Name: איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: למד שיטה לאיתור זיהומים ויראליים ביתושים שנאספו מהשטח באמצעות תרבית תאי Vero. השיטה מאפשרת זיהוי מגוון רחב של נגיפים ותומכת במחקר אנטומולוגי רפואי ובהבנת אקולוגיית הנגיפים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו בתודה להכיר תרומות חשובות של בני הזוג. ג&#39;ון אנדרסון, אנדרו ראשי ושירלי Tirrell למחקר זה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (U50/CCU116806-01-1) לבין משרד החקלאות האמריקני (58-6615-1-218, CONH00768 ו CONH00773).

1. יתוש מיון וזיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנהלים הבאים מבוצעים על הספסל מעבדה פתוח ייעודי biosafety רמה-2 מעבדה (BSL-2) על ידי צוות אשר מאומנים לעבוד עם יתושים לחיות. &quot;קר שרשרת&quot; נשמר לאורך כל ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי לחיות יתושים בוגרים ידי הנחת שקית איסוף יתוש למקפיא -20 מעלות במשך 5 דקות. אוסף העברת התיק מיכל מבודד המכיל קרח יבש. סגור את המכסה ולחשוף יתושים פחמן דו חמצני במשך 1-3 דקות על מנת להבטיח להשלים עקום למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש יתושים הרדים על מחבת מראש צונן שהונח על מצע של קרח יבש. הפרד יתושים נקבה בודדים באמצעות מלקחיים בסדר מקום כוסות פלסטיק חלק. מכסים עם מכסה כוסות ומניחים על קרח רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי יתושים למינים באמצעות מפתחות טקסונומיות תיאורי מבוסס על מורפולוגיה יתוש חיצוני בעזרת מיקרוסקופ לנתח סטריאו (10-60x זום) רכוב על שולחן צמרמורת אלקטרוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים מינים שזוהו יתוש לתוך בריכות של ≤ 50 אנשים ב 2 Snap-כובע צלוחיות מ&quot;ל המכיל BB נחושת. בקבוקונים מסומנים עם מזהה ייחודי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זיהוי של יתושים כל, צלוחיות ממוקמים שקיות שכותרתו שנערך צידנית קלקר המכילים קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות בריכות יתושים בתוך מקפיא -80 מעלות צלזיוס עד לבדיקת וירוס. </li></ol> 2. Biosafety שיקולים לבודד את הנגיף ביתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנהלים הבאים מבוצעות במעבדה biosafety רמה-3 (BSL-3) על ידי צוות אשר הוכשרו והוסמכו לעבוד ברמה זו של ההכלה 1. מתקני מעבדה, ציוד, נהלים ושיטות עבודה כפופים לפיקוח מוסדי, המדינה, הפדרלי בדיקה. חפשו את ההכשרה אישור מתאים לפני שתנסה הפרוטוקולים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תלבש את הציוד המתאים מגן אישי (PPE) עבור כל הליך כגון שמלות, כפפות חד פעמיות, מגן פנים, הנשמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את משטחי העבודה עם אלכוהול 70% לפני ואחרי השלמת ההליכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתרביות תאים חומר זיהומיות פוטנציאל מטופלות II מחלקה biosafety הממשלה (BSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכות יתושים הם הומוגני במפעל, מיקסר כי הוא ממוקם בתוך BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenates יתוש הם centrifuged ב microcentrifuge אירוסול צמודים. אם הליך זה לא ניתן לבצע בתוך BSC, המפעיל צריך ללבוש ההנשמה בעת ההפעלה ואחזור דגימות בצנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipets וטיפים pipet שינוע של BSC (biosafety הממשלה) הם טבול באקונומיקה 10% לפני מעוקר. לבזבז כל מעבדה הוא לחטא על ידי מעוקר לפני סילוק. </li></ol> 3. הכנת התאים Vero <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התקשורת למזוג מאחד בקבוק תרבות גדול רקמות (175 ס&quot;מ 2) של תאים Vero ומחוברות (Clone E6) לתוך כוס פסולת המכילה אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים Vero ידי הוספת aliquot 5 מ&quot;ל של PBS ו מערבולת מעל שכבה של תאים לאורך צידי הבקבוק והקפד לכסות ביסודיות monolayer כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג לתוך כוס PBS פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 מ&quot;ל של טריפסין-EDTA ו מערבולת מעל שכבה של תאים והקפד לכסות ביסודיות monolayer כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בקבוק באינקובטור במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נערו בעדינות ואת צפחת מערבולת להסיר תאים מפני השטח לתחתית. התאים צריכה להחליק בקלות; דגירה נוסף 1-5 דקות, אם התאים אינם בקלות להחליק וליפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של מדיה Essential מינימלי (מ), 5% בסרום שור העובר (FBS), באמצעות