Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי
10 באוגוסט 2011
חיים חיידקים גראם שליליים גראם חיוביים יכולים להיות משותקת על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).
מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) משתמשת בבדיקה מכנית של פני השטח כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה ללא צורך בטיפול כימי בדגימה. בסרטון זה, חיידקים מקובעים על גבי מיקה מצופה ג'לטין ומצולמים בסביבה נוזלית באמצעות AFM. ראשית, נגזרים ריבועי מיקה שמתאימים לפלטפורמה של מיקרוסקופ ה-AFM. השכבה העליונה של המיקה מוסרת וריבועי המיקה מצופים בג'לטין.
בשלב הבא, מניחים טיפה של תרחיף חיידקים על המיקה המצופה בג'לטין ופורסים אותה. באמצעות קצה של פפטה, מדגריעים את הדגימות למשך 10 דקות. לאחר מכן, שוטפים את החיידקים שאינם קשורים מהפני השטח.
הדגימה מוצבת בתא רטוב עבור A FM ומצולמת כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של חיידקים חיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון נייד של מסנן נקבובי ISO, הוא שניתן לקבע באופן מהימן הן חיידקים בצורת מוט והן חיידקים כדוריתים. כמו כן, אחוז גבוה יותר של פני השטח של התא נגיש ל probe של ה-A FM.
יתרון מרכזי של מיקרוסקופיית כוח אטומי על פני סוגי מיקרוסקופיה אחרים הוא היכולת לבצע מחקרים בתאים בודדים, המאפשרים לבחון את מורפולוגיית התא, את היווצרות המחיצה (septum) ואת הציטוקינזה. מי שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, מכיוון שהם נוטים להשתמש בג'לטין שלא הוכח כי הוא מקבע חיידקים, או להשתמש בחיידקים שגודלו במצע גידול מורכב שבו רכיבים מסוימים יתחרו בהידבקות החיידקים לפני השטח של הג'לטין. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה מניסויים משנות ה-70, שבהם קובעו חיידקים.
שקופיות זכוכית מצופות ג'לטין לניסויים המשתמשים במיקרוסקופיה של אור ובאוטו-רדיוגרפיה. בהדגמה זו, חיידקים חיים גרם-שליליים מקובעים לצורך דימות FM, אך השיטה ישימה גם עבור חיידקים גרם-חיוביים. כדי להכין את ה-MICA, התחילו בחיתוך שלו במספריים כדי שיתאים לבמה של מיקרוסקופ ה-A FM ויכיל את תא הרטוב של ה-A FM.
בשלב הבא, הצמידו סרט דביק למשטח ה-MICA והסירו אותו כדי לקלף את השכבה החיצונית של ה-MICA מהחלק שנגזר. המשיכו להסיר את השכבה החיצונית משני הצדדים עד שיישארו רק שכבות חלקות ושלמות. כדי להכין את תמיסת הג'לטין, הוסיפו 100 milliliters של מים מזוקקים לבקבוק מעבדה וחממו אותם במיקרוגל.
כאשר המים מתחילים לרתוח, הוצאו אותם מהמיקרוגל, הוסיפו 0.5 grams של ג'לטין ונערה בעדינות את הבקבוק עד להמסה מלאה של הג'לטין. שימו לב שג'לטין בקר אינו יעיל עבור פרוצדורה זו. מומלץ להשתמש בג'לטין חזיר.
הניחו את הבקבוק על משטח העבודה והמתינו שיתקרר ל-60 עד 70 °C. לאחר מכן, שפכו כמות מספיקה של תמיסת הג'לטין לכלי חמד (beaker) קטן, כדי להבטיח שניתן יהיה לשקוע את ה-MICA באופן מלא באמצעות פינצטה. שקעו ריבוע MICA לתוך תמיסת הג'לטין החמה והוציאו אותו במהירות באופן מיידי.
הניחו את ה-MICA על דופןה על גבי נייר סופג, כשהיא נשענת על מתקן למבחנות של מיקרו-צנטריפוגה, לייבוש באוויר בטמפרטורת החדר למשך לילה. ניתן להשתמש ב-MICA המצופה בג'לטין למשך שבועיים לפחות. אם ה-MICA המצופה בג'לטין לא תהיה בשימוש למשך מספר שבועות.
