Name: GABA המופעל זרמים ערוץ בודד וטוניק פרוסות המוח עכברוש (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-17T14:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: למד כיצד לרשום זרמים ערוץ בודד המופעלים על ידי GABA בפרוסות מוח עכברוש באמצעות טכניקת patch-clamp. שיטה זו מאפשרת הבחנה בין ערוצי GABAA סינפטיים ואקסטראסינפטיים ומסייעת לחקר מוליכות עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר השוודי, אופסלה ואת פרדריק ואינגריד Thurings קרן. ZJ קיימה המלגה הבתר מ EXODIAB ו Svenska Sällskapet עבור Medicinsk Forskning. אנו מודים פרנק לי לסיוע טכניקה.

<ol><li>Pavlov, I., Savtchenko, L. P., Kullmann, D. M., Semyanov, A., Walker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outwardly+rectifying+tonically+active+GABAA+receptors+in+pyramidal+cells+modulate+neuronal+offset%2C+not+gain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Outwardly rectifying tonically active GABAA receptors in pyramidal cells modulate neuronal offset, not gain.</a> J Neurosci. 29, 15341-15350 (2009).</li>
<li>Chao, H. T., Chen, H., Samaco, R. C., Xue, M., Chahrour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+in+GABA+signalling+mediates+autism-like+stereotypies+and+Rett+syndrome+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dysfunction in GABA signalling mediates autism-like stereotypies and Rett syndrome phenotypes.</a> Nature. 468, 263-269 (2010).</li>
<li>Clarkson, A. N., Huang, B. S., Macisaac, S. E., Mody, I., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+excessive+GABA-mediated+tonic+inhibition+promotes+functional+recovery+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reducing excessive GABA-mediated tonic inhibition promotes functional recovery after stroke.</a> Nature. 468, 305-309 (2010).</li>
<li>Jin, Z., Jin, Y., Mendu, K. M., Degerman, E., Groop, L., Birnir, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+reduces+neuronal+excitability+by+turning+on+GABA%28A%29+channels+that+generate+tonic+current%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Insulin reduces neuronal excitability by turning on GABA(A) channels that generate tonic current.</a> Plos One. 6, e16188-e16188 (2011).</li>
<li>Nusser, Z., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+modulation+of+tonic+and+phasic+inhibitions+in+dentate+gyrus+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Selective modulation of tonic and phasic inhibitions in dentate gyrus granule cells.</a> J Neurophysiol. 87, 2624-2628 (2002).</li>
<li>Semyanov, A., Walker, M. C., Kullmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+uptake+regulates+cortical+excitability+via+cell+type-specific+tonic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA uptake regulates cortical excitability via cell type-specific tonic inhibition.</a> Nat Neurosci. 6, 484-490 (2003).</li>
<li>Birnir, B., Korpi, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+sub-cellular+location+and+intracellular+neuronal+proteins+on+properties+of+GABA%28A%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">The impact of sub-cellular location and intracellular neuronal proteins on properties of GABA(A) receptors.</a> Curr Pharm Des. 13, 3169-3177 (2007).</li>
