התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא לזהות במהירות נגיף פוליו מבודד באמצעות פרוטוקול פשוט. לצורך בדיקה זו, אנו משתמשים בחלקיקי ג'לטין רגישים המצופים במולקולות כימריות, המכילות את התחום החוץ-תאי של קולטן נגיף הפוליו האנושי המחובר ל-IgG two fc. מכיוון שלחלקיקים אלה יש זיקה אחידה לכל הסרוטיפים של נגיף הפוליו המבודד, הצטברות החלקיקים מתרחשת עם הדגירה עם דגימות המכילות כל נגיף פוליו אנושי.

עם זאת, אם קיימים נוגדנים המסוגלים לזהות את הבידוד הנגיפי הספציפי של הדגימה, מתרחש נטרול ומונע אגלוטינציה באמצעות מערכת ניסיונית זו, ניתן לבצע זיהוי מהיר של מבודדי נגיף הפוליו בתגובה שלב אחד. היתרון העיקרי של טכניקה זו של כלי קיים, כמו בדיקת נטרול קונבנציונלית, הוא פשטות ה-SIM של ההליך והפרשנות, במטרה להפחית את העבודה ולזרז את הנדרש ולקצר את זמן התוצאות. כדי להרכיב מחדש את הנוגדנים נגד PV 1, PV 2 ו-PV 3, הוסף 0.5 מיליליטר מים לכל בקבוקון.

לאחר מכן העבירו כל תמיסת נוגדנים לצינורות נפרדים המכילים 4.5 מיליליטר של אמצעי תחזוקה. כמה הרבה נוגדנים נגד PV מסופקים בצורה משוחזרת עבור כמות כזו של נוגדנים נגד PV. אין צורך בהוספת מים להרכבה מחדש.

לאחר מכן, הכינו תערובות אחד לאחד של תמיסת נוגדנים משולבת בנפח סופי של 3.6 מיליליטר בצינורות מסומנים טריים. לדוגמה, מערבבים 1.8 מיליליטר של אנטי PV אחד עם 1.8 מיליליטר אנטי PV שניים. כדי להכין שילוב אנטי PV אחד ועוד PV שניים, חזור על זה עבור כל שילוב זוגי אפשרי והכן גם תמיסה המכילה את כל שלושת סוגי הנוגדנים על ידי ערבוב יחד של 1.2 מיליליטר מכל אנטיסרום.

לאחר שארבע התערובות נוצרו ב-720 מיקרוליטר של FCS לכל תמיסת נוגדנים. זה יעזור להפחית אגלוטינציה לא ספציפית של חלקיקי ג'לטין על ידי נוגדנים במהלך הבדיקה. ניתן לאחסן את מאגרי הנוגדנים במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש בבדיקת הצבירה.

בבדיקה זו, אנו משתמשים בחלקיקי ג'לטין ליופיליים שצופו בתחומים החוץ-תאיים של קולטן נגיף הפוליו האנושי ו-IgG שני תחומי FC של עכבר. הקפד להשתמש במנה אחת של חלקיקים ולא במנות שונות בניסוי אחד כדי להבטיח עקביות של תמונת הצבירה כדי להרכיב מחדש את החלקיקים ב-1.5 מיליליטר של מאגר בנייה מחדש לכל בקבוקון. הקש בעדינות כדי לערבב היטב.

ניתן לאחסן את החלקיקים המחודשים בארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים. ראשית, תכנן את הניסוי שלך בצלחת מיקרוטיטר של 96 בארות. עבור כל דגימה, באר מספר אחת תכיל את הנגיף בלבד.

בארות מספר 2 עד 5 יכילו את הנגיף בתוספת אחת מארבעת תמיסות הנוגדנים המעורבות. הקפד לשמור באר אחת לבקרה שלילית המכילה מדיה בלבד ללא וירוס או נוגדן. לאחר הגדרת הצלחת, הוסף 12 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים הנכונה לכל באר משורות שתיים עד חמש ו-12 מיקרוליטר של גידול.

בינוני לנגיף בלבד, בארות בשורה הראשונה, ולשליטה השלילית באר בשורה שש. לאחר מכן, הוסף 12 מיקרוליטר של דגימת וירוס בחמש השורות הראשונות ו -12 מיקרוליטר של מצע גידול לבאר הבקרה השלילית בשורה שש. לאחר שהנוגדנים והנגיף הוקלטו, יש להחיות את חלקיקי הג'לטין המשוחזרים על ידי הקשה עליהם בעדינות ולהוסיף מיד 25 מיקרוליטר של חלקיקים לכל באר לכל הבארות.

חשוב לא לתת לחלקיקים לשקוע לפני העברתם לצלחת על מנת לקבל כמויות שוות של חלקיקים בכל אחד מהם. ובכן מניחים את צלחת הבדיקה על מערבל צלחת ומערבבים במשך 30 שניות. לאחר מכן הניחו את הצלחת על דף נייר לבן ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי לאפשר צבירה.

חשוב לא להזיז את הצלחת בשום עת במהלך הדגירה או לאחריה מכיוון שהאגלוטינציה שנוצרה אינה יציבה. לאחר שהתרחשה התגובה, צלם מספר תמונות של הצלחת בהן ניתן להעריך את איכות הצבירה בכל באר. בבארות שבהן לא התרחשה אגלוטינציה, כפי שמוצג כאן משמאל, חלקיקי ג'לטין צבעוניים ישקעו בתחתית הבאר בבארות שבהן התרחשה אגלוטינציה.

בשל האינטראקציה בין הנגיף ל-pvr, חלקיקי ג'לטין מצופים IgG שני A, נראה דפוס צבעוני מפוזר כפי שמוצג במרכז. בניסוי זה, בדקנו את היכולת של תמיסות וירוסים, PV 1, 2 ו-3 לגרום ל-glu בנוכחות הנוגדן. שילובים המצוינים כפי שמוצג כאן בהיעדר נגיף או נוגדנים, לא מתרחשת אגלוטינציה וחלקיקי הג'לטין משקעים בניגוד לנגיף המכיל היטב, אך ללא נוגדנים.

אגלוטינציה התרחשה עקב האינטראקציה של הנגיף. עם חלקיקי הג'לטין המכוסים PVR IgG two A בבארות הניסוי, נמנעת אומת עודף של הנגיפים בכל באר המכילה נוגדנים המנטרלים באופן ספציפי את הנגיף. לדוגמה, אומת עודף של נגיף פוליו מסוג 1 נמנעת בבארות המכילות נוגדנים נגד PV 1, אך לא בבארות המכילות רק נוגדנים נגד PV 2 ואנטי PV 3.

הדבר נכון גם לגבי נגיף הפוליו מסוג 2 ו-3. בזמן מאסטר, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שלוש שעות בלבד אם היא מבוצעת כראוי.