Name: התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: למד זיהוי מהיר של פוליו וירוס באמצעות שיטת התלכדות חלקיקים עם חלקיקי ג'לטין מחושרים. שיטה זו מפשטת את האבחון הווירולוגי ומקצרת משמעותית את זמן התוצאות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Junko ואדה לקבלת סיוע טכני מעולה שלה. אנו מודים לפרופ &#39;אקיו Nomoto עבור באדיבות מתן וקטור ביטוי baculovirus עבור PVR-IgG2a. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקי-in-Aid לקידום פוליו חיסול ומחקר על מתעוררים מחדש המתעוררים מחלות זיהומיות של משרד העבודה הבריאות, והרווחה.

1. הכנת בינוני אחזקה (MM) וצמיחה בינוני (GM) להכנת MM ו-GM, ראה מדריך מעבדה פוליו של WHO 1. מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 2% עוברית עגל בסרום (FCS) ו -10% FCS יכול לשמש תחליפים של MM ו-GM, בהתאמה. 2. הכנת נוגדנים נגד PV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטי PV מחדש נוגדנים (PV RIVM הקלדה antiserum) על ידי הוספת מים (0.5 מ"ל בכל בקבוקון) כדי בקבוקון אחד של נוגדן אנטי PV (סוג 1, 2 או 3). הוסף פתרונות נוגדן מחדש (0.5 מ"ל כל אחת) כדי מ"ל של 4.5 מ"מ צינורות שכותרתו נפרד. הערה: יש המון נוגדנים נגד PV ניתנים כצורה מחדש (0.5 מ"ל בכל בקבוקון). במשך הרבה כאלה של נוגדנים נגד PV, תוספת של מים הכינון מחדש לא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים נפח שווה של נוגדנים נגד PV מחדש. עבור אנטי PV1 2, 2 3, 1 או 3: מיקס 1.8 מ"ל של כל נוגדן מחדש (1.8 מ"ל + 1.8 מ"ל = 3.6 מ"ל של תערובת כל אחת). עבור אנטי PV1 2 3: מיקס 1.2 מ"ל של כל נוגדן מחדש (1.2 מ"ל + 1.2 מ"ל + 1.2 מ"ל = 3.6 מ"ל). הערה: דגימות PV יכול להכיל תערובת של סרוטיפים שונים של PV. כדי לזהות סרוטיפ אחת של PV בדגימות בתערובת של PVS, בריכות נגד PV נוגדנים (כלומר 1 2, 2 3, 3 1, 1 +2 +3) הוא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1 / 5 נפח של FCS (0.72 מ"ל) זה אנטי PV (1 2, 2 3, 3 +1, או 1 +2 +3) נוגדן (3.6 מ"ל כל אחד) (FCS 18.2% הסופי). הערה: תוספת של FCS הוא הפחתה של התלכדות בלתי ספציפיים של החלקיקים ג'לטין הנגרמת על ידי נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את בריכות נוגדן ב -20 ° C עד לשימוש assay הרשות. </li></ol> 3. הכינון של חלקיק ג'לטין רגיש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מ"ל של חיץ הכינון מחדש כלול בערכה על בקבוקון אחד של חלקיק ג'לטין רגיש (כאמור אבקת להקפיא מיובש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי לחיצה עדינה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החלקיקים רגיש מחדש ב 4 ° C. החלקיקים ג'לטין מחדש יכול להיות פעיל לפחות 2 שבועות שמר על 4 ° C, אבל צריך להיות מוכן לפני assay. </li></ol> הערה חשובה: אל תערבב הרבה שונים של חלקיקים ג'לטין רגיש, כי התמונה התלכדות של חלקיקים שאינם רגישים ג'לטין יכול להיות שונה על ידי הרבה של החלקיקים. עבור כל ניסוי, הרבה אחת של חלקיק ג'לטין רגיש אמור לשמש. 4. הרשות assay עבור PV זיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת מיקרו טיטרציה. לצורך זיהוי של דגימה אחת וירוס, אנחנו צריכים 5 + בארות אחד לפחות שליטה שלילי (חלקיק רגיש ללא וירוסים נוגדנים, גם # 6 ב להלן. ראה שום שליטה וירוס נוגדנים בדוגמה). סה"כ מספר בארות הוא 5 + x דגימות לפחות שליטה assay. הערה חשובה: נא לקחת לפחות אחד לא לשלוט וירוס הנוגדן assay. בקבוקון אחד של החלקיקים הוא כ רגיש לזיהוי של 10 דגימות נגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12 μL / היטב אנטי PV נוגדן או GM לצלחת מיקרו טיטרציה. סידור הצלחת הוא כדלקמן (ראה גם דוגמה בהמשך). בדגימות ללא נוגדנים (טוב # 1 ו - 6), להוסיף 12 μL של GM במקום אנטי PV נוגדן. הערה חשובה: אם