הניחו זאת על נייר סינון בתוך פטריית בקרה מכוסה ואחסנו בטמפרטורת החדר. ניתן לשמור את תמיסת הג'לטין העודפת בקירור ולהשתמש בה למשך כחודש, פשוט על ידי חימום חוזר של תמיסת המקור לטמפרטורה של בין 60 ל-70 °C. יש להקפיד שהג'לטין לא ירחש במהלך החימום החוזר.
לפני קיבוע החיידקים על MICA מצופה ג'לטין, ודאו כי ריכוז החיידקים הולם. השתמשו בספקטרופוטומטר כדי לקבל קריאת צפיפות אופטית (OD) של דגימת החיידקים באורך גל של 600 ננומטר. ערך OD של 0.5 עד 1 הוא האופטימלי.
בשלב הבא, העבירו מיליליטר אחד של התרבית למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה וסובבו אותה בצנטריפוגה כדי להשקיע את התאים. השתמשו בפיפט כדי להסיר את הנוזל העליון (supernatant), ולאחר מכן שטפו את המשקע במיליליטר אחד של מים דה-יוניים מסוננים או בתמיסת באפר. בצעו פיפוט עדין מעלה ומטה כדי לסספנד.
סובב את המשקע במערך הצנטריפוגה ולאחר מכן השׁהה אותו מיד שוב. השׁהה את המשקע ב-500 µL של מים דה-יוניים nano pure; תרחילי החיידקים צריך להיות עכור באופן נראה כדי להבטיח ריכוז תאים מספיק עבור דימוי FM.
אם קיים חשש מהלם אוסמוטי, ניתן להוסיף סוכרוז בריכוז 0.25 מולרי לתמיסת הדימוי. השהיתי את החיידקים הללו במים, אך אל תהססו לנסות נוזלים אחרים. לדוגמה, ביצענו זאת עם 0.25% sucrose, לכן נסו נוזלים אחרים ובדקו אם הם יעבדו באותה מידה.
הכינו שתי זכוכיות עבור כל דגימה. בעזרת מיקרופיפט, הוסיפו 10 עד 20 µl של תרחיף תאים למשטח המצופה בג'לטין. לאחר מכן, כדי להבטיח שטח כיסוי נאות עבור דימות FM, השתמשו בקצה מיקרופיפט כדי לפרוס את הטיפה הן בכיוון X והן בכיוון Y.
תוך הקפדה שלא לגעת פיזית במשטח הג'לטין עם קצה הפיפטה, הדגרו את הדגימה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו בזרם מים וסננו את עודפי הנוזל מהדגימה על ידי הצמדת קצה הדגימה לנייר סופג או לנייר סינון. ייבשו במהירות את אחת השקופיות באמצעות סילון של גז חנקן.
לאחר מכן בצעו בדיקה חזותית של הזריקה. נקודה אטומה מעידה על כך שהחיידקים לא הוסרו בשלב השטיפה. אין לאפשר לזריקה השנייה, ש תשמש כעת לדימוי, להתייבש.
הנח אותו על במת הרטיבה של ה-AFM ואבטח אותו באמצעות התפסנים, והוסף מים לבמת הרטיבה בעזרת מיקרופיפט. מומלץ להכין את מיקרוסקופ הכוח האטומי לפני הדימוי בנוזל. ודא שהקנטילבר (cantilever) המיועד לדימוי בנוזל מותקן ב-AFM ומיושר עם הלייזר.
המשיכו בדימות באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) תוך שימוש במיקרוסקופ pico plus, המצויד בראש סריקה של 100 micron ובגששים של סיליקון ניטריד מסוג vico עם קבועי קפיץ נומינליים בטווח של 0.01 עד 0.1 nano newton per nanometer. לאחר הכנת המיקרוסקופ, הכניסו את סורק ה-FM ואת הבמה לתוך המיקרוסקופ. בדרך כלל, אנו מתחילים במהירות דימות של 0.5 lines per second ועד ל-one line per second, והרזולוציה נקבעת מ-128 data points per line ועד 512.
