Name: Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: למדו שיטה להדמיית חיידקים חיים באמצעות מיקרוסקופית כוח אטומי בסביבה נוזלית. השיטה משתמשת במיקה מצופה ג'לטין לקיבוע החיידקים ומאפשרת תמונות ברזולוציה גבוהה ללא טיפול כימי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה ממומן על ידי משרד המחקר הביולוגיים הסביבה, משרד האנרגיה של ארה&quot;ב ועל ידי מענק למימון ממועצת העמים של וירג&#39;יניה לחקר בריאות. Oak Ridge National Laboratory מנוהלת על ידי UT-באטל, LLC, עבור משרד האנרגיה של ארה&quot;ב תחת חוזה מס &#39;DE-AC05-00OR22725.

1. מיכה הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את מיקה (מדעי אלקטרונים מיקרוסקופית) עם מספריים לגודל הדרוש כדי להתאים את מיקרוסקופ AFM (בערך 22 × 30 מ"מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליב מיקה בשני הצדדים, בדרך כלל באמצעות קלטת כדי להסיר את השכבה החיצונית, עד שרק שכבות רצוף וחלק נשארים. </li></ol> 2. הכנת פתרון ג'לטין: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ"ל מים מזוקקים כדי בקבוק מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הבקבוק במיקרוגל עד שהמים מתחילים לרתוח. (אם במיקרוגל אינו זמין, המים ניתן לחמם בכוס על פלטה חשמלית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 0.5 גרם של ג'לטין (Sigma-G-6144, G-2625 או G-2500), ולהוסיף למים מזוקקים חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הבקבוק בעדינות עד הג'לטין נמס לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב הפתרון ג'לטין על 60-70 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 15 מ"ל לתוך כוס קטנה (20 מ"ל) שלתוכו מיקה לחתוך ביקע יכול להיות טבול. </li></ol> 3. מיכה ציפוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הריבועים נציץ לתוך הפתרון ג'לטין חימם ולסגת כזה מהר כי מיקה היא מצופה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי, לתמוך מיקה מיד, על קצה, על מגבת נייר לייבוש באוויר הסביבה (איור 1b). נציץ מצופה ג'לטין יכול לשמש לפחות 2 שבועות. הפתרון ג'לטין עודף יכולים להישמר בקירור בשימוש במשך חודש בערך, פשוט על ידי reheating הפתרון המניות בין 60-70 ° C. יש להקפיד על מנת להבטיח כי ג'לטין אינו מבושל במהלך reheating. </li></ol> 4. הרכבה חיידקים על נציץ מצופה ג'לטין: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה 1 מ"ל של התרבות חיידקים (0.5-1.0 OD ב 600 ננומטר) בשעה RCF 800 עד 4500. בהתאם חיידקים, השתמש RCF המינימום גלולה יהיה התאים ~ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את גלולה בהיקף זהה של מים מסוננים או deionized חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים שוב על ידי צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור מיד ב 500 μL מים deionized חיץ nanopure או. (השעיה חיידקי צריך להיות עכור בעליל כדי שיהיה ריכוז מספקת של תאים עבור הדמיה AFM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את ההשעיה תא (10-20 μL) כדי מיקה ג'לטין מצופה ולהתפשט על פני השטח באמצעות קצה פיפטה (איור 1 ג'). יש להקפיד לא לגעת פיזית את פני השטח ג'לטין עם קצה פיפטה תוך יישום או להפיץ את פתרון חיידקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר המשטח לנוח למשך 10 דקות ולשטוף עם זרם מים או חיץ (איור 1 cd). לאורך כל ההליך, דואגים להבטיח כי המדגם אינו רשאי יבש. </li></ol> 5. נציג תוצאות: תרשים 2 מציג תמונות דוגמה תאים חיידקיים כי כבר רכוב על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה על ידי AFM. במעבדות שלנו, דגימות הם צילמו בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי PicoPlus (Agilent Technologies, בית המקדש, AZ) לבוש עם ראש מיקרומטר 100 סריקה. המכשיר מופעל על 128-512 פיקסלים לכל לסרוק קו במהירות סריקה של 0.5-1.0 קווי / s. Cantilevers המשמשים בדרך כלל הם Veeco בדיקות סיליקון ניטריד (MLCT-AUHW, Veeco, סנטה ברברה, קליפורניה) עם קבועי קפיץ הנומינלי החל 0.01-0.1 NN / ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. לטין בטמפרטורה של 60-70 מעלות צלזיוס ממוקם כוס 20 מ"ל. בעזרת פינצטה טרי ביקע ריבועים מיקה שקועים לגמרי לתוך הג'לטין (א) מכונס העמידו על מגבת נייר נשען על מדף צנטריפוגות מיקרו (ב). אגל של המדגם חיידקי מושם על מיקה ושל התפשטות עם טיפ pipet הן X ו Y כיוונים (ג). לאחר המאפשר המדגם כדי לדגור על פני השטח מיקה לפחות 10 דקות, לשטוף את המדגם בזרם של מים מזוקקים. אם immobilization עבדו תוכל לראות את המקום אטום על מיקה כפי שמוצג בלוח השמאלי של (ד). אם immobilization לא לעבוד תקבלו חתיכת ברורה של מיקה כמו בלוח השמאלי. הנקודה אטום על המאזניים מיקה ריכוז של חיידקים בתוך אגל לך מקום על מיקה התייחסו ג'לטין. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור AFM תמונות של א coli. בלוח (א), התאים הם רכובים על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה ב 0.005 M-PBS. לשם השוואה, דימוי של תאים חיידקיים רכוב על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה באוויר מוצג בלוח (ב). למרות septa הם בבירור בתמונה שנאספו נוזלי, ברזולוציה גדולה יותר, כפי שצוין על ידי נוכחות של פילי (פאנל הבלעה (ב)), ניתן להשיג באוויר.

