שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבסס שיטה חדשנית לבדיקת יעילות תרופות באמצעות דגימות כירורגיות של גידולי מוח, המכונה שיטת tumor X explan. דבר זה מושג תחילה על ידי השגת דגימות כירורגיות טריות של глиומות ממאירות במהלך ניתוח לצורך ניסויים פרה-קליניים. לאחר מכן, הדגימות מועברות למתקן מרכזי לרכש רקמות כדי להפריד אותן למטרות אבחון קליני ומחקר.

לאחר מכן, במעבדה למחקר, נחתכים נתחי הגידול (tumor explants) למספר רקמות קטנות יותר ומועברים למצע אופטימלי. לבסוף, מבוצעות הזרקות תוך-גידוליים של תרופות מועמדות, והנתחים מדגרו למשך 16 שעות. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות החושפות את יעילות הטיפול באמצעות צביעת hematoxylin ו-eosin, וכן אימונוהיסטוכימיה עם סמנים ספציפיים לסוגי תאים.

ניתן להעריך את יעילות התרופה גם באופן in vitro באמצעות ציטומטריה של זרימה ובדיקות להיווצרות ספירות עצביות (neurospheres). רוב הבדיקות הנוכחיות ליעילות תרופתית מותירות פער בין יעילות התרופה במודלים הניסיוניים הפרה-קליניים הנוכחיים לבין היעילות בחולים. בפרט, כאשר אנו בוחנים מועמדים לתרופות בסרטנים מוצקים כגון גליומות ממאירות, אין להמעיט בחשיבותם של חילופי אותות בין-תאיים וכן תוך-תאיים.

על מנת למנוע פגיעה במיקרו-סביבה של גידולים מוצקים, ביססנו שיטת תרבית לגידולים שהוצאו מהגוף (tumor explant). לאחר הסרת הגידולים מהמטופלים, הדגימות מועברות מהמחלקה הפתולוגית או אליה. אנו מחלקים את נתחי הגידול לשני חלקים. דגימת גידול מחלק אחד משמשת לבדיקה של נתח קפוא ולהטמעה בפראפין לצורך אבחנה קלינית, ושאר רקמת הגידול נשלחת למעבדות המחקר לשימוש החוקרים.

באמצעות שיטה זו, ניתן לשמר את המיקרו-סביבה של הגידול יחד עם תאי אנדותל ותאי מערכת החיסון הסמוכים לגידול, וכן תאי מוח נורמליים המקיפים את הגידול או נודדים לתוך חללי הגידול. לפני עיבוד רקמת הגליובלסטומה, הכין תמיסת נוזל, מצע ותמיסת אגר. ערבב אותם ביחס של אחד ለአחד.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד לכל באר בלוחיות בעלות שש בארות. לאחר קבלת רקמת גליובלסטומה מולטיפורמיס טרייה, העבירו אותה לפיתרי באמצעות פינצטה ושטפו אותה בזהירות שלוש פעמים עם 5 ml של 1x PBS קר מאוד, בעזרת להב ניתוחי ופינצטה. חתכו חתכים סדרתיים בעובי של כ-10 מילימטרים מהדגימות שהופרדו כדי ליצור בלוקים של גידול, והעבירו כל בלוק לבאר אחת בלוח שש הבארות המכיל מצע אגר, תוך הבטחה כי תהיה לו חשיפה מספקת לאוויר כדי לשמור על חיוניותו.

בשלב הבא, באמצעות מזרק אינסולין של מיליליטר אחד ומחט במידה 28 ובאורך חצי אינץ', הזרק את גושי הגידול שלוש פעמים עם 5% DMSO, או עם 2.5 nanomolar temozolomide, או עם מועמד לתרופה אנטי-סרטנית חדשה, והדגרה למשך 16 שעות בטמפרטורה של 37 °C באוויר לח הכולל 5% carbon dioxide. לאחר ההדגרה, שטוף את הגושים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של 1× PBS. לאחר מכן, בתוך מבחנות של 50 מיליליטר, קבע את הגושים באמצעות 10 מיליליטר של 10% volume per volume פורמלין למשך 24 שעות.

יש להטמיע את הרקמה בפאראפין ולחתוך נתחים בעובי של ארבעה מיקרון לצורך דה-פאראפיניזציה ודהידרציה של הנתחים. יש להניח את השקופיות במעמד ולהדגיר אותן בתמיסות הבאות: במזילן שלוש פעמים, למשך חמש דקות בכל פעם.