הגדירו את המכשיר לאסוף תמונות באמצעות 128 עד 512 פיקסלים לשורה. סרקו במהירות סריקה של 0.5 עד שורה אחת לשנייה. לאחר מכן, במידת הצורך, כווננו את נקודת הset point והגברים (gains) ב-A FM כדי להשיג תמונות אופטימליות.
לבסוף, אספו את התמונות. חיידקי E coli הונחו על MICA מצופה ג'לטין כפי שמתואר בסרטון זה, ולאחר מכן צולמו ב-0.005 molar PVS. השתמשו בשיטה זו.
השביטים (Scepters) נראים בבירור בתמונה שנאספה ופני התאים חלקים, ללא סימנים של התייבשות. להשוואה, תמונות שצולמו של אותם חיידקי e coli באוויר, כפי שמוצג כאן, מראות לעיתים קרובות מבנים שאינם נראים בנוזל. במקרה זה, התאים מראים מראה דמוי טבעת עקב התייבשות, וניתן לראות שלוחות בקטריאליות כגון FIA.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הכנת דגימות חיידקים עבור דימוי FM בסביבה נוזלית. ברגע שהטכניקה תישלט, ניתן לבצעה בערך בשעה אחת, בתנאי שמיקרו-משטחים מצופים ג'לטין הוכנו מראש. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבחור את הג'לטין הנכון ולהגיע לריכוז מתאים של חיידקים בעקבות ביצוע הפרוצדורה.
ניתן לבצע מדידות נוספות, כגון שימוש בקנטילבר של FN ככלי לחשיפת כוחות כדי לשמור על מדידות כוח על פני שטח של חיידקים. כמו כן, ניתן לקשור מולקולות גשש ספציפיות לקצה ה-A FM כדי לאפשר אינטראקציה עם מטרות ספציפיות על פני השטח של החיידק, לצורך זיהוי ומדידה של כוחות האינטראקציה. באופן כללי, אם אתם עובדים עם חיידקים פתוגניים, זכרו כי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת העבודה בשיטה זו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את השימוש במיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) לקיבוע ולדימיון של חיידקים חיים, גרם-שליליים וגרם-חיוביים, בסביבה נוזלית. השיטה כוללת ציפוי של מיקה בג'לטין כדי להקל על ההיצמדות של החיידקים ועל הדימוי שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- טכניקות דימוג
- מיקרוסקופיה של כוח אטומי
רקע
- מיקרוסקופיית כוח אטומי (Atomic Force Microscopy) מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של משטחים.
- חקר חיידקים חיים עלול להיות מאתגר בשל תנועתם.
- משטחים מצופים ג'לטין יכולים לשפר את קיבוע החיידקים.
- הדמיה בסביבות נוזליות משמרת את המצב הטבעי של החיידקים.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה לקיבוע חיידקים על פני שטח.
- להמחיש חיידקים באמצעות AFM ללא טיפול כימי.
- לספק פרוטוקול לחוקרים המעוניינים בדימות חיידקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ריבועי מיקה נחתכים ומצופים בג'לטין.
- טיפה של תרחיף חיידקים מיושמת על פני השטח של הג'לטין.
- הדגימות מדגירות כדי לאפשר לחיידקים להיקשר.
- חיידקים שאינם קשורים נשטפים לפני הדימיג'.
תוצאות עיקריות
- חיידקים חיים קובעו בהצלחה על גבי מיקה מצופה ג'לטין.
- תמונות ברזולוציה גבוהה של חיידקים התקבלו באמצעות AFM.
- השיטה מאפשרת דימוי בסביבה נוזלית.
- חיידקים גרם-שליליים וגרם-חיוביים כאחד הודגמו ויזואלית.
מסקנות
- שיטה זו מספקת דרך מהימנה לחקר חיידקים חיים.
- ניתן להשתמש ב-AFM ביעילות עבור דימות של דגימות ביולוגיות.