pipet סרולוגיות ו pipet מעלה ומטה 10-20 פעמים כדי לשבור את גושי התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוספת 15 מ&quot;ל ממ, 5% עבור FBS בהיקף כולל של 22.5 מ&quot;ל ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 40 בתרבית רקמה צלוחיות קטנות (25 ס&quot;מ 2) זקוף שני מתלים (20 צלוחיות / מתלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדפים המכיל צלוחיות בתוך ארון biosafety ולהסיר כמוסות בקבוק, הצבת כמוסות ישירות מול צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 4 מ&quot;ל של מזכרות, FBS 5% לתוך בקבוק כל שימוש pipet סרולוגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 0.5 מ&quot;ל לתוך תאים מושעה בקבוק אחד (~ 01:06 יחס פיצול) החלף כמוסות בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מ&quot;ל של מזכרות ספורט, 5% FBS בחזרה את הבקבוק המקורי רקמות גדולות התרבות המכילה את ההשעיה תא הנותרים (~ 2.5 MLS) ולחזור הבקבוק אל האינקובטור. תרבות אותו בקבוק גדול רקמה ניתן שימוש חוזר עד 5 קטעים ואז בקבוק חדש אמור להיות הגדרת להחליף אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות מקום קטן רקמות צלוחיות בערימות על מגש. מערבולת את המגש על מנת לוודא כי אמצעי התקשורת באופן אחיד מכסה את החלק התחתון של פלקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלוחיות קטנות בחממה ב -37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולגדול לילה ומחוברות עד 80-90%. </li></ol> 4. הכנת בריכות יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור בריכות יתושים קר במהלך הליכי הבדיקה. השתמש טרום מצונניםבמקפיא מתלים מערבל-טחנת קלטות, קר כקרח ריאגנטים, ו צנטריפוגה בקירור בעת עיבוד בריכות יתושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות המקום המכיל יתושים למעמד טרום צונן הקפאה להוסיף 1-1.5 מ&quot;ל PBS-G על צינור אחד של יתושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר מערבל-טחנת קלטות מהמקפיא. מקום 24 צינורות לתוך קלטת כל כך בטוחים הטחנה מערבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize דגימות במשך 4 דקות במהירות של 25 מחזורים / שנייה. הטחנה מערבל מנענע את צינורות במהירות גבוהה BB מתכת בתוך צינור זה משבש את רקמת יתושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 6 דקות בסל&quot;ד 7000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות המקום בחזרה מתלים במקפיא עד מחוסן לתאי Vero. </li></ol> 5. הרכבה של תאים Vero עם homogenates בריכה יתושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אחד לפחות בקבוק תרבות רקמה כל סדרה תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי להבטיח בריאות confluency ותא נאותה; לצפות על כיסוי 80-90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקו עד 20 צלוחיות קטנות בתרבית רקמה במעמד וצפחות ​​תווית עם מספרים ההצטרפות המקביל ממאגר כל יתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר כובעים ביותר למזוג של התקשורת מתרבות צלוחיות רקמה לתוך כוס פסולת. השאירו התקשורת מספיק בקבוק כדי monolayer לחלוטין תא מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 100μL של supernatant ממאגר כל יתוש מעובד לתוך בקבוק רקמות המקביל תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הברג והדק בקבוק כובע תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lay צלוחיות תרבות שטוח על שייקר במשך 5 דקות (בטמפרטורת החדר) בשעה 35-40 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור 20 צלוחיות תרבות רקמות תנוחה זקופה במעמד ומניחים BSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתחה את המיכסה 3 צלוחיות תרבות רקמות בבת אחת, לוותר על 4 התקשורת צמיחה מ&quot;ל לתוך בקבוק אחד באמצעות פיפטה סרולוגיות; להחליף כובעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד שקצה פיפטה לא קשר את הבקבוק תרבות הצוואר או שפתיים. שינוי עצות פיפטה לפי הצורך אם הקשר הוא עשה עם הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתרבית רקמה צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li></ol> 6. הקרנת תאים Vero לצמיחה וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך מחוסן תרבות צלוחיות רקמות סימנים של זיהום ויראלי, השפעה cytopathic (CPE), 3-7 ימים לאחר חיסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לבדוק תרביות תאים עבור CPE ו / או זיהום על ידי הטיית צלוחיות ובחינת המדיה בריכות בתחתית הבקבוק. התקשורת יופיעו מעונן כמו התאים להתדרדר