Name: Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: למדו שיטה להדמיית חיידקים חיים באמצעות מיקרוסקופית כוח אטומי בסביבה נוזלית. השיטה משתמשת במיקה מצופה ג'לטין לקיבוע החיידקים ומאפשרת תמונות ברזולוציה גבוהה ללא טיפול כימי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה ממומן על ידי משרד המחקר הביולוגיים הסביבה, משרד האנרגיה של ארה&quot;ב ועל ידי מענק למימון ממועצת העמים של וירג&#39;יניה לחקר בריאות. Oak Ridge National Laboratory מנוהלת על ידי UT-באטל, LLC, עבור משרד האנרגיה של ארה&quot;ב תחת חוזה מס &#39;DE-AC05-00OR22725.

1. מיכה הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את מיקה (מדעי אלקטרונים מיקרוסקופית) עם מספריים לגודל הדרוש כדי להתאים את מיקרוסקופ AFM (בערך 22 × 30 מ"מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליב מיקה בשני הצדדים, בדרך כלל באמצעות קלטת כדי להסיר את השכבה החיצונית, עד שרק שכבות רצוף וחלק נשארים. </li></ol> 2. הכנת פתרון ג'לטין: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ"ל מים מזוקקים כדי בקבוק מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את הבקבוק במיקרוגל עד שהמים מתחילים לרתוח. (אם במיקרוגל אינו זמין, המים ניתן לחמם בכוס על פלטה חשמלית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את 0.5 גרם של ג'לטין (Sigma-G-6144, G-2625 או G-2500), ולהוסיף למים מזוקקים חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הבקבוק בעדינות עד הג'לטין נמס לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגניב הפתרון ג'לטין על 60-70 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ 15 מ"ל לתוך כוס קטנה (20 מ"ל) שלתוכו מיקה לחתוך ביקע יכול להיות טבול. </li></ol> 3. מיכה ציפוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הריבועים נציץ לתוך הפתרון ג'לטין חימם ולסגת כזה מהר כי מיקה היא מצופה (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי, לתמוך מיקה מיד, על קצה, על מגבת נייר לייבוש באוויר הסביבה (איור 1b). נציץ מצופה ג'לטין יכול לשמש לפחות 2 שבועות. הפתרון ג'לטין עודף יכולים להישמר בקירור בשימוש במשך חודש בערך, פשוט על ידי reheating הפתרון המניות בין 60-70 ° C. יש להקפיד על מנת להבטיח כי ג'לטין אינו מבושל במהלך reheating. </li></ol> 4. הרכבה חיידקים על נציץ מצופה ג'לטין: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה 1 מ"ל של התרבות חיידקים (0.5-1.0 OD ב 600 ננומטר) בשעה RCF 800 עד 4500. בהתאם חיידקים, השתמש RCF המינימום גלולה יהיה התאים ~ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את גלולה בהיקף זהה של מים מסוננים או deionized חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים שוב על ידי צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור מיד ב 500 μL מים deionized חיץ nanopure או. (השעיה חיידקי צריך להיות עכור בעליל כדי שיהיה ריכוז מספקת של תאים עבור הדמיה AFM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את ההשעיה תא (10-20 μL) כדי מיקה ג'לטין מצופה ולהתפשט על פני השטח באמצעות קצה פיפטה (איור 1 ג'). יש להקפיד לא לגעת פיזית את פני השטח ג'לטין עם קצה פיפטה תוך יישום או להפיץ את פתרון חיידקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר המשטח לנוח למשך 10 דקות ולשטוף עם זרם מים או חיץ (איור 1 cd). לאורך כל ההליך, דואגים להבטיח כי המדגם אינו רשאי יבש. </li></ol> 5. נציג תוצאות: תרשים 2 מציג תמונות דוגמה תאים חיידקיים כי כבר רכוב על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה על ידי AFM. במעבדות שלנו, דגימות הם צילמו בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי PicoPlus (Agilent Technologies, בית המקדש, AZ) לבוש עם ראש מיקרומטר 100 סריקה. המכשיר מופעל על 128-512 פיקסלים לכל לסרוק קו במהירות סריקה של 0.5-1.0 קווי / s. Cantilevers המשמשים בדרך כלל הם Veeco בדיקות סיליקון ניטריד (MLCT-AUHW, Veeco, סנטה ברברה, קליפורניה) עם קבועי קפיץ הנומינלי החל 0.01-0.1 NN / ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. לטין בטמפרטורה של 60-70 מעלות צלזיוס ממוקם כוס 20 מ"ל. בעזרת פינצטה טרי ביקע ריבועים מיקה שקועים לגמרי לתוך הג'לטין (א) מכונס העמידו על מגבת נייר נשען על מדף צנטריפוגות מיקרו (ב). אגל של המדגם חיידקי מושם על מיקה ושל התפשטות עם טיפ pipet הן X ו Y כיוונים (ג). לאחר המאפשר המדגם כדי לדגור על פני השטח מיקה לפחות 10 דקות, לשטוף את המדגם בזרם של מים מזוקקים. אם immobilization עבדו תוכל לראות את המקום אטום על מיקה כפי שמוצג בלוח השמאלי של (ד). אם immobilization לא לעבוד תקבלו חתיכת ברורה של מיקה כמו בלוח השמאלי. הנקודה אטום על המאזניים מיקה ריכוז של חיידקים בתוך אגל לך מקום על מיקה התייחסו ג'לטין. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור AFM תמונות של א coli. בלוח (א), התאים הם רכובים על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה ב 0.005 M-PBS. לשם השוואה, דימוי של תאים חיידקיים רכוב על מיקה ג'לטין מצופה הדמיה באוויר מוצג בלוח (ב). למרות septa הם בבירור בתמונה שנאספו נוזלי, ברזולוציה גדולה יותר, כפי שצוין על ידי נוכחות של פילי (פאנל הבלעה (ב)), ניתן להשיג באוויר.