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
<li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li>
<li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li>
<li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+%28Muller%29+cells%3A+sensing+and+responding+to+tissue+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li>
<li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair%3A+Surgical+Applications%2C+State+of+the+Art%2C+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
<li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons%3A+continuous+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+patterns%3A+The+mechanics+of+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%2C+Third+Growth+Symposium%22%5BJournal%5D)">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li>
<li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

גורמים שונים יכולים להשפיע על התא של חיידקים הרכבה הדמיה באמצעות AFM. ג&#39;לטין המשמש לציפוי מיקה חשוב. מסחרי ג&#39;לטין מבודד ממספר חוליות כולל דגים, פרות וחזירים. שניהם מקורם ואת שיטת עיבוד לקבוע התאמתו של ג&#39;לטין עבור immobilization חיידקי. מקורות רבים וסוגי ג&#39;לטין הוערכו על יעילותם חיידקים משתק [1]. שני gelatins היעיל ביותר נמצאו Sigma-G-6144 ו-G-2625. נגזר חזירים (חזירי), gelatins אלה נחשבים בלום בלום נמוך בינוני, בהתאמה. חשוב לבדוק את תאימות בין מצע ג&#39;לטין שטופלו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> לטין </td><td> סיגמא, סנט לואיס, מיזורי </td><td> G6144, G2625 או G2500 </td></tr><tr><td> PicoPlus מיקרוסקופ כוח אטומי </td><td> Agilent Technologies, בטמפה, AZ </td><td></td></tr><tr><td> AFM cantilevers </td><td> Veeco, סנטה ברברה, קליפורניה </td><td> MLCT-AUHW </td></tr></tbody></table>

immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM הינה ברזולוציה גבוהה (בסולם ננומטר) כלי הדמיה כי מכנית בדיקות משטח. יש לו את היכולת תאים התמונה ביומולקולות, בסביבה נוזלית, ללא צורך כימית לטפל המדגם. כדי להשיג מטרה זו, המדגם חייב דיו לדבוק פני השטח גובר על מנת למנוע הסרה של כוחות המופעלים על ידי קצה שלוחה סריקה AFM. במקרים רבים, הדמיה מוצלח תלוי immobilization של המדגם על פני השטח גובר. באופן אופטימלי, צריך להיות immobilization פולשנית כדי לדגום את כזה תהליכים מטבוליים ותכונות פונקציונליות אינם בסכנה. עד ביקע טרי ציפוי משטחים מיקה עם חזירי (חזיר) ג&#39;לטין, חיידקים בעלי מטען שלילי יכול להיות משותקת על פני השטח הדמיה בנוזל על ידי AFM. Immobilization של תאים חיידקיים על מיקה ג&#39;לטין מצופה קרוב לוודאי בשל אינטראקציה אלקטרוסטטית בין חיידקים בעלי מטען שלילי ואת הג&#39;לטין מטען חשמלי חיובי. מספר גורמים יכולים להפריע immobilization חיידקים, כולל מרכיבים כימיים של הנוזל שבו חיידקים מושעים, זמן הדגירה של החיידק על ג&#39;לטין מצופה, נציץ תכונות פני השטח של זן חיידקים המדיום שבו הם צילמו את החיידקים. באופן כללי, השימוש מיקה ג&#39;לטין מצופה יימצא החלים בדרך כלל תאים מיקרוביאליים הדמיה.

חיים חיידקים גראם שליליים גראם חיוביים יכולים להיות משותקת על מיקה ג&#39;לטין מצופה הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

AFM (מיקרוסקופיית כוח אטומי) הוא כלי דימוי ברזולוציה גבוהה (בסדר גודל של ננומטרים) הסורק באופן מכני משטח. הוא בעל יכולת לדמות תאים ובומולקולות, בתוך נוזל...

מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) משתמשת בבדיקה מכנית של פני השטח כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה ללא צורך בטיפול כימי בדגימה. בסרטון זה, חיידקים מקובעים על גבי מיקה מצופה ג'לטין ומצולמים בסביבה נוזלית באמצעות AFM. ראשית, נגזרים ריבועי מיקה שמתאימים לפלטפורמה של מיקרוסקופ ה-AFM. השכבה העליונה של המיקה מוסרת וריבועי המיקה מצופים בג'לטין.בשלב הבא, מניחים טיפה של תרחיף חיידקים על המיקה המצופה בג'לטין ופורסים אותה. באמצעות קצה של פפטה, מדגריעים את הדגימות למשך 10 דקות. לאחר מכן, שוטפים את החיידקים שאינם קשורים מהפני השטח.הדגימה מוצבת בתא רטוב עבור A FM ומצולמת כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של חיידקים חיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון נייד של מסנן נקבובי ISO, הוא שניתן לקבע באופן מהימן הן חיידקים בצורת מוט והן חיידקים כדוריתים. כמו כן, אחוז גבוה יותר של פני השטח של התא נגיש ל probe של ה-A FM.יתרון מרכזי של מיקרוסקופיית כוח אטומי על פני סוגי מיקרוסקופיה אחרים הוא היכולת לבצע מחקרים בתאים בודדים, המאפשרים לבחון את מורפולוגיית התא, את היווצרות המחיצה (septum) ואת הציטוקינזה. מי שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, מכיוון שהם נוטים להשתמש בג'לטין שלא הוכח כי הוא מקבע חיידקים, או להשתמש בחיידקים שגודלו במצע גידול מורכב שבו רכיבים מסוימים יתחרו בהידבקות החיידקים לפני השטח של הג'לטין. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה מניסויים משנות ה-70, שבהם קובעו חיידקים.שקופיות זכוכית מצופות ג'לטין לניסויים המשתמשים במיקרוסקופיה של אור ובאוטו-רדיוגרפיה. בהדגמה זו, חיידקים חיים גרם-שליליים מקובעים לצורך דימות FM, אך השיטה ישימה גם עבור חיידקים גרם-חיוביים. כדי להכין את ה-MICA, התחילו בחיתוך שלו במספריים כדי שיתאים לבמה של מיקרוסקופ ה-A FM ויכיל את תא הרטוב של ה-A FM.בשלב הבא, הצמידו סרט דביק למשטח ה-MICA והסירו אותו כדי לקלף את השכבה החיצונית של ה-MICA מהחלק שנגזר. המשיכו להסיר את השכבה החיצונית משני הצדדים עד שיישארו רק שכבות חלקות ושלמות. כדי להכין את תמיסת הג'לטין, הוסיפו 100 milliliters של מים מזוקקים לבקבוק מעבדה וחממו אותם במיקרוגל.כאשר המים מתחילים לרתוח, הוצאו אותם מהמיקרוגל, הוסיפו 0.5 grams של ג'לטין ונערה בעדינות את הבקבוק עד להמסה מלאה של הג'לטין. שימו לב שג'לטין בקר אינו יעיל עבור פרוצדורה זו. מומלץ להשתמש בג'לטין חזיר.הניחו את הבקבוק על משטח העבודה והמתינו שיתקרר ל-60 עד 70 °C. לאחר מכן, שפכו כמות מספיקה של תמיסת הג'לטין לכלי חמד (beaker) קטן, כדי להבטיח שניתן יהיה לשקוע את ה-MICA באופן מלא באמצעות פינצטה. שקעו ריבוע MICA לתוך תמיסת הג'לטין החמה והוציאו אותו במהירות באופן מיידי.הניחו את ה-MICA על דופןה על גבי נייר סופג, כשהיא נשענת על מתקן למבחנות של מיקרו-צנטריפוגה, לייבוש באוויר בטמפרטורת החדר למשך לילה. ניתן להשתמש ב-MICA המצופה בג'לטין למשך שבועיים לפחות. אם ה-MICA המצופה בג'לטין לא תהיה בשימוש למשך מספר שבועות.הניחו זאת על נייר סינון בתוך פטריית בקרה מכוסה ואחסנו בטמפרטורת החדר. ניתן לשמור את תמיסת הג'לטין העודפת בקירור ולהשתמש בה למשך כחודש, פשוט על ידי חימום חוזר של תמיסת המקור לטמפרטורה של בין 60 ל-70 °C. יש להקפיד שהג'לטין לא ירחש במהלך החימום החוזר.לפני קיבוע החיידקים על MICA מצופה ג'לטין, ודאו כי ריכוז החיידקים הולם. השתמשו בספקטרופוטומטר כדי לקבל קריאת צפיפות אופטית (OD) של דגימת החיידקים באורך גל של 600 ננומטר. ערך OD של 0.5 עד 1 הוא האופטימלי.