במהלך CPE או בשל הצמיחה של שמרים, פטריות, או זיהום חיידקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון מחדש בתרביות תאים כי התערוכה התקשורת מעונן תחת מיקרוסקופ הפוכה. וירוסים יגרמו התאים להיות מעוותים יהיה להשתחרר מן צלוחיות תרבות. בתרביות תאים עם מזהמים לעין, כגון שמרים, חיידקים אחרים, פטריות או פסולת יתוש כבד, הם שוב נבדק על ידי העברת בריכה יתוש המקורי דרך פילטר מזרק 0.22μM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, לוותר על 1-2 MLS של מדיה וירוס חיובי בתרביות תאים לתוך cryotubes שכותרתו בעזרת פיפטה סרולוגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות וירוס מאוחסנים ב -80 ° C עד שזוהו באמצעות מבחני אבחון מתאים. </li></ol> 7. הכנה של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממ, 5% FBS. ממיסים 37.6 גרם של אבקת ממ בכרך האחרון של L 4 של dd H 2 0. לוותר על פתרון לתוך 500 מ&quot;ל aliquots בבקבוקים מדיה החיטוי. כאשר יש פתרון מקורר, בסביבה נקייה מחיידקים, להוסיף 26 מ&quot;ל חום מומת בסרום שור עוברית, 5.2 מ&quot;ל-L-גלוטמין, 5.2 anti-biotic/mycotic מ&quot;ל, ו - 10.4 מ&quot;ל סודיום ביקרבונט 7.5% ל כל בקבוק. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS-G. ממיסים 16 גרם NaCl, KCl 0.4 גרם, 2.3 גרם Na 2 HPO 4, 0.4 גרם KH 2 PO 4, ו - 4 מ&quot;ל של פנול אדום 0.5% לתוך 1000 מ&quot;ל dd H 2 0. התאם את ה-pH ל 7.1-7.4 עם 2 N NaOH (במידת הצורך). בכוס נפרדת, חום 600 מ&quot;ל של H 2 0 לרתיחה. הסר מהצלחת חם, מוסיפים 10 גרם ג&#39;לטין, וכן לפזר. הוסף פתרון ג&#39;לטין מומס לפתרון PBS ולהתאים נפח סופי 2 L עם dd H 2 O. לוותר על 100 מ&quot;ל של פתרון לתוך בקבוקים החיטוי. כאשר יש פתרון מקורר, בסביבה נקייה מחיידקים להוסיף 42.8 חום מומת מ&quot;ל ארנב בסרום anti-biotic/mycotic 1.4 מ&quot;ל. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS לשטוף התא. הוסף 10X 50 מ&quot;ל PBS Dulbecco של עד 400 מ&quot;ל dd H 2 O. התאם ל-pH 7.1 עם 2 N NaOH. התאם את נפח סופי 500 מ&quot;ל עם dd H 2 O. פתרון סינון עם יחידת ואקום 0.2uM הסינון. לוותר לתוך 5 מ&quot;ל aliquots 8 בורג מכסה צינורות מ&quot;ל. חנות ב 4 ° C. </li></ol> 8. נציג תוצאות תשעה שונים של וירוסים של 4 משפחות טקסונומיות נמצאו היתושים שנאספו במהלך מעקב רציף ארצית בקונטיקט 1997-2010 (לוח 1). חמישה נגיפים אלה ידועים כגורמים למחלות האדם, פתוגנים הכי חשוב להיות וירוס הנילוס המערבי והמזרחי וירוס דלקת המוח סוסים. הגילויים החדשים כוללים: הבידוד הראשון של WNV מפני יתושים שנאספובצפון אמריקה ב -1999 2, הבידוד הראשון של וירוס פוטוסי בצפון מזרח ארה&quot;ב ב -2000 3, ואת הבידוד הראשון של La Crosse וירוס בניו אינגלנד ב -2005 4. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> וירוס </td><td> משפחה </td><td> לא מבודד </td><td> מספר מקומות </td><td> שנים לא זוהה </td><td> האדם מחלות </td><td> השופטים. </td></tr><tr><td> וירוס הנילוס המערבי </td><td> Flaviviridae </td><td> 1002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> בינוני עד חמור דלקת קרום המוח, קדחת, </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> מזרח סוסים וירוס דלקת קרום המוח </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> דלקת קרום המוח חמור, </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> בהר J וירוס </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> לא ידוע </td><td> 6 </td></tr><tr><td> ג&#39;יימסטאון קניון וירוס </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> קל עד בינוני, חום, דלקת קרום המוח </td><td> 8 </td></tr><tr><td> פוטוסי וירוס </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> לא ידוע </td><td> 3 </td></tr><tr><td> מטמון עמק וירוס </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> מתון עד חמור מחלה, חום, נוירולוגית בשני מקרים מתועדים </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus וירוס </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> לא ידוע </td><td></td></tr><tr><td> La Crosse וירוס </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> בינוני עד דלקת קרום המוח, חמור </td><td> 4 </td></tr><tr><td> פלנדריה וירוס </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> לא ידוע </td><td></td></tr></tbody></table> וירוסים טבלה 1. זוהה שדה שנאספו על ידי יתושים assay תרבות Vero התא. יתושים נאספו במהלך מעקב ארצית בקונטיקט 1997-2010.