רבים דגימות PV צריך להיבדק אצל assay זה, פיפטה רב או מנפק יהיה מועיל עבור שלב זה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ובכן # 1 </td><td> ובכן # 2 </td><td> ובכן # 3 </td><td> ובכן # 4 </td><td> ובכן # 5 </td><td> ובכן # 6 </td></tr><tr><td> ג'נרל מוטורס </td><td> אנטי P1 2 3 </td><td> אנטי P1 2 </td><td> אנטי P2 3 </td><td> ani-P1 3 </td><td> ג'נרל מוטורס </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12 μL / היטב מדגם וירוס. במדגם אחד ללא וירוס (טוב # 6), להוסיף 12 μL של GM במקום פתרון וירוס. הערה: מדגם וירוס הוא supernatant התרבות של תאים נגועים, תאים L20B בדרך כלל או תאים RD. הערה חשובה: אם רבים דגימות PV צריך להיבדק אצל assay זה, פיפטה רב יהיה מועיל עבור שלב זה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ובכן # 1 </td><td> ובכן # 2 </td><td> ובכן # 3 </td><td> ובכן # 4 </td><td> ובכן # 5 </td><td> ובכן # 6 </td></tr><tr><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> ג'נרל מוטורס </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח חלקיק מחדש פתרון רגיש מתוך 4 ° C לטמפרטורת החדר, לטפוח בעדינות לחלוטין להשעות את החלקיקים. הערה חשובה: לאחר השעיה מלאה של החלקיקים על ידי הקשה עדינים, חלקיקים יש להוסיף מיד את הצלחות לפני החלקיקים המרחפים precipitaטה והצורה הלא הומוגנית פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μL / טוב של חלקיק רגיש לכל הבארות. הערה חשובה: לאחר תוספת של חלקיקים רגישים, הצלחת לאלתר להיות כפופים להם לצלחת ערבוב להתחיל תגובה אחידה של הדגימות. לפיכך, תוספת של חלקיק רגיש צריך להתבצע באמצעות מתקן לצמצם פער הזמן בין דגימות הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת מיקרו טיטרציה על צלחת מיקסר מערבבים את הצלחת למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת מיקרו טיטרציה על נייר לבן (מטעמי נוחות של תצפית ויזואלית) על השולחן בטמפרטורת החדר (15 ~ 30 ° C) עבור 2 ח הערה חשובה: אל תזיז את הצלחת במהלך ואחרי התגובה להסתכלות התוצאות והתמונות לוקח. התלכדות שנוצר אינו יציב מופרעת בקלות על ידי הזזת צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות של הצלחת. הערה חשובה: נוף חלקי של התמונות לא יכול לתת מספיק נתונים לבדיקה ביקורת מאוחר יותר של תוצאות לפרשנות. כמה תמונות יש לנקוט כדי לכסות את כל הבארות של הצלחות התמקדות התמונה התלכדות של בארות. </li></ol> 5. פרשנות של התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי בארות חיוביים ושליליים. השווה את התלכדות בדגימות עם זה של שליטה וירוס נוגדנים לא (משקעים של חלקיקים ג'לטין, התלכדות לא) (איור 1 ו - 2). תמונות של התלכדות כי יש להבחין בבירור מן הנגיף לא ולא לשלוט נוגדן (לא התלכדות, שליטה שלילי) יש לשפוט חיובית, ותמונות של התלכדות דומים שליטה שלילי צריך להישפט כמו שלילית. דוגמאות שמראות התלכדות ברורה אך חלקית בלבד יכול להישפט חיובית, אבל שיא כמו 'חיובי (התלכדות חלקית) ". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי של PV. לפרש את תוצאות המבוססות על בארות חיוביות ושליליות עם אנטי PV הנוגדנים לזהות קפסיד PV. עקרון הפרשנות של התוצאה היא דומה לזו של בדיקת נטרול במערכת תרבית תאים (לדוגמה חיובית עבור נוגדן אנטי-P1 2 עולה כי המדגם מכיל 3 סוג PV). </li></ol> 6. נציג תוצאות התוצאה נציג הרשות assay PV זיהוי מוצג באיור 1. כל זני PV נוצר התלכדות של חלקיקים רגישים ג'לטין (אין נוגדנים דגימות). בנוכחות נוגדנים המתאימים אנטי PV, משקעים של חלקיקים ג'לטין (התלכדות לא) דומה וירוס לא ולא לשלוט נוגדנים (שליטה שלילי) נצפתה (למשל, PV1 (סבין) בנוכחות אנטי P1 או 2 אנטי P3 1 נוגדנים). