השדרה הגבי. הסירו את השיער מהגב ונקו את אתר החתך כפי שהודגם קודם לכן. בצעו חתך של 2.5 סנטימטר מעל חוט השדרה, בערך מ-T7 עד T13.השתמשו בפינצטה עדינה כדי להחזיק את העור תוך הפרדת השומן. לאחר מכן, קבעו את השומן השטחי באמצעות שני ווים. לאחר דחיפת השומן לאחור, אתרו את כלי הדם במרווח שבין החוליות השישית והשביעית כדי שישמש כנקודת ייחוס.חתכו את השריר באופן בילטרלי מעל החוליות השמינית והעשירה והכניסו שני ווים כדי להחזיקו פתוח. השתמשו במספריים קטנים כדי לפנות את השרירים מעל הלמינה (laminate) ב-T8 עד T10 תוך כדי החזקת הזיז הספניאלי (spinous process). בצעו למינקטומי (laminectomy) ב-T10 על ידי חיתוך העצם המחברת משני הצדדים.הרימו בזהירות את החצי העליון של החוליות כדי לחשוף את חוט השדרה שמתחתן. טפטפו מספר טיפות של 2%Xylocaine כדי להרדים את חוט השדרה ולאחר מכן הסירו את הקרום הקשה (dura mater), תוך הקפדה לא לגעת בחוט השדרה.עצירה בשלב זה תספק בקרת ניתוח מדמה (sham) לפגיעה בעמוד השדרה הזקיפי (dorsal column). בצעו חתך בעומק 0.3 עד 0.4 מילימטר לרוחב חוט השדרה. לבסוף, תפרו את השריר ושררו את השומן השטחי.קרבו את העור וסגרו באמצעות סיכות תפר. החזירו את בעל החיים לכלוב הבית ועקבו אחריו עד להחלמה מלאה. 48 שעות לאחר הפציעה, בצעו קטילה הומנית לבעל החיים ואספו את גנגליוני השורש האחוריים L4 ו-L5 (DRG).השלב הראשון הוא חשיפת העמוד השדרה הגחוני. לאחר מכן, יש להסיר את החלק הגחוני של החוליות מ-T 12 עד L 6. כדי לחשוף את חוט השדרה, זהו את ה-DRGs הממוקמים במרווח שבין החוליות בצד חוט השדרה.השתמשו בפינצטה עדינה כדי לתפוס את ה-DRG של L4 ו-L5 והרימו אותם מעט. גזרו קרוב ככל האפשר לגוף ה-DRG. אספו סך כולל של 16 DRGs מארבעה בעלי חיים והניחו אותם ב-HBSS קר בקרח.סבב את ה-DRG בצנטריפוגה למשך זמן קצר, הוסף 500 µL של 1% formaldehyde והדגר את הדגימה למשך 30 דקות ב-37 °C. הוסף 125 mM של glycine כדי לעצור את הקיבוע והדגר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר סבב קצר בצנטריפוגה, שאב החוצה את הבאפר ושטוף את הרקמה פעמיים עם 500 µL של PBS קר מאוד בתוספת תערובת מעכבי פרוטאז (protease inhibitors cocktail).בשלב הבא, שאבו את ה-PBS והוסיפו 400 microliters של בופר SDS lysis, והשמידו את הרקמה באמצעות כ-30 תנועות של micro pestle. לאחר מכן, בצעו סוניקציה לכרומטין באמצעות שמונה פולסים של ten second בהספק של 70%output. מומלץ לנתח דגימה כדי לאשר את פרגמנטציית ה-DNA לאורכים של כ-200 עד 1000 base pairs.