<li>Olsen, R. W., Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Union+of+Pharmacology.+LXX.+Subtypes+of+gamma-aminobutyric+acid%28A%29+receptors%3A+classification+on+the+basis+of+subunit+composition%2C+pharmacology%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Update.+Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International Union of Pharmacology. LXX. Subtypes of gamma-aminobutyric acid(A) receptors: classification on the basis of subunit composition, pharmacology, and function.</a> Update. Pharmacol Rev. 60, 243-260 (2008).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22The+Single-Channel+Recording%22">The Single-Channel Recording</a>. , 2 ed., Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Zilberter, Y., Zilberter, T., Bregestovski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+in+vitro+and+the+in+vivo+reality%3A+the+role+of+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity in vitro and the in vivo reality: the role of energy homeostasis.</a> Trends Pharmacol Sci. 31, 394-401 (2010).</li>
<li>Spruston, N., McBain, C. Structural and functional properties of hippocampal neurons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpruston%2C+N+%22The+Hippocampus+Book%22">The Hippocampus Book</a>. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'keefe, O. , Oxford University Press. Oxford. (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Hippocampus+Book%22">The Hippocampus Book</a>. Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'keefe, O. , Oxford University Press. Oxford. (2007).</li>
<li>Eghbali, M., Curmi, J. P., Birnir, B., Gage, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+GABA%28A%29+channel+conductance+increased+by+diazepam%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal GABA(A) channel conductance increased by diazepam.</a> Nature. 388, 71-75 (1997).</li>
<li>Lindquist, C. E., Birnir, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graded+response+to+GABA+by+native+extrasynaptic+GABA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Graded response to GABA by native extrasynaptic GABA receptors.</a> J Neurochem. 97, 1349-1356 (2006).</li>
<li>Birnir, B., Eghbali, M., Cox, G. B., Gage, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+concentration+sets+the+conductance+of+delayed+GABAA+channels+in+outside-out+patches+from+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">GABA concentration sets the conductance of delayed GABAA channels in outside-out patches from rat hippocampal neurons.</a> J Membr Biol. 181, 171-183 (2001).</li>
<li>Birnir, B., Eghbali, M., Everitt, A. B., Gage, P. W. B. icuculline <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pentobarbital+and+diazepam+modulate+spontaneous+GABA%28A%29+channels+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">pentobarbital and diazepam modulate spontaneous GABA(A) channels in rat hippocampal neurons.</a> Br J Pharmacol. 131, 695-704 (2000).</li>
<li>Birnir, B., Everitt, A. B., Gage, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+GABAA+channels+in+rat+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of GABAA channels in rat dentate gyrus.</a> J Membr Biol. 142, 93-102 (1994).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הנוכחי כל תא מייצג את ההרכב של זרמים שנוצר על ידי ערוצי פעיל בתא. פרמקולוגיה ספציפיים חדירות כלוריד של ערוצי GABAA מאפשר לזהות זרמים הקשורים הערוצים הללו. האופי הזמני של הפעלת ערוצי הסינפטי לבין הפעלת טוניק של ערוצי extrasynaptic מאפשר הבחנה קלה בין שתי אוכלוסיות של ערוצי GABAA לידי ביטוי נוירון. עם זאת, רק עם ערוץ יחיד הקלטות אחד יכול ללמוד את המאפיינים הקינטית של מולקולות ערוץ שיוצרים את הזרמים טוניק. בניגוד ערוצי הסינפטי להפעיל בתוך 100 μs, GABAA ערוצי טוניק מופעלים עם חביון בטווח של דקות מרגע GABA מוחל 4,7,15,16,17,18. הפעלה זו עיכבה את תוצאות ערוצים כי המאפיינים ערוץ רבות לא ניתן ללמוד באמצעות כל תא הקלטות. ברמה ערוץ יחיד שונים תת אוכלוסיות של ערוצי GABAA ניתן לזהות על בסיס משתנים מאפיינים פונקציונליים תרופתי. לכן, על ידי נטילת יתרון של מה שונה תיקון-clamp תצורות יש להציע, אפשר ללמוד בפירוט את הפונקציה פרמקולוגיה מולקולרית של GABA המופעל ערוצי שיוצרים את הזרמים טוניק ו סינפטיים של נוירונים.