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. וירוס פתרונות זיהוי PV ידי assay הרשות. PV1 של (סבין), PV2 (סבין), ו PV3 (סבין) (titers וירוס של 1.2 x 10 8 CCID 50 / 12 μL, 8.2 x 10 7 CCID 50 / 12 μL, ו 3.5 x 10 7 CCID 50 / 12 μL, בהתאמה) שימשו לזיהוי על ידי assay הרשות. אין וירוסים אין שליטה נוגדנים הראתה משקעים של חלקיקים ג'לטין (לא התלכדות, שליטה שלילי). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. פרשנות בארות חיוביים ושליליים. פתרונות וירוס של PV1 (סבין), PV2 (סבין), ו PV3 (סבין) (titers וירוס של 2.4 x 10 μL 8 50/25 CCID, 1.7 x 10 8 CCID 50 / 25 μL, ו 7.3 x 10 7 CCID 50 / 25 μL, בהתאמה) היו מדוללים 1 / 20 עד 1 / 320, ולאחר מכן 25 μL של דגימות בדילול נבחנו על ידי הרשות assay ללא אנטי PV נוגדנים.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Polio+Laboratory+Manual+%284th+edition%29+WHO%2FIVB%2F04.10%22">Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10</a>. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).</li>
<li>Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+particle+agglutination+method+with+soluble+virus+receptor+for+identification+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).</li>
<li>Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+poliovirus+with+its+cell+surface+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interaction of poliovirus with its cell surface binding site.</a> Virology. 201, 107-115 (1994).</li>
<li>Koike, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poliovirus+receptor+protein+is+produced+both+as+membrane-bound+and+secreted+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J.+9%22%5BJournal%5D)">The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms.</a> Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).</li>
<li>Mendelsohn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+a+human+poliovirus+receptor+gene+into+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).</li>
<li>Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+receptor+for+poliovirus%3A+molecular+cloning%2C+nucleotide+sequence%2C+and+expression+of+a+new+member+of+the+immunoglobulin+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily.</a> Cell. 56, 855-865 (1989).</li>
<li>Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+poliovirus+with+its+purified+receptor+and+conformational+alteration+in+the+virion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion.</a> J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).</li>
<li>McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+binding+affinities+of+poliovirus+for+its+cellular+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).</li>
<li>Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+L+cells+expressing+the+human+poliovirus+receptor+for+the+specific+detection+of+polioviruses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro.</a> J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).</li>
<li>Avoort, H. G. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+five+methods+for+intratypic+differentiation+of+polioviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).</li>
<li>Kilpatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+group-%2C+serotype-%2C+and+vaccine+strain-specific+identification+of+poliovirus+isolates+by+real-time+reverse+transcription-PCR+using+degenerate+primers+and+probes+containing+deoxyinosine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).</li>
</ol>