בשלב הבא, העבירו מיליליטר אחד של התרבית למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה וסובבו אותה בצנטריפוגה כדי להשקיע את התאים. השתמשו בפיפט כדי להסיר את הנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן שטפו את המשקע במיליליטר אחד של מים דה-יוניים מסוננים או בתמיסת באפר. בצעו פיפוט עדין מעלה ומטה כדי לסספנד.סובב את המשקע במערך הצנטריפוגה ולאחר מכן השׁהה אותו מיד שוב. השׁהה את המשקע ב-500 µL של מים דה-יוניים nano pure; תרחילי החיידקים צריך להיות עכור באופן נראה כדי להבטיח ריכוז תאים מספיק עבור דימוי FM.אם קיים חשש מהלם אוסמוטי, ניתן להוסיף סוכרוז בריכוז 0.25 מולרי לתמיסת הדימוי. השהיתי את החיידקים הללו במים, אך אל תהססו לנסות נוזלים אחרים. לדוגמה, ביצענו זאת עם 0.25% sucrose, לכן נסו נוזלים אחרים ובדקו אם הם יעבדו באותה מידה.הכינו שתי זכוכיות עבור כל דגימה. בעזרת מיקרופיפט, הוסיפו 10 עד 20 µl של תרחיף תאים למשטח המצופה בג'לטין. לאחר מכן, כדי להבטיח שטח כיסוי נאות עבור דימות FM, השתמשו בקצה מיקרופיפט כדי לפרוס את הטיפה הן בכיוון X והן בכיוון Y.תוך הקפדה שלא לגעת פיזית במשטח הג'לטין עם קצה הפיפטה, הדגרו את הדגימה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו בזרם מים וסננו את עודפי הנוזל מהדגימה על ידי הצמדת קצה הדגימה לנייר סופג או לנייר סינון. ייבשו במהירות את אחת השקופיות באמצעות סילון של גז חנקן.לאחר מכן בצעו בדיקה חזותית של הזריקה. נקודה אטומה מעידה על כך שהחיידקים לא הוסרו בשלב השטיפה. אין לאפשר לזריקה השנייה, ש תשמש כעת לדימוי, להתייבש.הנח אותו על במת הרטיבה של ה-AFM ואבטח אותו באמצעות התפסנים, והוסף מים לבמת הרטיבה בעזרת מיקרופיפט. מומלץ להכין את מיקרוסקופ הכוח האטומי לפני הדימוי בנוזל. ודא שהקנטילבר (cantilever) המיועד לדימוי בנוזל מותקן ב-AFM ומיושר עם הלייזר.המשיכו בדימות באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) תוך שימוש במיקרוסקופ pico plus, המצויד בראש סריקה של 100 micron ובגששים של סיליקון ניטריד מסוג vico עם קבועי קפיץ נומינליים בטווח של 0.01 עד 0.1 nano newton per nanometer. לאחר הכנת המיקרוסקופ, הכניסו את סורק ה-FM ואת הבמה לתוך המיקרוסקופ. בדרך כלל, אנו מתחילים במהירות דימות של 0.5 lines per second ועד ל-one line per second, והרזולוציה נקבעת מ-128 data points per line ועד 512.הגדירו את המכשיר לאסוף תמונות באמצעות 128 עד 512 פיקסלים לשורה. סרקו במהירות סריקה של 0.5 עד שורה אחת לשנייה. לאחר מכן, במידת הצורך, כווננו את נקודת הset point והגברים (gains) ב-A FM כדי להשיג תמונות אופטימליות.לבסוף, אספו את התמונות. חיידקי E coli הונחו על MICA מצופה ג'לטין כפי שמתואר בסרטון זה, ולאחר מכן צולמו ב-0.005 molar PVS. השתמשו בשיטה זו.השביטים (Scepters) נראים בבירור בתמונה שנאספה ופני התאים חלקים, ללא סימנים של התייבשות. להשוואה, תמונות שצולמו של אותם חיידקי e coli באוויר, כפי שמוצג כאן, מראות לעיתים קרובות מבנים שאינם נראים בנוזל. במקרה זה, התאים מראים מראה דמוי טבעת עקב התייבשות, וניתן לראות שלוחות בקטריאליות כגון FIA.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הכנת דגימות חיידקים עבור דימוי FM בסביבה נוזלית. ברגע שהטכניקה תישלט, ניתן לבצעה בערך בשעה אחת, בתנאי שמיקרו-משטחים מצופים ג'לטין הוכנו מראש. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבחור את הג'לטין הנכון ולהגיע לריכוז מתאים של חיידקים בעקבות ביצוע הפרוצדורה.ניתן לבצע מדידות נוספות, כגון שימוש בקנטילבר של FN ככלי לחשיפת כוחות כדי לשמור על מדידות כוח על פני שטח של חיידקים. כמו כן, ניתן לקשור מולקולות גשש ספציפיות לקצה ה-A FM כדי לאפשר אינטראקציה עם מטרות ספציפיות על פני השטח של החיידק, לצורך זיהוי ומדידה של כוחות האינטראקציה. באופן כללי, אם אתם עובדים עם חיידקים פתוגניים, זכרו כי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת העבודה בשיטה זו.