חלקו את דגימת הכרומטין הגזוזה באופן שווה לשפופרת חדשה. עבור כל תגובת אימונופרסיפיטציה המתוכננת לביצוע, השלימו את הנפח בכל שפופרת ל-500 microliters באמצעות chip buffer בתוספת תערובת מעכבי פרוטאז (protease inhibitors cocktail). לאחר מכן, הסירו חמישה microliters מהדגימה המדללת והעבירו לשפופרת חדשה.זוהי דגימת ה-1%input שלכם, והיא תישמר בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. מאוחר יותר, הוסיפו נוגדן או בקרת IgG רגילה לכל מבחנה והדגרימו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך סיבוב למשך הלילה. ביום למחרת.בצעו שיקוע חיסוני (immunoprecipitate) של הקומפלקס על ידי הוספת 30 µL של חרוזי מגנט Protein G והדגירה למשך שעתיים בטמפרטורה של 4 °C תוך כדי סיבוב. לאחר מכן, הניחו את המבחנה על מעמד מגנטי כדי לשקע את קומפלקס חרוזי הכרומטין הקשור. כאשר התמיס plaintext נראה צלול, הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant), שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 1 mL של בופר עם ריכוז מלח נמוך, כאשר לכל שטיפה תתבצע הדגירה למשך 3-5 דקות בטמפרטורה של 4 °C תוך כדי סיבוב.לאחר מכן, שטפו פעם אחת עם 1 ml של בופר מלח גבוה. בשלב זה, הוציאו את דגימת ה-1% input מטמפרטורה של 20- °C והוסיפו 150 µl של בופר אלוציה לשבבים. הניחו את המבחנה בצד בטמפרטורת החדר לשימוש מאוחר יותר.בחזרה לדגימות ה-IP, הוסף 150 µL של תמיסת elution buffer 1x של chip לכל מבחנה. דגור את הדגימות בטמפרטורה של 65 °C למשך 30 דקות עם ערבוב עדין (vortexing) כדי לשחרר את הכרומטין מהחרוצים. השב את החרוצים למטה באמצעות המגנט, והעבר בזהירות את הכרומטין ששוחרר למבחנות חדשות, כולל עבור דגימות ה-input.הוסיפו 200 millimolar של sodium chloride ו-40 micrograms לכל תגובה של protease K והדגירו ב-65 °C למשך שעתיים. לאחר ההדגרה, הפקו את ה-DNA באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לצורך ניתוח נוסף כאן. מוצגות תוצאות PCR חצי-כמותיות מרקמת DRG בעקבות נגע בעצב הסיאטיק. נתיבים אחת ושתיים מראים את אות ה-PCR מדגימות הקלט.אות ה-PCR במסלול ארבעה מראה כי P 53 מאצטיל נקשר לאזור הפרומוטור הפרוקסימלי של gap 43 רק לאחר פגיעה בעצב הסייאטיק. לא נראה אות PCR כאשר בעל החיים עובר פרוצדורת דמה (sham), כפי שניתן לראות במסלול שלוש, וכאשר נעשה שימוש בסרום IgG רגיל, המוצג במסלולים חמש ושש. בדיקת PCR ביקורת מאותה רקמת DRG מראה כי P 53 מאצטיל אינו נקשר לאזור ביקורת של ה-DNA הממוקם באזור ה-3' שאינו מתורגם (untranslated region) של הגן gap 43.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שלושה שלבים קריטיים להצלחה: התחילו עם כמות מספקת של רקמה, הבטיחו פרגמנטציה וסולובליזציה יעילות של קומפלקס ה-DNA-חלבון, ובחרו נוגדן אימונופרסיפיטציה מתאים עבור החלבון הנחקר.