Souji Masujima הוא עובד של מוצר חדש מחלקת עיצוב, Fujirebio בע&quot;מ

הנקודה הייחודית של assay זו הרשות היא ניצול של המולקולה PVR במקום אנטי PV נוגדנים לצורך זיהוי של PV 2. זה מאפשר אינטראקציה ספציפית של חלקיקי ג&#39;לטין רגיש עם PV עם זיקה אחיד לכל שלושת קפסיד של PV 3-6. השתמשנו צורה immunoadhesin של PVR (PVR-IgG2a) עבור סנסיטיזציה של חלקיקי ג&#39;לטין, כי צורות monomeric של PVR יש רק זיקות מתונה לאתר קישור יחיד על virion (ניתוק קבוע של 10 ~ -7 -8 M) 7, 8, וצפו בהצלחה התלכדות מסוימת של חלקיקי ג&#39;לטין רגיש עם מבוד...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> רגיש, ג&#39;לטין חלקיקים </td><td> Fujirebio בע&quot;מ </td><td></td><td> מבחן הערכה </td></tr><tr><td> הכינון חיץ </td><td> Fujirebio בע&quot;מ </td><td></td><td> מבחן הערכה </td></tr><tr><td> Microtitration צלחת </td><td> Fujirebio בע&quot;מ </td><td></td><td> מבחן הערכה </td></tr><tr><td> Anti-PV נוגדן </td><td> RIVM </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

ב גלובל פוליו חיסול היוזמה, אבחנה מעבדה משחק תפקיד קריטי ידי בידוד וזיהוי PV מן דגימות צואה של שיתוק רפה (AFP) במקרים אקוטיים. בארגון הבריאות העולמי (WHO) גלובל פוליו מעבדה רשת, PV בידוד וזיהוי כרגע מתבצע באמצעות תרבית תאים של המערכת בזמן אמת RT-PCR, בהתאמה. בעידן שלאחר מיגור של PV, הליכי זיהוי פשוטה ומהירה יהיה מועיל לאישור מהיר של מקרי פוליו במעבדות הלאומיות. במחקר הנוכחי, אנו נראה את ההליך של assay הרשות חדשנית שפותחה לצורך זיהוי PV. זה assay הרשות מנצל האינטראקציה של מולקולת PV (PVR) הקולטן virion כי הוא זיקה מסוימת ואחידה לכל קפסיד של PV. ההליך הוא פשוט (אחד הליך צעד צלחות תגובה) ומהירה (ניתן להשיג תוצאות בתוך שעות 2 של התגובה), והתוצאה היא נצפתה חזותית (תצפית של התלכדות של חלקיקי ג&#39;לטין).

החלקיקים פיתחה לאחרונה רומן התלכדות (רש&quot;פ) assay ניצול קולטן מולקולה וירוס איפשר זיהוי מהיר וקל של poliovirus (PV). במאמר זה, אנו נראה את הליך assay הרשות לצורך זיהוי PV.

במסגרת היוזמה הגלובלית למיגור פוליו, לאבחון מעבדתי יש תפקיד מכריע בבידוד וזיהוי PV מדגימות צואה של חולים במצב חריף...