<ol><li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChosewood%2C+LC+%22Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories%22">Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories</a>. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).</li>
<li>Anderson, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+West+Nile+virus+from+mosquitoes%2C+crows%2C+and+a+Cooper%27s+hawk+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut.</a> Science. 286, 2331-2333 (1999).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Potosi+virus+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+collected+in+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut.</a> J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+genetic+variant+of+La+Crosse+virus+%28Bunyaviridae%29+isolated+from+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England.</a> Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+West+Nile+virus+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+five+year+analysis+of+mosquito+data+1999-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+isolations+of+eastern+equine+encephalitis+and+highlands+J+viruses+from+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+during+a+1996+epizootic+in+southeastern+Connecticut%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut.</a> J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).</li>
<li>Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eastern+equine+encephalitis+virus+in+mosquitoes+and+their+role+as+bridge+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors.</a> Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).</li>
<li>Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolations+of+Jamestown+Canyon+virus+%28Bunyaviridae%3A+Orthobunyavirus%29+from+field-collected+mosquitoes+%28Diptera%3A+Culicidae%29+in+Connecticut%2C+USA%3A+a+ten-year+analysis%2C+1997-2006%5BTitle%5D)+AND+%22Vector+Borne+Zoonotic+Dis%22%5BJournal%5D)">Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006.</a> Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).</li>
<li>Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaty%2C+BJ+%22Diagnostic+Procedures+for+Viral%2C+Rickettsial%2C+and+Chlamydial+Infections%22">Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections</a>. , American Public Health Association. 189-212 (1995).</li>
<li>Karabatsos, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarabatsos%2C+N+%22International+Catalogue+of+Arboviruses+Including+Certain+Other+Viruses+of+Vertebrates%22">International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates</a>. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).</li>
<li>Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+west+nile+virus+from+human+clinical+specimens%2C+field-collected+mosquitoes%2C+and+avian+samples+by+a+TaqMan+reverse+transcriptase-PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay.</a> J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).</li>
<li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תרבות Vero assay תא משמשת שיטה יעילה יתושים מסך השדה שנאספו עבור מגוון של וירוסים. זאת בניגוד לשיטות מולקולריות שמתמקדים אחד או כמה וירוסים של עניין. יתר על כן, מצאנו כי assay Vero תרבות התא הוא שווה אם לא יותר רגישה RT-PCR 7 ומספק לנו מבודד וירוס המאוחסנים באוסף התייחסות שלנו למחקרים עתידיים. עם זאת, התרבות מערכות התא לא יכול להיות מתאים במקרים רבים. גישה זו כרוך בהוצאות נוספות, הכשרה הנדרשת לצמוח וירוסים במעבדת BSL-3, אך עלויות אלה עשויים להתקזז על ידי אספקה ​​זולה יח...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15240 </td></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט NaHCO 3, Soln 7.5%. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25080 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין 200mm 100x </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> אבקת מדיום חיוני מינימלי (מ) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11700 </td></tr><tr><td> PBS 10X Dulbecco של </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14080 </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15400 </td></tr><tr><td> הארנב בסרום </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16120 </td></tr><tr><td> Vero תאים (Clone E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td></tr><tr><td> צלוחיות קטנות בתרבית רקמה, כובעים פרקו, 25 ס&quot;מ 2 </td><td> פלקון - בקטון דיקינסון </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> גדול בתרבית רקמה צלוחיות, כובעים פרקו, 175 ס&quot;מ 2 </td><td> פלקון - בקטון דיקינסון </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> נחושת מצופה של BB, 4.5 מ&quot;מ </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> מיקסר מיל </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Isopack מתלים במקפיא </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים assay תרבות vero cell