חומרה כמה תיקון-clamp ומערכות תוכנה זמינים והם פועלים באמצעות העקרונות הבסיסיים זהים. במעבדה שלנו אנו משתמשים מגברים Axoclamp והתוכנה PClamp (התקנים מולקולריים, ארה&quot;ב) כדי להקליט ולנתח הניסויים שלנו. עוד מותג פופולרי מגברים HEKA ותוכנה (HEKA Elektronik, גרמניה) Microforge: Narishige MF-830 (יפן); Vibrotome: למשל לייקה VT1200S (גרמניה) או Campden מכשירים vibrotome (בריטניה); מיקרוסקופ: Nikon Eclipse E600FN; אמבט מים; Micromanipulators: בהתאמה אישית ו micromanipulators Narishige (יפן); פולר: DMZ- אוניברסלי (גרמניה) או Narishige PC-10 (יפן). זכוכית אלקטרודה: GC150F-15 (הרווארד Apparatus, בריטניה).

gaba המופעל זרמים ערוץ בודד וטוניק פרוסות המוח עכברוש

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

ערוצי GABA נמצאים הנוירונים כל ממוקמים הן הסינפסות מחוץ סינפסות שבו הם יוצרים זרמים phasic טוניק, בהתאמה 4,5,6,7 ערוץ GABA הוא ערוץ pentameric GABA-מגודרת כלוריד. יחידות משנה ערוץ מקובצים 8 משפחות (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, ו π ρ). שני אלפא, שני betas אחד למקטע 3 rd בצורה פונקציונלית ערוץ 8. על ידי שילוב של מחקרים תת סוג מסוים GABA המופעל ערוץ אחד עם מחקרים מולקולות כולל כל האוכלוסיות של GABA ערוצים הנוירון ניתן יהיה להבין את המנגנון הבסיסי של דיכוי עצבי וכיצד היא מווסתת על ידי סוכני תרופתי. אנו משתמשים בטכניקה תיקון-clamp 9,10 ללמוד את המאפיינים של פונקציונלי ערוצי GABA בנוירונים בחיים פרוסות המוח בהיפוקמפוס ולהקליט ערוץ אחד ועל כל תא זרמים. בנוסף, אנו בוחנים כיצד הערוצים מושפעים ריכוזי GABA שונים, תרופות אחרות וגורמים התוך תאית ו. לתיאור תיאורטי ומעשי מפורט של שיטת התיקון, מהדק עיין יחיד ערוץ הקלטות בעריכת Sakman B ו-E נהר 10.

אנו משתמשים בטכניקה תיקון-clamp למדוד GABA המופעל יחיד ערוץ זרמים (GABAA ערוצים, קולטנים GABAA) לבין זרמים סינפטיים טוניק שהם מייצרים בנוירונים. הפעלת ערוצי פוחתת רגישות עצבית בבריאות ומחלות<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;.