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו להדגים פרוטוקול לבידוד axoplasm מתוך עצב השת עכברוש מבוגר מבוסס על דיסקציה של fascicles עצב הדגירה במדיום hypotonic לשחרר המיאלין ואת lyse הלא axonal מבנים, ואחריו מיצוי של החומר האקסון מועשר הנותרים.

Axoplasm ניתוק מן החולדה עצב השת

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

מקור: Li, Q., et al. חקירת התחדשות אקסונים של יונקים: אלקטרופורציה in vivo של גנגליון שורש גב של עכבר בוגר. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את תהליך ההתחדשות האקסונלית בעצב הסיאטי של עכבר לאחר פציעת ריסוק. העצב המבודד מקובע ומוכן להדמיה, עם חלבונים פלואורסצנטיים המתבטאים בתאי עצב כדי לדמיין צמיחת אקסונים. באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי, עוקבים אחר התחדשות האקסונים מאתר הפגיעה כדי להעריך את היקף הצמיחה מחדש.

התחדשות אקסונלית בעצב הסיאטי של עכבר לאחר פגיעת ריסוק

מקור: Li, Q. et al. חקירת התחדשות אקסונים של יונקים: אלקטרופורציה in vivo של גנגליון שורש גב של עכבר בוגר. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים טרנספקציה בתיווך אלקטרופורציה של נוירוני DRG של עכברים כדי לחקור התחדשות אקסונים. הוא מתאר את השלבים להעברת מבני חומצות גרעין לנוירונים DRG, גרימת פגיעה בעצב הסיאטי והערכת התחדשות אקסונלית.

טרנספקציה מתווכת אלקטרופורציה של גרעיני שורש הגב של העכבר כדי לקדם התחדשות אקסונים חושיים

הפרדיגמה פציעה באמצעות כבל עצב גחון תסיסנית הזחל לחקור התחדשות במערכת עצבים מרכזיות ותיקון מתואר. דקירה ואחרי סריקת הליזר מיקרוסקופיה confocal בדגימות זמן לשגות וקבועים, בשילוב עם ניתוח הכמותי עם תוכנה שפותחה בתכליתיות וגנטיקה, משמשת כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של התחדשות ותיקון מערכת עצבים מרכזיים.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

פרוטוקול זה מציג את השימוש בהזרקת גנגליון שורש גבי (DRG) עם וקטור ויראלי ופגיעת ריסוק שורש גבי במקביל בחולדה בוגרת כמודל לחקר התחדשות אקסון חושי. מודל זה מתאים לחקירת השימוש בריפוי גנטי לקידום התחדשות אקסון חושי.

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

אלקטרופורציה היא גישה יעילה כדי לספק את הגנים של אינטרסים לתוך תאים. על-ידי החלת גישה זה ויוו על הנוירונים של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון (DRG), נתאר מודל ללמוד האקסון התחדשות בתוך vivo.

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

מוצג כאן הפיתוח לרכישה עקבית של קטעי קריוסטט גנגליון שורש גבי באיכות גבוהה.

הליך עבור עכבר שורש גבי גנגליון Cryosectioning

פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרופלואידית המדגמנת דינמיקה מטבולית עצבית לאחר פגיעה אקסונלית, המאפשרת הדמיה, ניתוח מולטי-אומיקס ומחקרים מכניסטיים של שיפוץ מטבולי מהותי.

שבב מיקרופלואידי עבור מודלים של פגיעות אקסונליות בנייה ומאפשר ניתוח מולטי-אומיקס

גנגליוני שורש גביים (DRG) מכילים גופי תאי נוירון חישה ראשוניים ומעבירים אותות חושיים היקפיים לחוט השדרה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לפירוק DRG בעכברים התומכת בבידוד סטנדרטי של גנגליונים שלמים מבניים, זיהוי סגמנטלי אנטומי, הכוונה אינטואיטיבית למשתמשים מתחילים, והפחתת פגיעות ברקמה פרוצדורלית.

ניתוח ובידוד של גנגליוני שורש גבי בעכבר

למדו שיטת immunoprecipitation כרומטין מרקמות השורש הגבי לאחר פציעה אקסונלית. טכניקה זו מאפשרת זיהוי אתרי קשירה של גורמי שעתוק ושינויים אפיגנטיים הרלוונטיים לרגנרציה עצבית במערכת העצבים ההיקפית והמרכזית.

הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal

גלה סרטונים נוספים