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
<li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li>
<li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li>
<li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+%28Muller%29+cells%3A+sensing+and+responding+to+tissue+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li>
<li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair%3A+Surgical+Applications%2C+State+of+the+Art%2C+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
<li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons%3A+continuous+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+patterns%3A+The+mechanics+of+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%2C+Third+Growth+Symposium%22%5BJournal%5D)">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li>
<li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

גורמים שונים יכולים להשפיע על התא של חיידקים הרכבה הדמיה באמצעות AFM. ג&#39;לטין המשמש לציפוי מיקה חשוב. מסחרי ג&#39;לטין מבודד ממספר חוליות כולל דגים, פרות וחזירים. שניהם מקורם ואת שיטת עיבוד לקבוע התאמתו של ג&#39;לטין עבור immobilization חיידקי. מקורות רבים וסוגי ג&#39;לטין הוערכו על יעילותם חיידקים משתק [1]. שני gelatins היעיל ביותר נמצאו Sigma-G-6144 ו-G-2625. נגזר חזירים (חזירי), gelatins אלה נחשבים בלום בלום נמוך בינוני, בהתאמה. חשוב לבדוק את תאימות בין מצע ג&#39;לטין שטופלו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> לטין </td><td> סיגמא, סנט לואיס, מיזורי </td><td> G6144, G2625 או G2500 </td></tr><tr><td> PicoPlus מיקרוסקופ כוח אטומי </td><td> Agilent Technologies, בטמפה, AZ </td><td></td></tr><tr><td> AFM cantilevers </td><td> Veeco, סנטה ברברה, קליפורניה </td><td> MLCT-AUHW </td></tr></tbody></table>

immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM הינה ברזולוציה גבוהה (בסולם ננומטר) כלי הדמיה כי מכנית בדיקות משטח. יש לו את היכולת תאים התמונה ביומולקולות, בסביבה נוזלית, ללא צורך כימית לטפל המדגם. כדי להשיג מטרה זו, המדגם חייב דיו לדבוק פני השטח גובר על מנת למנוע הסרה של כוחות המופעלים על ידי קצה שלוחה סריקה AFM. במקרים רבים, הדמיה מוצלח תלוי immobilization של המדגם על פני השטח גובר. באופן אופטימלי, צריך להיות immobilization פולשנית כדי לדגום את כזה תהליכים מטבוליים ותכונות פונקציונליות אינם בסכנה. עד ביקע טרי ציפוי משטחים מיקה עם חזירי (חזיר) ג&#39;לטין, חיידקים בעלי מטען שלילי יכול להיות משותקת על פני השטח הדמיה בנוזל על ידי AFM. Immobilization של תאים חיידקיים על מיקה ג&#39;לטין מצופה קרוב לוודאי בשל אינטראקציה אלקטרוסטטית בין חיידקים בעלי מטען שלילי ואת הג&#39;לטין מטען חשמלי חיובי. מספר גורמים יכולים להפריע immobilization חיידקים, כולל מרכיבים כימיים של הנוזל שבו חיידקים מושעים, זמן הדגירה של החיידק על ג&#39;לטין מצופה, נציץ תכונות פני השטח של זן חיידקים המדיום שבו הם צילמו את החיידקים. באופן כללי, השימוש מיקה ג&#39;לטין מצופה יימצא החלים בדרך כלל תאים מיקרוביאליים הדמיה.

חיים חיידקים גראם שליליים גראם חיוביים יכולים להיות משותקת על מיקה ג&#39;לטין מצופה הדמיה בנוזל באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM).

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

AFM (מיקרוסקופיית כוח אטומי) הוא כלי דימוי ברזולוציה גבוהה (בסדר גודל של ננומטרים) הסורק באופן מכני משטח. הוא בעל יכולת לדמות תאים ובומולקולות, בתוך נוזל...

מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) משתמשת בבדיקה מכנית של פני השטח כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה ללא צורך בטיפול כימי בדגימה. בסרטון זה, חיידקים מקובעים על גבי מיקה מצופה ג'לטין ומצולמים בסביבה נוזלית באמצעות AFM. ראשית, נגזרים ריבועי מיקה שמתאימים לפלטפורמה של מיקרוסקופ ה-AFM. השכבה העליונה של המיקה מוסרת וריבועי המיקה מצופים בג'לטין.בשלב הבא, מניחים טיפה של תרחיף חיידקים על המיקה המצופה בג'לטין ופורסים אותה. באמצעות קצה של פפטה, מדגריעים את הדגימות למשך 10 דקות. לאחר מכן, שוטפים את החיידקים שאינם קשורים מהפני השטח.הדגימה מוצבת בתא רטוב עבור A FM ומצולמת כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של חיידקים חיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון נייד של מסנן נקבובי ISO, הוא שניתן לקבע באופן מהימן הן חיידקים בצורת מוט והן חיידקים כדוריתים. כמו כן, אחוז גבוה יותר של פני השטח של התא נגיש ל probe של ה-A FM.יתרון מרכזי של מיקרוסקופיית כוח אטומי על פני סוגי מיקרוסקופיה אחרים הוא היכולת לבצע מחקרים בתאים בודדים, המאפשרים לבחון את מורפולוגיית התא, את היווצרות המחיצה (septum) ואת הציטוקינזה. מי שאינם מנוסים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, מכיוון שהם נוטים להשתמש בג'לטין שלא הוכח כי הוא מקבע חיידקים, או להשתמש בחיידקים שגודלו במצע גידול מורכב שבו רכיבים מסוימים יתחרו בהידבקות החיידקים

bacterial-immobilization-for-imaging-by-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כוח הקשה במצב מיקרוסקופ אטומי (AFM) שיטת הדמיה של פלסמיד דנ"א, חלבונים cytoplasmic, ו-DNA-חלבון מתחמי מתואר. השיטה כוללת גישות חלופיות להכנת דגימות הדמיה AFM בעקבות מניפולציה ביוכימית. ה-DNA המכיל אזורים ספציפיים אינטראקציה חלבון שנצפה כמעט פיזיולוגי התנאים חיץ.

