אימון ממוקד של קולות Ultrasonic בחולדות ומעלה פרקינסון
8 באוגוסט 2011
הפרעות קוליות מתיש הזדקנות מחלת פרקינסון. קולות קולי של חולדות, מושפע גם בתנאים אלו, יכול לשמש כדי ללמוד הפרעות אלה קול, מצעים העצבית שלהם, את האופי של התאוששות תפקודית עם התערבות התנהגותית.
המטרה הכללית של הליך זה היא לאמן חולדות להגדיל את מספרם ואת מורכבותם של הקולות האולטרסוניים שלהן, או USVs. דבר זה מושג תחילה על ידי הקלטה של קולות בסיס (baseline). השלב הבא הוא אימון לקולות ממוקדים באמצעות חיזוק חיובי.
לאחר האימון, מוקלטות הקוליות. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ניתוח אקוסטי והשוואה בין הקוליות של קו הבסיס לקוליות לאחר האימון. לבסוף, ניתן להפיק את התוצאות.
דבר זה מראה כי אימון מגביר את מספרן ומורכבותן של הפעולות הקוליות האולטרסוניות (ultrasonic vocalizations) באמצעות הגברה של פרמטרים אקוסטיים כגון רוחב פס, תדר שיא ומשך זמן. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום של הפרעות תקשורת, כגון האופן שבו תרגול קולי מווסת מנגנונים עצביים בסיסיים. כמו כן, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי גירעונות סנסורי-מוטוריים קרניאליים הקשורים למחלת פרקינסון ולהזדקנות.
ניתן להחיל שיטה זו גם על מודלים של מחלות ומצבים אחרים המשתמשים בקולקולציות אולטרסוניות כמדד התנהגותי. את אימון הקולקולציה ידגימו Emerald Dahl ו-Jamie Shire, חברים במעבדתי. כדי להתחיל בניטור אולטרסוני, טענו את תוכנת Avis Soft Recorder ובחרו באפשרות "permanent unlimited" עבור הטריגר (trigger), כדי לאפשר התחלה ועצירה ידנית של ההקלטות. לאחר מכן, הגדירו בתיקיית הבסיס (base directory) את המיקום שבו יישמרו קבצי השמע המוקלטים.
קצב הדגימה חייב להיות לפחות 200,000 hertz כדי ללכוד את תדר הקול הגבוה ביותר. לאחר הגדרת פרמטרים אלו, הסירו את החלק העליון של כלוב הבית של הזכר והניחו אותו ישירות מתחת למיקרופון. לאחר מכן, זהו נקבת חולדה הנמצאת בתחוש מינית על פי נוכחות של לורדוזיס, רעידות אוזניים ותנועות מהירות ופתאומיות.
הכניסו את הנקבה המקבלת לתוך כלוב הבית של חולדת הזכר הנבדקת. כאשר הזכר מגלה עניין בנקבה על ידי הרחה, רדיפה או טיפוס עליה, הוציאו את הנקבה והקליטו את הקולות של הזכר למשך דקה עד שתי דקות. עקבו אחר הקולות העל-סאונריים באופן חזותי באמצעות צפייה בספקטרוגרמה בזמן אמת.
אם הזכר אינו משמיע קולות, החזירו מיד ובאופן קצר את נקבת החולדה לכלוב הבית של הזכר כדי לעורר קולקליזציה. להתחלה, הביאו חולדה זכר אחת לחדר האימון. את כל שאר הזכרים יש להחזיק בחדר סמוך עד למועד סשן האימון שלהם.
יש להגביל את גישת החולדה למים מראש כדי להקל על השימוש במים כגמול. במהלך האימון, הגדירו את מקליט ה-Avis soft כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, מקמו את כלוב הבית מתחת למיקרופון.
לאחר שהזכר הגיע לעמדו, הכניסו לכלוב נקבת חולדה רספסיבית. הוציאו את הנקבה ברגע שהזכר גילה בה עניין, ועקבו אחר קריאות השרה (target vocalizations). בשלב ראשוני, כל קריאה מודולציית תדר בתדר של 50 kilohertz תזכה בחיזוק.
הגש את התגמול על ידי לחיצה בו-זמנית על עט והצגה קצרה של בקבוק מים או מזון. ככל שהאימון מתקדם, חזק רק רצפי קריאות מורכבים יותר, כגון רצפים של חמש או 10 קריאות ברצף מהיר. המשך באימון עד שיינתנו 30 חיזוקים.