המטרה הכוללת של הפרוצדורה הבאה היא לזהות במהירות בידודים של נגיף הפוליו באמצעות פרוטוקול פשוט. עבור בדיקה זו, אנו משתמשים בחלקיקי ג'לטין רגישים המצופים במולקולות כימריות המכילות את הדומיין החוץ-תאי של קולטן נגיף הפוליו האנושי המחובר ל-IgG two fc. מכיוון שלחלקיקים אלו יש זיקה אחידה לכל הסרוטיפים של בידודים של נגיף הפוליו, אגלוטינציה של החלקיקים מתרחשת בעת דגירה עם דגימות המכילות כל סוג של נגיף פוליו אנושי.עם זאת, אם נוכחים נוגדנים המסוגלים לזהות את נגזרת הויראלית הספציפית המבודדת מהדגימה, מתרחב נטרול המונע את השקיעה. באמצעות מערכת ניסויית זו, ניתן לבצע זיהוי מהיר של בידודי פוליוויראלי בתגובה בעלת שלב אחד. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו בדיקת נטרול קונבנציונלית, הוא הפשטות של הפרוצדורה והפירוש, במטרה להפחית את העבודה הנדרשת ולהאיץ את קבלת התוצאות. כדי לשחזר את הנוגדנים anti PV one, PV two ו-PV three, הוסיפו 0.5 milliliters של מים לכל בקבוקון.לאחר מכן, העבירו כל תמיסת נוגדן למבחנות נפרדות המכילות 4.5 מיליליטר של מדיום תחזוקה. חלק מהמנות של נוגדן anti PV מסופקות בצורה רקונוסטיטוטית; עבור מנות אלו של נוגדן anti PV, אין צורך בהוספת מים לשם רקונוסטיטוציה.בשלב הבא, הכינו תערובות ביחס של אחד לאחד של תמיסות נוגדים משולבות בנפח סופי של 3.6 milliliters במבחנות חדשות ומסומנות. לדוגמה, ערבבו 1.8 milliliters של anti PV one עם 1.8 milliliters של anti PV two. כדי להכין שילוב של anti PV one פלוס PV two, חזרו על פעולה זו עבור כל שילוב זוגי אפשרי, ובנוסף הכינו תמיסה המכילה את כל שלושת סוגי הנוגדים על ידי ערבוב של 1.2 milliliters מכל סרום נוגדים (antiserum).לאחר הכנת ארבע התערובות, יש להוסיף 720 microliters של FCS לכל תמיסת נוגדן. פעולה זו תסייע להפחית שקיעה (agglutination) לא ספציפית של חלקיקי ג'לטין על ידי הנוגדנים במהלך הבדיקה. ניתן לשמור את מאגרי הנוגדנים בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius עד לשימושם בבדיקת השקיעה.בבדיקה זו, אנו משתמשים בחלקיקי ג'לטין בליאופיליזציה המצופים בדומיינים התאיים של הקולטן האנושי לווירוס הפוליו ודומיינים של FC מעכבר של IgG2. יש להשתמש במנה אחת של חלקיקים ולא במנות שונות בניסוי אחד, כדי להבטיח עקביות של תמונת השקיעה. לשחזור החלקיקים, יש להוסיף 1.5 milliliters של תמיפת שחזור לכל מבחנה. הקישו בעדינות כדי לערבב היטב.ניתן לשמור את החלקיקים לאחר השחזור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. ראשית, תכננו את הניסוי בלוחית מיקרוטיטר בעלת 96 בארות. עבור כל דגימה, באר מספר אחת תכיל את הנגיף לבדו.בבארים שתיים עד חמש יהיו הנגיף בתוספת אחד מארבעת התמיסות המעורבבות של הנוגדים. הקפידו לשמור באר אחת עבור ביקורת שלילית המכילה מצע בלבד, ללא נגיף או נוגדן. לאחר הגדרת הפלטה, הוסיפו 12 µL של תמיסת הנוגדים המתאימה לכל באר משורות שתיים עד חמש, ו-12 µL של מצע גידול.תווך למעבדה לנגיף בלבד, לבארות בשורה אחת, ולבארת ביקרת השלילה בשורה שש. לאחר מכן, הוסף 12 µL של דגימת נגיף לחמש השורות הראשונות ו-12 µL של תווך גידול לבארת ביקרת השלילה בשורה שש. לאחר שהנוגדנים והנגיף הופצו בבארות, השהה מחדש את חלקיקי הג'לטין המשוחזרים על ידי טפיחות עדינות והוסף מיד 25 µL של חלקיקים לכל בארה בכל הבארות.חשוב להקפיד שהחלקיקים לא ישקעו לפני העברתם ללוחית, וזאת כדי להבטיח כמות שווה של חלקיקים בכל באר. הנח את לוחית הבדיקה על מערבל ללוחיות וערבב למשך 30 שניות. לאחר מכן, הנח את הלוחית על דף נייר לבן והדגרה אותה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי לאפשר להתרחש שקיעה (agglutination).חשוב לא להזיז את הפלטה בשום שלב במהלך או לאחר האינקובציה, כיוון שהאגלוטינציה שנוצרה אינה יציבה. ברגע שהתגובה הסתיימה, צלם מספר תמונות של הפלטה שבהן ניתן להתרשם מאיכות האגלוטינציה בכל באר. בבאריים שבהם לא התרחשה אגלוטינציה, כפי שמוצג כאן משמאל, חלקיקי ג'לטין צבעוניים ישקעו בתחתית הבאר, ובבאריים שבהם התרחשה אגלוטינציה.בשל האינטראקציה בין הווירוס לבין חלקיקי ג'לטין מצופים ב-pvr ו-IgG two A, נראה תבנית צבעים מפוזרת כפי שמוצג במרכז. בניסוי זה, בדקנו את יכולתם של תמיסות וירוס, PV one, two ו-three, להשרות glu בנוכחות הנוגדן. בשילובים המצוינים כאן, בהיעדר וירוס או נוגדנים, לא מתרחשת אגלוטינציה וחלקיקי הג'לטין שוקעים, בניגוד לבאר המכילה וירוס אך ללא נוגדנים.התרחשה אגלוטינציה כתוצאה מאינטראקציה של הווירוס. עם חלקיקי ג'לטין מצופים ב-PVR IgG בבארות הניסוי, אגלוטינציה של הווירוסים נמנעת בכל באר המכילה נוגדנים המנטרלים באופן ספציפי את אותו וירוס. לדוגמה, אגלוטינציה של poliovirus type one נמנעת בבארות המכילות נוגדני anti PV one, אך לא בבארות המכילות רק נוגדני anti PV two ו-anti PV three.הדבר נכון גם לגבי סוגי פוליווירוס שני ושלוש. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך שלוש שעות בלבד, אם היא מבוצעת כראוי.