GABA המופעל זרמים ערוץ בודד וטוניק פרוסות המוח עכברוש

תעלות $\text{GABA}_{\text{A}}$ נוכחות בכל הנוירונים וממוקמות הן בסינפסות והן מחוץ לסינפסות, שם הן מייצרות זרמים פאזיים וטוניים, ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להקליט זרמי GABA מופעלים הנוצרים על ידי מולקולות בודדות, זרם של תעלה בודדת, ועל ידי אוכלוסיות ספציפיות של תעלות הממוקמות בסינפסות או מחוץ לסינפסות. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת פרוסות ממוח של חולדה מההיפוקמפוס והכנת פיפטות לשימוש ב-patch clamping. כשלב שני, פיפטה מחוברת לממברנה הנוירונלית.לאחר יצירת giga seal, מתקבלת קונפיגורציית patch clamp של תא צמוד. לאחר מכן, יש להפעיל יניקה על הפיפטה. ברגע שהיא פורצת אל תוך התא, מתבססת קונפיגורציית whole cell patch clamp.התוצאות המתקבלות מאפשרות להבחין בין ערוצי gabaa סינפטיים לערוצים חוץ-סינפטיים. היתרון המרכזי של טכניקת ה-patch clamp לעומת שיטות קיימות כמו emit הוא היכולת לחקור את התכונות התפקודיות של הערוצים. שיטת ה-patch clamp יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון הגורמים הקובעים את העבירות של נוירונים וכיצד היא מווסתת ומכווננת.להשלכות של טכנולוגיה זו יש השפעה על הטיפול והאבחון של מחלות רבות, מכיוון שכל תא חי תלוי בתפקוד תקין של תעלות יונים לצורך הישרדותו ותפקודו התאי המיוחד. את הפרוצדורה ידגימו giant, עמית פוסט-דוקטורט במעבדה, ו-young yin, סטודנט לתואר מתקדם במעבדה. כדי להתחיל בפרוצדורה, יש להקריב חולדה מסוג Wistar בת 16 עד 22 ימים לאחר הלידה באמצעות עקיפת ראש ולהוציא במהירות את המוח בעזרת שפכטל. חתכו את המוח לאורך קו האמצע בעזרת להב כירורגי.בשלב הבא, הניחו כל המיספרה על נייר סינון Watman כאשר הצד החתוך פונה כלפי מטה אל הנייר. טפטפו טיפה של דבק מהיר (super glue) על דיסק הדגימה והניחו את ההמיספרה מעליו כאשר הצד החתוך פונה כלפי מטה. לאחר מכן, הניחו את דיסק הדגימה בתא החיתוך של הוויברטור (vibrator) הממולא בקרח קר.נוזל חוט השדרה (CSF). הגדירו את עובי הפרוסה ל-400 micrometers והתחילו בחיתוך המוח. חתכו בערך שני מילימטרים של רקמת מוח עד להגעה להיפוקמפוס.בשלב הבא, העבירו את פרוסות ההיפוקמפוס לצלחת פטרי מזכוכית המלאה ב-CSF. הצלחת מונחת על רקע שחור כדי לאפשר ויזואליזציה קלה של ההיפוקמפוס. השלב הבא הוא בידוד ההיפוקמפוס מהרקמה שסביבו באמצעות להב כירורגי חד.הקפידו שלא לדחוף או למשוך את הרקמה לאחר מכן. דגרו את הפרוסות ואת תמיסת ה-A CSF בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת, ולאחר מכן שמרו אותן בטמפרטורת החדר עד לסיום הניסויים. קפילריות זכוכית בורוסיליקט משמשות עבור פיפטות ה-patch.משכו את פיפטות ה-patch באמצעות שובך פיפטות אוטומטי או ידני, כך שתתקבל התנגדות של שני עד ארבעה mega ohms עבור הקלטות תא שלם (whole cell), או שמונה עד 20 mega ohms עבור הקלטות של תעלה בודדת (single channel). ליטשו את הפיפטה מאותו זכוכית בורוסיליקט עבור הקלטת תעלה בודדת. השתמשו במיקרו-פורג' (micro forge) כדי להמיס את זכוכית הבורוסיליקט על תיל הפלטינה כדי להחליק את הקצה.ליטוש הפפיטות בדרך זו יוצר פפיטות המגבשות אטמים יציבים ועמידים יותר בהשוואה לפפיטות שלוטשו על ידי חום מחוט לא מצופה או על ידי שלב ליטוש במכשיר המתיחה האוטומטי. ציוד ה-patch clamp מורכב ממיקרוסקופ על שולחן צף וסגור בתוך כלוב פאראדיי, מגבר, דיגיטייזר ומחשב. יחד, ציוד זה מכונה לעיתים קרובות rig של patch clamp.כעת הכניסו פיפט למחזיק הפיפטים והדקו את המכסה כדי לקבע את הפיפט. להפעלת ה-patch clamping השתמשו בתוכנת P clamp. הגדירו את המגבר OC clamp amplifier 200 B למצב V clamp, הגברה (gain) של 2, מסנן ל-2 kHz ופוטנציאל החזקה של 0 mV; כדי ליצור לחץ חיובי בפיפט, נשפו אוויר לתוך פיית הנשיפה המחוברת לצינור המחובר למחזיק הפיפטים.לאחר מכן, סגרו את השסתום שבין פיית הפקילה לצינור. ודאו שאין דליפת אוויר. בשלב הבא, הנמיקו את הפפיטה אל תוך תמיסת האמבט.