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

יתושים לשדר מספר וירוסים שונים כולל פתוגנים אנושיים חשובים כמו וירוס הנילוס המערבי, וירוס דנגה, וירוס chickungunya. רבים של וירוסים אלה הגבירו בטווחים אנדמיים שלהם התרחבו השטחים החדשים, דבר המחייב מעקב יעיל תוכניות ובקרת להגיב לאיומים אלה. אסטרטגיה אחת כדי לעקוב אחר פעילות נגיף כרוך באיסוף כמויות גדולות של יתושים מאתרים אנדמיים ובדיקה אותם זיהום ויראלי. במאמר זה, אנו מתארים כיצד לטפל, לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור וירוס מדבק ידי assay תא Vero תרבות. יתושים ממוינות לפי מיקום מלכודת מינים, מקובצים בריכות המכילות ≤ 50 אנשים. הם אספו דגימות הומוגני ב מלוחים שנאגרו באמצעות מערבל-הטחנה ואת השלב מימית הוא מחוסן ומחוברות על תרביות תאים Vero (Clone E6). בתרביות תאים מנוטרים להשפעת cytopathic מ 3-7 ימים לאחר חיסון וכל וירוסים מגדלים תרבית תאים מזוהים על ידי מבחני אבחון מתאים. על ידי ניצול גישה זו, יש לנו מבודדים 9 וירוסים שונים היתושים שנאספו בקונטיקט, ארה&quot;ב, ובין אלה, 5 ידועים כגורמים למחלות אנושיות. שלושה וירוסים אלה (וירוס הנילוס המערבי, נגיף פוטוסי, ו La Crosse וירוס) מייצגים רשומות חדשות עבור צפון אמריקה או אזור ניו אינגלנד מאז 1999. היכולת לזהות מגוון רחב של וירוסים הוא קריטי ניטור הן הוקמה ווירוסים המתהווה באוכלוסיית היתושים.