particle-agglutination-method-for-poliovirus-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הגנום של שפעת וירוס כוללת שמונה מתחמים נפרדים של רנ"א וחלבונים, כינה מתחמי ribonucleoprotein ויראלי (vRNPs). מאמר זה מתאר את שיפוע גליצרול טיהור במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים להדמיה של שפעת vRNPs.

טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי

במאמר זה, פשוט, כמותי, שלב נוזלי זיקה assay לכידת מוצג. זוהי טכניקה אמין מבוסס על אינטראקציה בין חרוזים מגנטיים החלבונים המתויגים (למשל Nanobodies) מצד אחד, את הזיקה בין חלבון מתויג החלבון השני, שכותרתו (poliovirus למשל) מצד שני.

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת משקעים חיסוניים, הנקראת בדיקת לכידת VLP, כדי לבודד חלקיקים דמויי וירוסים המציגים אנטיגן, או VLPs, מדגימה. האנטיגן נקשר עם נוגדנים ספציפיים הקשורים לחרוזים מגנטיים, ויוצר קומפלקס נוגדנים אנטיגן משותק המופרד מאוחר יותר ומאוחסן לניתוח נוסף.

בדיקת לכידת החלקיקים דמויי הנגיף: שיטה לבידוד VLPs המציגים אנטיגן מדגימה באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדים לנוגדנים מנטרלים

סרטון זה מדגים את בדיקת המיקרו-נטרול מבוססת הדימות לניתוח היחסים האנטיגניים בין נגיפי שפעת A ו-B. הוא מספק דרך כמותית וויזואלית להעריך את יעילותם של נוגדנים או טיפולים אחרים במניעת זיהום ויראלי.