- ניתן ליישום נוסף במיקרוביולוגיה ובטכניקות דימות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיית כוח אטומי מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של חיידקים חיים בסביבות נוזליות ללא קיבוע כימי, ובכך משמרת את המורפולוגיה הטבעית ואת המצב הפיזיולוגי. יכולת זו תומכת בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת תצפית ישירה על מבני שטח של חיידקים, אירועי חלוקה ודינמיקת ממברנות בתנאים קרובים למצב הטבעי. שיטת הקיבוע באמצעות מיקה מצופה ג'לטין מספקת פלטפורמה הדימיה מיקרוביולוגית הדירותית ובעלת פולשנות מינימלית, המפחיתה ארטיפקטים של הכנת הדגימה ומשפרת את מהימנות הנתונים בתהליכי גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר ויזואליזציה ישירה של מורפולוגיה חיידקית, היווצרות מחיצה (septum) וציטוקינזה, על מנת לבחון היפותזות טיפוליות הנוגעות למטרות בחלוקת התא.
- ערך תפעולי: מספק דימות במופע נוזלי ללא סימון, המונע ארטיפקטים של קיבוע ומשמר תכונות פונקציונליות של חיידקים לצורך הפחתת סיכונים מנגנוניים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מיקה מצופה ג'לטין יוצרת משטח סטנדרטי הניתן לשימוש חוזר עבור קיבוע עקבי של חיידקים לאורך קמפיינים של סריקה.
- ערך תפעולי: תומכת בהכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות בעלות נגישות שטח גבוהה לאינטראקציה עם גשש AFM, מה שמאפשר הערכה מהימנה של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי הדמיה של חיידקים חיים בנוזל, תוך שמירה על שלמות המערכת הרלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס התאמה לסיכון, באמצעות תוצרי קריאה מורפולוגיים וטופולוגיים כמותיים וניתנים לשחזור.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת שלב הכנה סטנדרטי עבור דימיון של חיידקים חיים, ובכך היא תומכת בבדיקת היפותזות ובצמצום סיכונים ביולוגיים לפני שלבי זיהוי המולקולות המובילות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות דימוי ישיר של דינמיקת פני השטח של התא ואירועי חלוקה בנוזל.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקה באמצעות קיבוע בקטריאלי הדיר במצע מיקה מצופה ג'לטין, המבטיח הצגה עקבית של הדגימה לניתוח AFM.
- אנליזה: מייצר מדידות טופוגרפיות ומדידות כוח ברזולוציה גבוהה המאפשרות השוואה בין מצבים בקטריאליים, טיפולים או שינויים גנטיים.
- מחקר תרגומי: שומר על רצף עם עבודות פרה-קליניות על ידי שימור המצב הבקטריאלי הטבעי בנוזל, תוך מניעת ארטיפקטים הנובעים מקיבוע או מהתייבשות.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להכין מצעי מיקה מצופי ג'לטין מראש ולאחסנם למשך עד שבועיים, מה שמאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור מספר פרויקטים וצוותים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות תצפית ישירה, ללא סימון, על המבנה העל-מיקרוסקופי (ultrastructure) של החיידק.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות באמצעות פרוטוקולי קיבוע מוגדרים, מפרטי מקור הג'לטין (חזיר) ובקרות ריכוז (OD 0.5–1.0).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים מורפולוגיים כמותיים המפחיתים סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות למסמנים אנטימיקרוביאליים או אנטיבקטריאליים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון באמצעות פלטי דימוג סטנדרטיים וניתנים להרחבה, המאפשרים השוואה חוצת-תפקודים של מועמדים אנטיבקטריאליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתפעול AFM, דימוי בתא נוזלי וטיפול בחיידקים בתנאים אספטיים.
- תלוי בגישה למערכות AFM בעלות תאי נוזלים, גששים של סיליקון ניטריד ובקרת סביבה עבור מהירות הסריקה והרזולוציה.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת הג'לטין (חזיר, 0.5% במים מזוקקים), הכנת מיקה וריכוז חיידקים (OD 0.5–1.0 ב-600 nm) בין הצוותים השונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור זני חיידקים שונים, רכיבי מצעים ובאפרי דימוי (למשל, הוספת סוכרוז עבור רגישות אוסמוטית).
- מוגבל על ידי הצורך למנוע רתיחה של הג'לטין במהלך ההכנה והפרעות פוטנציאליות מרכיבי מצעים מורכבים המתחרים בהיצמדות החיידקים לג'לטין.