תהליך זה אורך בדרך כלל בין חמישה ל-10 דקות לצורך ניתוח ההקלטות של קו הבסיס ולאחר האימון. ראשית, צרו גיבוי של קובץ הקול המקורי ובצעו עריכות על עותק עבודה כדי להסיר תדרי רעש הנמוכים מהווקליזציות האולטרסוניות. השתמשו במצב ה-batch של AVI Soft SaaS Lab Pro כדי להחיל מסנן מעביר גבוה (high pass filter) על קובצי הקול בתדר של 25 kilohertz.
כדי לקבוע את סף הרעש הדרוש לשימוש בתכונת הזיהוי האוטומטי של אלמנטים ב-SaaS Lab Pro, פתחו קובץ קול וצרו ספקטרוגרמה. הגדירו את אורך ה-FFT ל-512 עם גודל מסגרת של 75% וחפיפה זמנית של 93.75%. הפעילו את עריכת צורת הגל (waveform), כך שרעש שנמחק מהספקטרוגרמה יוסר גם מצורת הגל. הגדירו את מדידות הפרמטרים האוטומטיות כפי שמוצג כאן.
שלושת הפרמטרים שימדדו הם משך האלמנט, תדר השיא ואמפליטוד השיא. במיקום המדידות, הפעילו את החלק של האמפליטודה המקסימלית ואת הפרמטר המינימלי והמקסימלי של האלמנט כולו. תחת הפרדת אלמנטים, בחרו בסף בודד אוטומטי והציגו את הסף.
מצאו אזור בספקטרוגרמה שבו אין קריאות או רעשים. זהו רעש הרקע. הגדירו את הסף לערך הנמצא מעט מעל רעש הרקע.
על ידי התאמת הקו השחור בחלון ספקטרום ההספק שמעל הספקטרוגרמה, ניתן למצוא כאן את רמת הדציבל של הסף שנקבע בשלב הקודם. הגדירו את ערך האמפליטודה לדחייה (rejective amplitude is less than value) לדציבל אחד מתחת לסף. שני ערכים אלו ישמשו כעת עבור כל קבצי הקול המנותחים.
בהנחה שכל הגדרות ההקלטה היו זהות, כדי לסמן את הקולקולציות (Vocalizations), צרו ספקטרוגרמה באמצעות סף הסף האוטומטי שהגדרられた קודם לכן ואותן הגדרות שהוצגו לפני כן. מחקו ידנית כל רעש העונה לקריטריונים הבאים: א', רעש שזוהה בטעות כקולקולציה; ב', רעש המשפיע על הבחנת תחילתה ו/או סופה של הקולקולציה; ג', רעש שזוהה בטעות כתדר הגבוה ביותר או הנמוך ביותר בקולקולציה, המסומנים על ידי הקווים האדומים העליון והתחתון בהתאמה.
במקרים מסוימים, לא ניתן להפריד קולאציה מהרעשים שמסביבה, כגון רעש של מצע במהלך תנועה. קולאציה זו אינה ניתנת לניתוח מדויק ויש למחוק אותה לאחר שכל הקולאציות זוהו; מחקו לצמיתות את קטעי הספקטרוגרמה שנמחקו מקובץ הקול. על ידי בחירה ב-remove, מחקו קטעי ספקטרוגרמה מה-waveform מתוך תפריט ה-tools כדי ליצור תוויות קבועות בקובץ הקול.
פתחו את חלון הגדרות מדידת הפרמטרים האוטומטית ולחצו על כפתור העריכה בסעיף הפרדת האלמנטים באופן חזותי וקולי. סקרו כל קולאציה (vocalization) מסומנת כדי לקבוע את הקטגוריה שלה והקצו את התווית המתאימה באמצעות מודולי הטקסט המוגדרים מראש. הקטגוריות שבהן אנו משתמשים בניתוח שלנו הן תדר פשוט (simple frequency), מודולציה (Modulated) והרמוניה (harmonic).
סגרו את הספקטרוגרמה, שמרו את קובץ הקול והמשיכו לקובץ הקול הבא לניתוח. לאחר שזוהו הקולות (Vocalizations) בכל קובצי הקול, השתמשו בכלי עיבוד האצוות (batch processing) כדי למדוד באופן אוטומטי את הפרמטרים האקוסטיים של כל הקבצים. בתיבת הדיאלוג של עיבוד האצוות, בחרו "מדידות פרמטרים אוטומטיות" מהתפריט הנפתח.