במסך המחשב שבו נמדדת התנגדות הפיפטה, תראו פולס שנוצר על ידי רצף פולסים של five millivolt ומספר המציין את התנגדות הפיפטה. מספרים קטנים יותר מייצגים פתחי קצה רחבים יותר של הפיפטה ופיפטות גדולות יותר. כווננו את ה-offset של הפיפטה במגבר לאפס.השתמשו בהגדלה של 10x במיקרוסקופ כדי לזהות את האזור, או בהגדלה של 60x. כדי לזהות נוירון פארא-מטאלי (parametal neuron) שאתם עומדים לבצע לו פאץ' (patch) בתוך פרוסות ההיפוקמפוס, תאי הגרנול של ה-dentate gyrus, אזור גוף התא הפארא-מטאלי של CA1 ואזור גוף התא הפארא-מטאלי של CA3 מופיעים כל אחד כפס בהיר. התאימו את המיקוד של הפ pipette כך שתוכלו לראות הן את האזור או התא והן את ה-pipette.בעת ההסתכלות דרך העיניות של המיקרוסקופ, מקמו את הפיפט מעל מרכז האזור באמצעות הגדרות תנועה גסה של המניפולטור, והורידו את הפיפט עד שיהיה ממש מעל הרקמה, אך ללא מגע בה. בשלב זה, הורידו את הפיפט בעדינות רבה אל מרכז התא או האזור באמצעות הגדרות תנועה עדינה של המניפולטור. במקביל, עקבו אחר מסך המחשב כדי לנטר את התנגדות הפיפט.המשיכו להוריד את הפיפטה עד שההתנגדות של הפיפטה תגבר. שחררו את הלחץ החיובי מהפיפטה על ידי פתיחת השסתום. פעולה זו יוצרת יניקה עדינה ומבצעת באופן אוטומטי את ה-giga seal.אם לא נוצר giga seal, החיל את השאיבה (suction) בפתח הפיה שבו החלת קודם לכן לחץ חיובי. כעת השגת את התצורה המכונה cell attached patch clamp. כוון את פיצוי הקיבול (capacitance compensation) המהיר והאיטי כדי לבטל את ה-transient המגיע מהפיפט וממתקן הפיפט.על מסך המחשב תראו עקבה שטוחה של זרם. ככל שערך ה-GigE גבוה יותר, כך יחס אות לרעש טוב יותר תשיגו בהקלטות של ערוץ בודד, לצורך הקלטת זרמי ערוץ בודד בתצורת patch clamp של תא צמוד (cell attached). הגדירו את ההגבר (gain) ל-500 ואת קצב דגימת הנתונים ללא פחות מ-100 microseconds.לאחר מכן רשמו את זרמי החשמל. שמרו על נפח נמוך של תמיסת האמבט כך שתכסה בקושי את הפרוסה, וזאת כדי למזער את הרעשים בהקלטות לצורך ביצוע הקלטה של תא שלם (whole cell recording). שנו את פוטנציאל הפ pipette ל-60- millivolts או לערך הקרוב לפוטנציאל הממברנה במצב מנוחה.בתצורת תא מחובר (cell attached), הפעל שאיבה לפיפט באמצעות הצינור המחובר למחזיק הפיפט. במקביל, עקוב אחר השינויים בהתנגדות ובטרנזיינט של הקיבול (capacitance transient) על מסך המחשב. המשך כך עד לפריצה אל תוך התא.כאשר הדבר קורה, אתם נמצאים בתצורה המכונה "תא שלם" (whole cell configuration) או במצב "תא שלם". אפשרו לתמיסת הפיפט להגיע לשיווי משקל עם פנים התא במשך 5 עד 10 דקות. בינתיים, עקבו אחר ערך התנגדות הטור (series resistance).הזרם מובל על ידי אוכלוסיות של תעלות פתוחות בקרומי התא. כדי להדגים תעלות בודדות המופעלות על ידי GABA, מוסיפים GABA לתמיסה שבתוך הפפיטה כיוון שאינו יכול לחצות את קרומי התא. מוצגים כאן זרמי תעלות בודדות שהופעלו על ידי ריכוז GABA של 20 nanomolar ב-cell attached patch של נוירון גרנולר ב-dentate gyrus.הטלאי (patch) עבר דפולריזציה של 40 millivolts. המוליכות המקסימלית של התעלה הייתה 44 Picos semens וזמן השיהוי להפעלה היה 2.63 minutes. להלן דוגמה לאופן שבו ניתן להבדיל בין זרמי GABA סינפטיים מופעלים לזרמים אקסטרה-סינפטיים על פי האופי הפאזי והטוני של הזרמים.זרם דרך אוכלוסיות של תעלות נמדד מנוירונים של היפוקמפוס של חולדה באמצעות שיטת voltage clamp של תא שלם כדי לזהות זרמים טוניים ופאזיים. 100 µM של האנטגוניסט ל-gabaa, SR 9 55 31, הוחלו על נוירון מה-dentate gyrus כפי שמוצג ב-BA ועל נוירון מה-ca. One parametal שטופל באינסולין כפי שמוצג ב-BB. SR 9 55 31 חסם את התעלות החוץ-סינפטיות והשרה הסטה בזרם הבסיס, ובכך חשף את הזרם הטוני.לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשיג cell attached patch ולאחר מכן לפרוץ אל תוך התא כדי לבסס whole cell patch בתוך שתי דקות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע patch לרקמות אחרות, כגון איים לבלביים שלמים (pancreatic eyelets), או לתאים מבודדים כגון לימפוציטים או תאים בתרבית.