ויזואליזציה של דנ&quot;א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

אנו מתארים רזולוצית סופר שיטת הדמיה כדי לבחון את המבנה הארגוני של FtsZ טבעת החיידקים, מנגנון חיוני לחלוקת תא. שיטה זו מבוססת על ניתוחים כמותיים של מיקרוסקופיה תמונות לוקליזציה photoactivated (PALM) ויכולה להיות מיושמת על חלבוני cytoskeletal חיידקים אחרים.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

משטח פונקציונלי-הנייח של גנים באמצעות גדיל שקודמים הזחה ליתוגרפיה

פרוטוקול זה נועד להפוך מדידות AFM לאוטומטיות על מאות תאים מיקרוביאליים. ראשית, מיקרואורגניזמים משותקים למיקרו-מבנים של חותמות PDMS ולאחר מכן מאלצים מדידות ספקטרוסקופיה להתבצע באופן אוטומטי על מאות תאים משותקים.

אוטומציה של מדידות מיקרוסקופ כוח ביו-אטומי על מאות תאי C. אלביקנס

פרוטוקול הדמיה זה של תאים חיידקיים חיים מאפשר הדמיה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים מרובים ברמת תא יחיד לאורך זמן. הדמיה של זמן-לשגות מאפשרת להתבוננות של כל מין חיידקי במונוקולטורה או coculture לחקור אינטראקציות בין מינים בקהילות חיידקים מרובי מינים, כולל תנוענות תאים בודדים וכדאיות.

הדמיה קינטית של אינטראקציות חיידקים בין-מינים חד-תאיים

ספקטרוסקופיית מיקרוסקופיה-אינפרא אדום של הכוח האטומי (AFM-IR) מספקת פלטפורמה רבת עוצמה למחקרים חיידקיים, המאפשרת להשיג רזולוציה ננומטרית. שניהם, מיפוי של שינויים תת-תאיים (למשל, על חלוקת תאים) כמו גם מחקרים השוואתיים של הרכב כימי (למשל, הנובעים עמידות לתרופות) יכולים להתבצע ברמת תא אחד בחיידקים.

מיקרוסקופיה של כוח אטומי בשילוב עם ספקטרוסקופיית אינפרא אדום ככלי לחקירת כימיה של חיידק יחיד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

כאן אנו מציגים את היישום של מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כשיטה פשוטה ומהירה לאפיון חיידקים ומנתחים פרטים כגון גודל וצורת החיידקים, ביופילמים של תרבית חיידקים ופעילות ננו-חלקיקים כקוטלי חיידקים.

מצב מגע מיקרוסקופ כוח אטומי כטכניקה מהירה לתצפית מורפולוגית וניתוח נזק לתאי חיידקים

אנו מציגים שיטה פשוטה ונגישה להדמיית ציאנובקטריה נימית במישור XY. נעשה שימוש במטריצת אגרוז נקודת התכה נמוכה, המאפשרת רכישת תמונות של חלבונים המעורבים בחלוקה, בכיוון אנכי. לכן, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על כל אורגניזם נימה וסוגים שונים של חלבונים.

שיטת אימוביליזציה אנכית לניתוח מיקרוסקופ בהילוך מהיר בכחוליות נימה

למדו שיטה להדמיית חיידקים חיים באמצעות מיקרוסקופית כוח אטומי בסביבה נוזלית. השיטה משתמשת במיקה מצופה ג'לטין לקיבוע החיידקים ומאפשרת תמונות ברזולוציה גבוהה ללא טיפול כימי.

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

גלה סרטונים נוספים