סמנו את תיבת הבחירה "process all files in the selected folder" (עיבוד כל הקבצים בתיקייה הנבחרת). לאחר מכן, לחצו על כפתור התיקייה ובחרו את התיקייה שבה שמורים קבצי הקול. לחצו על start (התחל) וכל קובץ ינותח באופן אוטומטי בהתאם להגדרות שבהן נעשה שימוש לאחרונה.
בתיבת הדיאלוג להגדרת מדידת פרמטרים אוטומטית, המדידות יישמרו בקובץ טקסט שניתן להגדירו באמצעות פקודת ההגדרות של DDE parameters slash log file. קובץ טקסט זה ניתן להטמעה בתוכנה לניתוח סטטיסטי. גרפים אלו מדגימים כי מספר הקולקולציות לכל סשן וקצב הקולקולציות לדקה עולים שניהם לאורך תקופת אימון של שישה שבועות.
כאן מוצגות, משמאל לימין, קולקולציות מייצגות לכל אחת משלוש הקטגוריות של קולקולציות ב-50 kilohertz שבהן השתמשנו. אלו הן קולקולציות בעלות תדר פשוט, מודולציה והרמוניות. בדוגמה זו, מוצגות קולקולציות עם מודולציית תדר מאותו חולדה לפני השראת פארקינסוניזם, לאחר השראת פארקינסוניזם ואחרי אימון קולקולציות.
בהשוואה לקריאה הבסיסית בפאנל A, הקריאה במצב הפרקינסוניזם בפאנל B מראה הפחתה ברוחב הפס, במשך ובעוצמה. הקריאה לאחר האימון המוצגת בפאנל C מדגימה כיצד המשך, העוצמה, רוחב הפס ואפנון התדר חוזרים לרמות הבסיס לאחר אימון קולי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לאמן, להקליט ולנתח קריאות אולטרסוניות של חולדות.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לאימון חולדות להגדלת מספרם ומורכבותם של קולקולציות אולטרה-סוניות (USVs), ובכך מספק מודל לחקר ליקויים קוליים הקשורים למחלת פרקינסון (PD) ולהזדקנות. השיטה משלבת אימון התנהגותי, הקלטה אולטרה-סונית ואנליזה אקוסטית כדי לבחון באופן שיטתי את המנגנונים הסנסו-מוטוריים העומדים בבסיס הקולקולציה ואת הוויסות שלהם באמצעות התערבויות ממוקדות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מדעים התנהגותיים
- הפרעות בתקשורת
רקע
- ליקויים בקול נפוצים במחלת פרקינסון (PD) ובתהליכי הזדקנות, והם משפיעים על התקשורת ועל איכות החיים.
- אימון קולי ממוקד יכול לשפר ליקויים ספציפיים, אך המנגנונים לכך נותרו לא ברורים.
- פליטות קול אולטרסוניות של מכרסמים משמשות כמודל לחקר התשתיות העצביות של התנהגות קולית.
- מודלים בעלי חיים מאפשרים חקירה מבוקרת של גורמים שקשה לנהל במחקרים בבני אדם.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה סיסטמטית לאימון וניתוח של קולות אולטרה-סוניים (ultrasonic vocalizations) בחולדות.
- הערכה של השפעת אימון קולי ממוקד על פרמטרי הקול במודלים של מחלת פרקינסון (PD) והזדקנות.
- קישור בין שיפורים התנהגותיים לבין שינויים עצביים ונוירו-שריריים בבסיסם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השראה של פרקינסוניזם בחולדות באמצעות עירוי חד-צדדי של 6-hydroxydopamine (6-OHDA).
- שימוש במודלים של חולדות מזדקנות (Fischer 344/Brown Norway F1).
- אימון התנהגותי באמצעות חיזוק חיובי (פרסים של מזון או מים) להגברת USVs מורכבים.
- הקלטה אולטרסונית באמצעות מיקרופונים בעלי תדר גבוה ותוכנה ייעודית (Avisoft Recorder, SASLab Pro).
- ניתוח אקוסטי של קולות עבור פרמטרים כגון משך, תדר שיא, רוחב פס ואמפליטודה.