gaba-activated-single-channel-and-tonic-currents-in-rat-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

דו"ח זה מדגים טכניקה בידוד מכני של נוירונים בודדים קיימא שמירה boutons presynaptic המצורפת. נוירונים Vibrodissociated יש את היתרונות של ייצור מהיר, שליטה מעולה תרופתי ושיפור חלל מהדק ללא השפעה של תאים שכנים. שיטה זו יכולה לשמש עבור הדמיה של אלמנטים הסינפטי ו-clamp תיקון ההקלטה.

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

סרטון זה מדגים את ההקלטה של זרמים שלמים בתאים המושרים על ידי חומצה גמא-אמינובוטירית, או GABA, בפרוסת מוח קליפת המוח הקדם-מצחית של עכבר. העברה מבוקרת של GABA פותחת תעלות כלוריד בנוירון פוסט-סינפטי, ויוצרת זרמים פוסט-סינפטיים מעכבים, או IPSCs. IPSCs אלה גדלים עם ריכוזי GABA גבוהים יותר, המשקפים את הפעילות המעכבת של GABA על שידור סינפטי.

הקלטת זרמים של תאים שלמים עם התנשפות GABA בפרוסת מוח של עכבר

סרטון זה מדגים הליך לניתוח קישוריות סינפטית בין קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) לבין נוירוני אמיגדלה באמצעות פרוסות מוח אמיגדלה חריפות מעכברים. תאי העצב קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית בעכברים אלה מבטאים צ'נלרודופסין שהתמזג עם חלבון פלואורסצנטי. הצ'אנלרודופינים מאפשרים זרימת יונים ויצירת פוטנציאל פעולה בנוירונים קליפתיים קדם-מצחית קדם-מצחית האמצעית עם הפעלת האור. כתוצאה מכך, נוירוני קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית משחררים מוליכים עצביים שנקשרים לנוירוני אמיגדלה פוסט-סינפטיים, ומפעילים זרמים...