bacterial-immobilization-for-imaging-by-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כוח הקשה במצב מיקרוסקופ אטומי (AFM) שיטת הדמיה של פלסמיד דנ"א, חלבונים cytoplasmic, ו-DNA-חלבון מתחמי מתואר. השיטה כוללת גישות חלופיות להכנת דגימות הדמיה AFM בעקבות מניפולציה ביוכימית. ה-DNA המכיל אזורים ספציפיים אינטראקציה חלבון שנצפה כמעט פיזיולוגי התנאים חיץ.

ויזואליזציה של דנ&quot;א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

אנו מציגים פרוטוקול לפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התלויה מנופים עם תא T יחיד וחלקיק חרוז למחקרים אימונולוגיים. הליכים לחקור בודד זוג תא תא דנדריטי כריכה על ידי AFM ולפקח על התגובה התאית בזמן אמת של מקרופאגים לחלקיק אחיד אחד על ידי AFM עם הדמיה פלואורסצנטית מוצגים.

הפונקציונליזציה של מיקרוסקופ כוח אטומי מנופים עם תאים חד-טי או חלקיק יחיד לספקטרוסקופיית של כוח בודד אימונולוגיים

פרוטוקול זה נועד להפוך מדידות AFM לאוטומטיות על מאות תאים מיקרוביאליים. ראשית, מיקרואורגניזמים משותקים למיקרו-מבנים של חותמות PDMS ולאחר מכן מאלצים מדידות ספקטרוסקופיה להתבצע באופן אוטומטי על מאות תאים משותקים.

אוטומציה של מדידות מיקרוסקופ כוח ביו-אטומי על מאות תאי C. אלביקנס

ספקטרוסקופיית מיקרוסקופיה-אינפרא אדום של הכוח האטומי (AFM-IR) מספקת פלטפורמה רבת עוצמה למחקרים חיידקיים, המאפשרת להשיג רזולוציה ננומטרית. שניהם, מיפוי של שינויים תת-תאיים (למשל, על חלוקת תאים) כמו גם מחקרים השוואתיים של הרכב כימי (למשל, הנובעים עמידות לתרופות) יכולים להתבצע ברמת תא אחד בחיידקים.

מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם ספקטרוסקופיית אינפרא אדום ככלי לחקירת כימיה של חיידק יחיד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

מחקר זה מציג פרוטוקול חדש להפעלת כוח מכני ישירות על גרעין התא באמצעות מיקרובים מגנטיים המועברים לתוך הציטופלסמה ולביצוע הדמיה פלואורסצנטית בו-זמנית של תאים חיים.

שילוב של מפעיל כוח מגנטי תלת-ממדי והדמיה פלואורסצנטית רב-תפקודית לחקר גרעין המכנוביולוגיה

כאן אנו מציגים את היישום של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כשיטה פשוטה ומהירה לאפיון חיידקים ומנתחים פרטים כגון גודל וצורת החיידקים, ביופילמים של תרבית חיידקים ופעילות ננו-חלקיקים כקוטלי חיידקים.

מצב מגע מיקרוסקופ כוח אטומי כטכניקה מהירה לתצפית מורפולוגית וניתוח נזק לתאי חיידקים

אנו מציגים שיטה פשוטה ונגישה להדמיית ציאנובקטריה נימית במישור XY. נעשה שימוש במטריצת אגרוז נקודת התכה נמוכה, המאפשרת רכישת תמונות של חלבונים המעורבים בחלוקה, בכיוון אנכי. לכן, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כל אורגניזם נימה וסוגים שונים של חלבונים.

שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופ בהילוך מהיר בכחוליות נימה

למדו שיטה להדמיית חיידקים חיים באמצעות מיקרוסקופית כוח אטומי בסביבה נוזלית. השיטה משתמשת במיקה מצופה ג'לטין לקיבוע החיידקים ומאפשרת תמונות ברזולוציה גבוהה ללא טיפול כימי.

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

גלה סרטונים נוספים