ניתוח הקשר האנטיגני בין וירוסים באמצעות בדיקת מיקרונטרול מבוססת תמונה

באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי בשילוב עם טכנולוגיית ביו-פאנינג יצרנו מערכת ביו-פאנינג שלילית וחיובית לרכישת נוגדנים כנגד וריאנטים חלבונים ספציפיים למחלה הנמצאים בכל חומר ביולוגי, אפילו בריכוזים נמוכים.  הצלחנו להשיג נוגדנים לגרסאות חלבון TDP-43 המעורבות בטרשת אמיוטרופית צידית.

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

אנו מספקים אסטרטגיה חדשה לבידוד תאי שכפול ויראלי (RC) מתאים אנושיים נגועים באדנו-וירוס (Ad). גישה זו מייצגת מערכת נטולת תאים שיכולה לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את שכפול הגנום הנגיפי וביטויו, כמו גם ויסות האינטראקציות הוויראליות-מארח שהוקמו ב-RC.

בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus

באמצעות אסטרטגיית מיקרו-מערך גליקן מודפסת, מבחן צלחת קונבנציונאלי של 96 בארות ממוזער לניתוח של נגיף ההמגלוטינין של נגיף השפעת A והספציפיות לקולטנים המכילים חומצה סיאלית.

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

כאן, אנו מתארים שיטת מיקרו-השאיפה תא אחד להפרדה של אמבות נגוע. על מנת להפריד אוכלוסיות משנה ויראלי ב Vermamoeba vermiformis נגוע על ידי פאוסטווירוסים ווירוסים ענקיים לא ידוע, פיתחנו את הפרוטוקול מפורט להלן והפגינו את יכולתה להפריד בין שני שפע ווירוסים ענק הרומן.

תא בודד מיקרו-שאיפה כאסטרטגיה חלופית מיון תאים פלואורסצנטית מופעל עבור הפרדה וירוס ענק תערובת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אפיטופים נטרול על חלקיקים דמויי וירוס אנטיגן מציגים (VLPs). אימונופרציפיטציה של נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגזר VLPs מתבצע באמצעות נוגדנים חד שבטיים ספציפיים glycoproteins מעטפה בשילוב חלבון חרוזים מגנטיים מצומדים G. VLPs שנתפסו כפופים לאחר מכן SDS-PAGE וניתוח כתם מערבי באמצעות חלבון הליבה הנגיפי נוגדנים ספציפיים ל-Gag.

זיהוי אפיטופים רגישים לנטרול באנטיגנים המוצגים על חיסונים מבוססי חלקיקים דמויי וירוס (VLP) באמצעות בדיקת לכידה

תהליך עבודה מקיף של פרוטוקול מעבדה וניתוח מתוארים לבדיקה מהירה, חסכונית ופשוטה המבוססת על תאים צבעוניים כדי לזהות אלמנטים מנטרלים מול AAV6.

שיטה שלב אחר שלב לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד AAV באמצעות בדיקה מבוססת תאים צבעוניים

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירה וטיהור של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות שיטת כרומטוגרפיית זיקה אופטימלית מבוססת הפרין. הוא מציג גישה פשוטה, ניתנת להרחבה וחסכונית, ומבטל את הצורך באולטרה-צנטריפוגה. הווקטורים המתקבלים מפגינים טוהר גבוה ופעילות ביולוגית, מה שמוכיח את ערכם במחקרים פרה-קליניים.

בידוד של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות פרוטוקול כרומטוגרפיית זיקה הפרין חד-שלבי וחצי אוטומטי

למד זיהוי מהיר של פוליו וירוס באמצעות שיטת התלכדות חלקיקים עם חלקיקי ג'לטין מחושרים. שיטה זו מפשטת את האבחון הווירולוגי ומקצרת משמעותית את זמן התוצאות.

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

גלה סרטונים נוספים