אנו מתארים שיטה לעבד למסך שדה שנאספו יתושים עבור מגוון של וירוסים על ידי assay תא Vero תרבות. על ידי שימוש בטכניקה זו, יש לנו זוהה 9 וירוסים שונים 4 משפחות טקסונומיות ב היתושים שנאספו בקונטיקט.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

יתושים מעבירים מספר נגיפים שונים, כולל פתוגנים אנושיים משמעותיים כגון נגיף הנילו המערבי, נגיף הדנגי ונגיף הצ'יקונגוניה. רבים...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לסרוק נשקים שנאספו מהשדה לאיתור זיהום נגיפי באמצעות בדיקת תרבית תאי Vero. ראשית, הנשקים שנאספו מהשדה ממוינים לפי מינים. לאחר מכן, הנשקים עוברים הומוגניזציה באמצעות Mixer Mill.לאחר הכנת הומוגנאטים של היתושים, מגדלים תאי Vero כהכנה לבדיקה ויראלית; כל תרבית של תאי Vero מוחדרת בהומוגנאט של יתוש בודד, מונחת על שייקר למשך חמש דקות, ולאחר מכן מדגרה בטמפרטורה של 37 °C כדי לאפשר לנגיפים להתרבות. לבסוף, התרביות נבדקות באופן ויזואלי כדי לאתר ראיות לאפקטים ציטופתיים המושרים על ידי נגיפים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון R-T-P-C-R הוא שהיא מאפשרת לסרוק יתושים למגוון רחב של סוכנים ויראליים הגדלים בתרבית תאים.שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האנטומולוגיה הרפואית, כגון התפקידים שממלאים מיני פשפשים שונים בתמיכה בהעברת נגיפים. יש להשתמש במתקן ברמת בטיחות ביולוגית 2 (biosafety level two) עבור הפרוצדורה הבאה. הניחו את שקיות האיסוף המכילות פשפשים חיים בטמפרטורה של 20- °C למשך 15 דקות כדי להרדימם.לאחר הרדמת החרקים, העבירו את השקית למכל מבודד המכיל קרח יבש וחשפו את היתושים לפחמן דו-חמצני למשך דקה עד שלוש דקות כדי להבטיח השבתה מלאה. לאחר מכן, הניחו את היתושים על תבנית שקוללה מראש על מצע של קרח יבש. בעזרת פינצטה בעלת קצה דק, זהו את הנקבות והעבירו אותן לכוסות פלסטיק קטנות.ניתן להבדיל בין נקבות לזכרים על ידי בחינת חלקי הפה והמחושים. אטמו את הכוסות והניחו אותן על קרח רטוב. השתמשו במיקרוסקופ סטריאוסקופי (stereo dissecting microscope) המותקן על שולחן קירור אלקטרוני ובמפתח טקסונומי.זהו את המין של כל נדגרי היתושים. העבירו יתושים מאותו המין למבובות עם מכסה מסוג snap cap בנפח שני מיליליטרים המסומנות ומכילות כדור נחושת. ניתן לאגד עד 50 פרטים במבובת אחת ככל שהן מתמלאות. הניחו את המבובות בשקיות מסומנות על גבי מכל סטירופום עם קרח יבש.לאחר זיהוי כל היתושים, ניתן לאחסנם במינוס 80 degrees Celsius עד לשלב ההומוגניזציה. השתמשו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 3 (biosafety level three) לביצוע הליך זה ועבדו בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית מסוג class two. הוסיפו כ-1 mL של PBSG לכל מבחנה והניחו את המבחנות המכילות את היתושים בתוך קסטה מקוררת מראש של mixer mill.הדק את הקסטה הטעונה בתוך מטחנת ערבול (mixer mill) והומוגניז את מאגרי היתושים למשך ארבע דקות ב-25 מחזורים לשנייה. לאחר הומוגניזציית היתושים, העבר את המבחנות למיקרו-צנטריפוגה מקוררת ואטומה לאيروسול ובצע סבב צנטריפוגה. סבב את הומוגנאט היתושים במהירות של 7,000 RPM למשך שש דקות.