- סיווג ומדידה ידניים ואוטומטיים של סוגי קולות (פשוטים, מודולציוניים, הרמוניים).
תוצאות עיקריות
- אימון מגביר הן את מספרן והן את המורכבות של הקולות האולטרסוניים בחולדות.
- פרמטרים אקוסטיים כגון bandwidth, תדר שיא ומשך זמן משתפרים לאחר האימון.
- במודלים של PD, נצפו פגמים בקולקולציה (bandwidth, משך זמן ועוצמה מופחתים) לאחר השראת נגע.
- אימון קולי ממוקד מחזיר את פרמטרי הקולקולציה לרמות הבסיס במודלים של PD.
מסקנות
- פרוטוקול זה מאפשר מחקר שיטתי של ליקויים בהפקה קולית והחלמה במודלים של מכרסמים.
- אימון ממוקד יכול לשפר ביעילות את המורכבות ואת קצב ההפקה הקולית, גם במודלים של מחלות.
- הגישה מספקת תובנות לגבי המנגנונים העצביים והסנסורי-מוטוריים העומדים בבסיס שיקום קולי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אימון וניתוח שיטתיים של קולקולציות אולטרסוניות בחולדות מזדקנות ובחולדות עם מחלת פרקינסון מספקים מודל פרה-קליני חסון לחקירת ליקויים סנסורי-מוטוריים הרלוונטיים להפרעות תקשורת. גישה זו מאפשרת בחינה מבוקרת של המנגנונים העצביים וההתנהגותיים העומדים בבסיס פגיעה בקול והחלמה ממנה, ובכך תומכת בביטחון חיזוי באישור יעדים בשלבים מוקדמים. התוצרים הכמותיים והשחזוריות של השיטה ממתגים אותה כנכס בעל ערך למחקר תרגומי ולסינון תיקי פיתוח במסלולי מחקר למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי קישור תוצאות התנהגותיות לתשתיות עצביות במודלים רלוונטיים למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של יעדים עבור התערבויות המכוונות להתאוששות סנסורי-מוטורית.
- מקל על בחינה מונחית-היפותזה של מנגנונים טיפוליים בהקשרי של מחלת הפרקינסון והזדקנות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק בדיקה התנהגותית סטנדרטית וכמותית להערכת התערבויות פוטנציאליות.
- מספק פרמטרים אקוסטיים הניתנים לשחזור (משך, תדר, אמפליטודה) לצורך השוואה בין מחקרים.
- מאפשר ניתוח קבוצתי בר-הרחבה ומדידה אוטומטית להכנה לסריקה בספיקה גבוהה (high-throughput screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מדדים קדם-קלینیים עם סמנים ביולוגיים תרגומיים של תפקוד קולי והחלמה עצבית.
- תומכת ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף קדם-קלینی במודלים של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
- מפחיתה סיכון תרגומי באמצעות מידול של פנוטיפים התנהגותיים מורכבים הרלוונטיים לליקויי תקשורת אנושיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין שלבי הגילוי לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מספקת מדד התנהגותי כמותי הרלוונטי למחלה לצורך תיקוף המטרה והערכת ההתערבות.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות על מנגנונים עצביים העומדים בבסיס גירעונות קוליים והחלמה.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור להערכת יעילות ההתערבות.
- אנליטיקה: מספקת מדידה אוטומטית של פרמטרים אקוסטים מרכזיים להשוואה סטטיסטית חסונה.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים פרה-קליניים לנקודות קצה קליניות בהפרעות תקשורת.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת להתאמה למודלים של מחלות מרובות וניתנת להרחבה ליישום בכל רחבי הפורטפוליו.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר נוירו-התנהגותי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות התנהגותיות ומאפשרת יצירת נתונים ניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומשפר את היעילות ההונית בשלבים מוקדמים של תהליכי הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום נכסים לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנוירוסיינס התנהגותי ובניתוח אקוסטי.
- נדרש מיכשור ייעודי להקלטה וניתוח של גלי אולטרסאונד.
- דורש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי אימון ומדידה בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה למודלים שונים של מכרסמים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור הקשרי מחלה חדשים.
- תלוי בבקרות סביבתיות וניסוייות עקביות לצורך שחזור התוצאות.
