ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים פונקציה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע ניסוי אלקטרופורציה in vivo בעכברים יילודים על מנת להחדיר ביציבות חומר גנטי לתאי הרשתית. זה מושג על ידי הרדמה ראשונה, עכבר יילוד קופץ על קרח למשך כחמש עד 10 דקות. השלב השני של ההליך הוא זיהוי צומת העפעפיים המאוחים ופתיחת העין על ידי חיתוך לאורך צומת זה.

לאחר מכן מבצעים חתך בעין כדי להקל על החדרת מזרק המיקרו-הזרקה. לאחר מכן מוחדר מזרק המיקרו הזרקה דרך החתך ותמיסת ה-DNA מוזרקת לחלל התת-רשתית. לבסוף, אלקטרודת פינצטה מונחת על ראשו של הפופ ומועברת סדרה של פולסים חשמליים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון התמרה רטרו-ויראלית, הוא שאלקטרופורציה in vivo אינה דורשת ייצור וטיפול בחומרים ביולוגיים ככלים להעברת גנים. כתוצאה מכך, הטכניקה דורשת פחות עבודה, פחות ריאגנטים, וניתן לבצע אותה בכל תחנת עבודה מאושרת להליכים בבעלי חיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה יתקשו מכיוון שלוקח זמן וחזרה לפתח תחושה למיקום מזרק המיקרו-הזרקה לחלל התת-רשתית.

מי שידגים את ההליך יהיה ג'ימי דה-מילו, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. מכיוון שריכוז ה-DNA הנדרש לאלקטרופורציה גבוה יחסית, ה-DNA של הפלסמיד הרצוי מוגבר תחילה תאים לא מוכשרים המופקים באמצעות הכנת מקסי, ולאחר מכן מטוהרים ומרוכזים לכחמישה מיקרוגרם למיקרוליטר. צבע FCF ירוק מהיר מתווסף כעוקב הזרקה.

לאחר הכנת ה-DNA של הפלסמיד, הרדימו גורי עכברים שזה עתה נולדו על קרח למשך כחמש דקות, וניטרו אותם עד לאישור איבוד ההכרה על ידי דחיסת כרית כף הרגל. החלף את אזור העין להזרקה עם אלכוהול בפרופיל איזופ 70%, והשתמש במיקרוסקופ מנתח כדי לזהות את אפיתל הצומת FUS שבו העפעפיים מתאחדים. בעזרת מחט חדה בקוטר 30, פתחו את העין בזהירות על ידי חיתוך לאורך אפיתל הצומת המאוחה מבלי להפעיל לחץ מוגזם כלפי מטה או לחתוך מעבר לטווח העפעף.

לאחר פתיחת העפעף וחשיפת העפעף, השתמש בקצה המחט כדי לבצע חתך קטן בסקלרה ליד הצומת כאשר הקרנית נזהרת לא לחדור עמוק מדי ולנקב את העדשה. הכנס את מחט ההזרקה הקהה לתוך החתך. רק עד שמורגשת ההתנגדות של דופן הסקלר הנגדית, הזרקו לאט לאט 0.3 מיקרוליטר מתמיסת ה-DNA הצמיגה לחלל התת-רשתית.

היזהרו לא ללחוץ חזק מדי על דופן הסקלרל, סובבו את החיה כדי לבדוק אם יש התפשטות אחידה של תמיסת ה-DNA בתוך הרשתית. ראשית, השרו את אלקטרודת הפינצטה ב-PBS כדי למקסם את המוליכות החשמלית. לאחר מכן הנח את ראשו של הגור המוזרק בין האלקטרודות כשהעין המוזרקת צמודה לאלקטרודת הקוטב החיובי והעין הלא מוזרקת צמודה לאלקטרודת הקוטב השלילי.

החל חמישה פולסים מרובעים באמצעות מחולל פולסים כאשר כל פולס הוא 80 וולט ומשך של 50 אלפיות השנייה עם מרווח של 950 מילישניות בין פולסים. לבסוף מחממים את הגורים מתחת למנורת חימום עד שהם מתאוששים מהרדמת הקרח. לאחר ההתאוששות, החזירו את הגורים החשמליים לאמם ביום השלישי לאחר הלידה.

רוב התאים החשמליים של EGFP יושבים בשכבה הנוירופלסטית של הרשתית ואינם מפגינים מאפיינים מורפולוגיים מובהקים של אף אחד מתאי הגליה העצביים המובחנים של הרשתית. ביום ה-14 שלאחר הלידה, ניתן למצוא תאים אלקטרופורטיים בשכבה הגרעינית החיצונית ובשכבה הגרעינית הפנימית של הרשתית ובתאים המסומנים השונים. כעת מציגים סימני היכר מורפולוגיים אופייניים של נוירונים מובחנים.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לבצע את כל השלבים בצורה חלקה ואחידה. קל מאוד לפגוע ברשתית במהלך המיקרו-הזרקה, ושיטות הנדרשות כדי לפתח את המיומנות הידנית הדרושה כדי למנוע נזק לרקמות. בצע הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתרה על מנת לקבוע אם ביטוי הגנים המעניינים מווסת למעלה או למטה ברשתית האלקטרו