לאחר הצנטריפוגציה, ניתן לשמור את המבחנות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לבדיקת הנגיף. שפוך את מצע התרבית מבקבוק T 175 של תאי farrow בצפיפות (confluent) לתוך כלי איסוף פסולת המכיל אקונומיקה. הוסף 5 milliliters של PBS לבקבוק ושטוף את התאים באופן שווה לפני שפיכת ה-PBS לכלי איסוף הפסולת.לאחר שטיפת התאים, הוסיפו 2.5 milliliters של tripsin EDTA והדרימו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך חמש דקות כדי לנתק את התאים. לאחר שהתאים ניתקו, הוסיפו five milliliters של MEM ובצעו פיפוט של התאים למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפרק גושים. לאחר מכן, הוסיפו 15 milliliters נוספים של MEM.הניחו 40 בקבוקי T 25 על שני מעמדים בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית והסירו את מכסי הבקבוקים, תוך הנחתם ישירות מול כל בקבוק. בעזרת פפית סטרילית, העבירו מניה של 4 milliliters של MEM לכל בקבוק. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 milliliters של תרחיף תאי vari וסגרו את הבקבוקים. ערמו את הבקבוקים על מגש וסובבו אותם בעדינות כדי לוודא שהתווך מכסה את תחתית הבקבוקים באופן אחיד.דגרו את התרביות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך לילה או עד שהתאים יגיעו ל-80 עד 90% התמזגות (confluency). הוציאו 20 בקבוקונים קטנים מהמדגור וסמנו אותם במספר הזיהוי המתאים מכל מאגר היתושים. שפכו את רוב המצע מכל בקבוקון אל תוך כלי הפסולת, והשאירו כמות מצע קטנה בלבד שתכסה את השכבה העליונה של התאים.העבירו 100 µL של תגליות (supernatant) מכל הומוגנאט של יתוש לבקבוק המסומן בהתאם ואטמו את הבקבוקים היטב. לאחר העברת התגליות, הניחו את הבקבוקים על מנער המוגדר ל-35 עד 40 RRP M למשך חמש דקות. החזירו את הבקבוקים לקבפינה הביולוגית והוסיפו ארבעה מיליליטרים של מצע גידול לכל אחד מהם.סגרו את הבקבוקים והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך שלושה עד שבעה ימים. כאשר התרביות מוכנות לסריקה, בצעו תחילה בדיקה חזותית של המצע. מצע עכור מעיד על אפקטים ציטופתיים מושרי-נגיף, זיהום במיקרובים אחרים, או שניהם; בחנו את התרביות המראות מצע עכור תחת מיקרוסקופ אור הפוך.וירוסים גורמים בדרך כלל לתאים להפוך למעוותים ולהיפרד מבקבוקי התרבית. אם מזוהם זיהום של חיידקים, שמרים או פטריות, או אם התרבית מכילה שאריות רבות של יתושים, יש לבחון מחדש את מאגר היתושים המקורי לאחר סינונו דרך מזרק עם פילטר של 0.22 micron. יש להעביר בצורה אספטית לאחר סינון נפח של 1 עד 2 מיליליטר של מדיה מתרביות חיוביות לווירוס שאינן מזוהמות במיקרואורגניזמים אחרים לתוך מבחנות קריו (cryo tubes) מסומנות.יש לאחסן את הדגימות המכילות את הווירוס בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לזיהוי, תוך שימוש בבדיקות האבחנתיות המתאימות באמצעות פרוטוקול זה. תשעה סוגים שונים של וירוסים מארבע משפחות טקסונומיות הופקו מיתושים שנאספו בקונטיקט במהלך תקופת ניטור רציפה בכל המדינה משנת 1997 עד 2010. חלק מוירוסים אלו, כולל Eastern equine encephalitis virus ו-West Nile Virus, ידועים כגורמים למחלות בבני אדם.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן המיון, העיבוד והסינון של יתושים לזיהום נגיפי באמצעות בדיקת תרבית תאים נגיפית.