100% ethanol שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. 95% ethanol פעם אחת למשך חמש דקות ו-70% ethanol פעם אחת למשך חמש דקות. לבסוף, שטיפה תחת מי ברז זורמים למשך שלוש דקות.

אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף לקבלת פרטים על שחזור אנטיגן ועיכוב פראוקסיד פנימי. כדי לחסום את החתכים, כסו את הרקמות ב-10% normal goat serum, העבירו את השקופיות לקופסת לחות והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-one times PBS למשך חמש דקות בכל פעם.

בשלב הבא, הוסיפו נוגדנים ראשוניים כגון caspase three ספציפי לאדם או KI 67 המדוללים ב-1× PBS, ולאחר מכן הדגרירו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, שטפו את השקופיות ב-1× PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר מכן, כסו את הרקמות בשתי עד שלוש טיפות של נוגדן משני המסומן ב-HRP.

הניחו את השקופיות בתיבת לחות והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו פעם אחת ב-PBS 3 פעמים למשך חמש דקות בכל פעם. פתחו את הדגימות באמצעות ערכת כרומוגן DAB לפי הוראות היצרן לצביעה נגדית.

טבול את הנסליות בהמטין למשך 10 עד 15 שניות. לאחר מכן, שטוף במים זורמים מהברז למשך שלוש דקות. ייבש את הדגימות על ידי טבילת הנסליות בתמיסות הבאות, ולאחר מכן השתמש בחומר עיגון ובזכוכית כיסוי.

לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לצלם את הפסליות. תמונת MRI בשיטות T1 עם הגברה בגדוליניום באיור זה מראה גידול גליובלסטומה מולטיפורמה (GBM) מוגבר באונה הפרונטלית הימנית של מטופל לפני הניתוח. התמונה לאחר הניתוח אישרה הסרה חלקית של הגשם לאחר הניתוח.

צביעת המטוקסילין ואאוזין מדגימה נוכחות של נמק, תאי פסאודו-פליסייד (pseudo palisade cells) ושגשוג מיקרו-וסקולרי. לפיכך, גידולי אלה אובחנו היסטופתולוגית כ-GBM כדי לבחון אם ניתן להשתמש בדגימות אקספלנט (explan) אלה של הגידול באופן מהימן. לצורך בדיקת יעילות תרופתית, בדקנו את השפעת התרופה טמוזולומיד (temozolomide) או TMZ; אימונוהיסטוכימיה של רקמות GBM שטופלו ב-TMZ מדגימה הפחתה משמעותית של תאי גידול חיוביים ל-KI 67 בהשוואה לדגימות הביקורת.

בתורם, אימונוהיסטוכימיה עם הסמן לאפופטוזיס caspase three לא הניבה הבדל משמעותי בין דגימות גליומה שטופלו ב-TMZ לבין דגימות הביקורת. ניתן לאפיין באופן נוסף את השפעת הטיפול בטמוזולומיד על ידי שילוב של בדיקת ex explan זו עם תרבית in vitro או עם ציטומטריית זרימה. ניתן להשוות שיטת ex explan זו להשתלה של קסנוגרפט ולבדיקת יצירת ספירות in vitro לצורך סריקת חומרים אנטי-סרטניים חדשים.

ברגע שמתקבלים רקמות הגידול במעבדה, ניתן להשלים את הפרוצדורה של ניסוי זה בתוך שעה אחת. בדיקה חדשה זו היא קלה יחסית לביצוע וניתנת לשחזור לאחר דיסוציאציה של שתלי גידול מטופלים. ניתן לשלב אותה עם ניסויי in vitro.

יתרון מרכזי של בדיקה זו הוא שהיא משמרת את הסביבה המיקרו-מגאלית של הגידול. השגנו נתונים חיוביים בגידולי explan שטופלו ב-Temodar, אשר היו עקביים עם התוצאות של אותם מטופלים שעברו טיפול ב-Temodar לאחר ניתוחים. לבסוף, שיטה זו ישימה לסרטני רקמה מוצקה אחרים, ולכן עשויה להחזיק בפוטנציאל להאיץ את זיהוין של חומרים כימותרפויטיים חדשים לטיפול בסרטן של רקמה מוצקה.