הדמיה ומיפוי של מסלולים עצביים בפרוסת מוח של אמיגדלה

סרטון זה מדגים את ההליך לחקר יעילות סינפטית בקליפת המוח האנטורינלית הצידית (LEC) על-ידי גירוי אופטוגנטי של אקסונים של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית (mPFC) ורישום התגובות של נוירונים פירמידליים ב-LEC. שיטה זו משלבת הקלטות מהדק טלאי עם הפעלה סינפטית על ידי גירוי אור כדי לחקור פלסטיות סינפטית.

גירוי אופטוגנטי ורישום אלקטרופיזיולוגי של אירועים סינפטיים בפרוסות מוח של חולדות

רשתות קליפת המוח נשלטות על ידי קבוצה קטנה, אך מגוונת של interneurons המעכב. חקירה פונקציונלית של interneurons לכן דורשת הקלטה ממוקדת וזיהוי קפדני. שתואר כאן היא גישה משולבת הכוללת כל תא הקלטות מזוגות בודדים או synaptically מצמידים של נוירונים עם תיוג תאיים, שלאחר הוק מורפולוגיים וניתוח immunocytochemical.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

תנודות הן מאפייני רשת בסיסיים והם מווסתים על ידי מחלה ותרופות. לומד תנודות המוח פרוסה מאפשר אפיון של רשתות מבודדות בתנאים מבוקרים. פרוטוקולים ניתנים להכנת פרוסות מוח חריפות ללעורר תנודות γ CA1.

דור של תנודות γ CA1 מקומיות על ידי גירוי Tetanic

אנו מתארים את הטכניקה פאף, שלפיו ריאגנטים תרופתי יכול להינתן במהלך ההקלטה תאים כל תיקון-קלאמפ, להאיר היבטים שונים של תכונות חיוניות להצלחתו.

זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של GABA במוח פרוסות

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגלות תרכובות פעיל קולטני GABAA , מן הכריכה פיזיולוגיה, פרמקולוגיה.

שיטות הגילוי של תרכובות הרומן להתכוונן קולטן גאמא אמינו בוטירית הקלד עצבית

מודלים התקף אקוטי חשובים ללמוד המנגנונים אפילפטית אירועים. יתר על כן, היכולת להפיק אפילפטית אירועים לפי-דרישה מספק שיטה יעילה במיוחד ללמוד רצף האירועים שבבסיס בהכנסתם המדויק. כאן, אנו מתארים את הדגמים פרכוס קורטיקלית פמפרידין חריפה נוסדה בשנת רקמה אנושית של עכבר.

חניכה הדור, על פי דרישה חריפה פעילות התקפי. מכרסם, רקמה אנושית

ניתן להשתמש בפרוסות מוח Ex vivo כדי לחקור את ההשפעות של חומרי הרדמה נדיפים על תגובות מעוררות לתשומות אפרינטיות. אופטוגנטיקה משמשת להפעלה עצמאית של אפרנטים תלמוקורטיים וקורטיקוקורטיקליים לניאוקורטקס שאינו ראשוני, ותגובות סינפטיות ורשתיות מווסתות עם איזופלורן.

הפעלה אופטוגנטית של מסלולים אפרנטיים בפרוסות מוח וויסות תגובות על ידי הרדמה נדיפה

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול שיטתי כדי להשיג פרוסות מוח היפוקמפוס אופקי בעכברים. מטרת מתודולוגיה זו היא לשמר את השלמות של מסלולי סיבים בהיפוקמפוס, כגון הנתיב המחורר ודרכי הסיבים הטחובים להערכת תהליכים נוירולוגיים הקשורים לgyrus.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

למד כיצד לרשום זרמים ערוץ בודד המופעלים על ידי GABA בפרוסות מוח עכברוש באמצעות טכניקת patch-clamp. שיטה זו מאפשרת הבחנה בין ערוצי GABAA סינפטיים ואקסטראסינפטיים ומסייעת לחקר מוליכות עצבית.

GABA המופעל זרמים ערוץ בודד וטוניק פרוסות המוח עכברוש

גלה סרטונים נוספים