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטות באמצעות מערכות alphavirus transducing להביע כתבים פלורסנט במבחנה יתושים בוגרים מתוארים. טכניקה זו עשויה להיות מותאם כדי להביע כל חלבון של עניין במקום או בנוסף לכתב.

מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת שיפור תלוי נוגדנים (ADE) של זיהום בנגיף דנגי באמצעות סרום החלמה של נגיף זיקה. הבדיקה משתמשת בחלקיקים נגיפיים של כתב דנגי (RVPs) המקודדים חלבון פלואורסצנטי ירוק. נוגדנים בסרום נגד נגיף הזיקה מגיבים בהצלבה עם RVPs ליצירת קומפלקס. הנוגדנים הקשורים מגבירים את ספיגת RVP על ידי תאים המבטאים את קולטן Fc, אשר מזוהה באמצעות ציטומטריית זרימה.

בדיקה חוץ גופית לבחינת שיפור תלוי נוגדנים של זיהום ויראלי

Zika Virus (ZIKV), פתוגן מתפתח, קשור להפרעות התפתחותיות בעובר ולמיקרוצפליה. הקמת מערכת תרבית תאים זיהומית יעילה היא חיונית למחקרים על שכפול ZIKV כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות. במחקר זה מומחשות ונדונות בדיקות וירולוגיות שונות הנוגעות לזיק"ו.

מערכת תרבית תאי זיהומיות וירוס זיקה ואת<em&gt; במבחנה</em&gt; אפקט מניעתי של אינטרפרונים

זרם מרובב אבחון לאיתור Zika chikungunya, וירוסים דנגה לדרוש הכנת הדוגמא מורכבים ומכשור יקרים, קשה להשתמש בסביבות משאבים נמוכה. אנו מראים אבחון המשתמשת הגברה איזותרמי עם הגששים טרומי לחלוקה ניידים במטרה סטרנד ויוכל להבדיל וירוסים אלה עם רגישות גבוהה.

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

הפרוטוקול המוצג יכול לקבוע את היכולת הווקטורית של אוכלוסיות יתושים Aedes aegypti עבור וירוס נתון, כגון זיקה, במסגרת בלימה.

וקטור יכולת ניתוחים על יתושים Aedes aegypti באמצעות וירוס זיקה

פרוטוקול זה מתאר בדיקת אימונוסורבנט המקושרת לאנזים סנדוויץ' כדי לזהות ספורוזואיטים של בלוטת הרוק ביתושים. באמצעות נוגדנים חד-שבטיים הזמינים בקלות, השיטה מאפשרת זיהוי חסכוני ובתפוקה גבוהה של יתושים הנושאים פלסמודיום פלציפרום או פלסמודיום ויוואקס. השיטה מתאימה לחקר העברת מלריה, כולל סקרים וקטוריים.

איתור פלסמודיום ספורוזואיטים ביתושי אנופלס באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים

מתודולוגיה זו, שכללה הזנה דרך הפה וזיהום בהזרקה תוך חזה, יכולה להעריך ביעילות את ההשפעה של מחסומי המעי התיכון ו / או בלוטת הרוק על זיהום arbovirus.

זיהום ויראלי ניסיוני ביתושים בוגרים על ידי האכלה אוראלית ומיקרו-הזרקה

רצפים חדשים רבים דמויי וירוסים נמצאו ביתושים בשל השימוש הנרחב בטכנולוגיות ריצוף. אנו מספקים הליך יעיל לבידוד והגברה של וירוסים באמצעות קווי תאים של בעלי חוליות ויתושים, אשר עשוי לשמש בסיס למחקרים עתידיים על וירוסים הקשורים ליתושים, כולל וירוסים המועברים על ידי יתושים וספציפיים ליתושים.

בידוד וירוסים הקשורים ליתושים מיתושים שנאספו בשטח

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התפשטות נגיף הזיקה (ZIKV) בתאי כליות של קוף ירוק אפריקאי ורו ואת הכימות של ZIKV באמצעות שיטות זיהוי חיסוני קולורימטרי מבוססות תאים בפורמטים של 24 בארות ו-96 בארות (תפוקה גבוהה).

התפשטות וירוסים וכימות קולורימטרי מבוסס תאים

למד שיטה לאיתור זיהומים ויראליים ביתושים שנאספו מהשטח באמצעות תרבית תאי Vero. השיטה מאפשרת זיהוי מגוון רחב של נגיפים ותומכת במחקר אנטומולוגי רפואי ובהבנת אקולוגיית הנגיפים.

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

גלה סרטונים נוספים